Name: Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda técnicas de marcação proteica em artrópodes para pesquisa de dispersão e migração de insetos. Este método utiliza ELISA para detecção e permite estudos de padrões migratórios em habitats naturais.

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O financiamento foi fornecido pelo USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, em parte, pela Agricultura e Alimentação Research Initiative Competitive Grant não. 2011-67009-30141 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura USDA. Somos gratos pelo apoio técnico de Johanna Nassif. Agradecemos também a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff por fornecer algumas das imagens utilizadas na Figura 3.

1. Mark Interno, retenção e procedimento de detecção <ol><li> Procedimento de marcação interna <ol><li> Coletar insetos de interesse (n ≈ 100 indivíduos) de uma colônia de laboratório criados em dieta artificial ou a partir do campo e dividir em dois recipientes de criação limpas. </li><li> Colocar 20 ml de uma dieta regular de pacotes (tratamento de controlo negativo não marcado) para um dos recipientes. Completar um segundo pacote de 20 ml de dieta artificial com 1,0 ml de uma solução / 1,0 mg ml IgG frango / IgY, misture bem, e colocá-lo em outro recipiente. Nota: Se o inseto de interesse não tem uma dieta artificial, a marca pode ser colocado sobre ou em qualquer dieta que eles são normalmente sustentada em (por exemplo, feijão verde, ovos da traça, água, açúcar, mel). </li><li> Permitir que os insetos para retomar sua atividade alimentar durante 24 h. </li></ol></li><li> Procedimento de retenção de marca Interno <ol><li> Remova os pacotes de dieta de cada recipiente e fornecer os insetos wom outra fonte de alimento para mantê-las ao longo da duração da experiência (por exemplo, feijão verde). </li><li> Recolha uma coorte (n = 20) de insectos por dia (ou em qualquer intervalo de tempo desejado) a partir de cada tratamento e congelar imediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Sanduíche procedimento ELISA <ol><li> Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-galinha IgY anticorpo primário diluído 1: 500 em tampão salino Tris (TBS) a cada poço de uma microplaca de ELISA limpo e incubar durante um mínimo de 1 hora à TA (nota: as microplacas também podem ser incubadas ó / N a 4 ° C). </li><li> Descartar o anticorpo a partir da placa e bloquear cada cavidade com 300 uL de uma solução não gorda de leite seco a 1,0% durante 30 min. </li><li> Enquanto espera para as etapas de incubação anteriores, colocar insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga com 1,0 ml de TBS. </li><li> Moer cada insecto com um pilão limpa até completamente homogeneizada e adicionar 100 ul de cada amostra para um poço individual do ELISAprato. Deixar as amostras a incubar à TA durante 1 h. </li><li> Adicionar 100 ul de negativo (TBS apenas) e positivos (clara de ovo em TBS) a poços de controlo na primeira coluna de cada placa de ELISA. Além disso, adicionar 100 ul de controlos negativos (insectos insectos não marcado) para os 8 poços na última coluna de cada placa (Figura 1). Permitir que as amostras de controlo a incubar à TA durante 1 h. Note-se que o molde fornecido na Figura 1 é o modelo que usamos para os nossos ensaios padronizados. A colocação das amostras nos poços é a critério do investigador. </li><li> Lavar cada poço três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida, adicionar Tween 50 ul de anticorpo de coelho anti-IgG de galinha / IgY conjugado com peroxidase diluído a 1: 10000 em solução de leite a 1% e incubar durante 1 h à TA. </li><li> Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço. </li><li> Após 10 min, ler os poçoscom um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figura 1. Um diagrama esquemático que mostra as designações bem padronizados usados ​​para um típico de 96 cavidades de microplacas ELISA. Cada placa contém 7 poços dedicados a controlos negativos de solução salina tamponada com Tris (TBS), uma bem dedicados a um controlo positivo proteína (Pos Ctrl), 80 poços individuais dedicados a insetos recapturados (Amostra 1 ... 80), e 8 poços dedicados a não marcados (negativos) controles de insetos (Ctrl Neg 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Mark Externo, Retenção, e procedimento de detecção <ol><li> Procedimento de marcação externo <ol><li> Coletar insetos de interesse (n ≈ 100indivíduos) de uma colônia de laboratório ou de campo e local em dois recipientes de plástico 1,0 L com um buraco de diâmetro 2,5 centímetros socou para fora do lado de cada recipiente. </li><li> Pulverizar os insectos no primeiro recipiente com 1,0 ml de dH 2 O (tratamento de controlo negativo), utilizando um nebulizador médico. Pulverizar os insectos no segundo recipiente com 1,0 ml de uma solução 5.0% de clara de ovo de galinha utilizando um nebulizador médico. </li><li> Prenda a mangueira do nebulizador a uma tomada de ar do laboratório padrão e, em seguida, inserir a boca do nebulizador para o 2,5 centímetros buraco do recipiente. Em seguida, ligue a saída de ar gradualmente até o nebulizador produz um vapor. </li><li> Continue a pulverização (marcação) até a solução clara de ovo foi dispensado (aprox. 2-5 min). </li><li> Remover o nebulizador e colocar uma rolha no orifício do recipiente de plástico. Permitir que os insetos para se situar em temperatura ambiente, até a solução secar completamente. </li></ol></li><li> Procedimento de retenção de marca externa<ol><li> Coloque cada tratamento dos insetos secos em um recipiente limpo criação separado para evitar mais exposição para a marca. </li><li> Adicionar água e comida para os recipientes limpos para sustentar os insectos ao longo da duração do estudo. </li><li> Recolha uma coorte (n = 20) de insectos a partir de cada tratamento diariamente e congelar imediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Procedimento ELISA indireto <ol><li> Coloque os insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga e adicionar 1,0 ml de TBS. </li><li> Mergulhe as amostras para 1 hora em um conjunto agitador orbital a 120 rpm. </li><li> Adicionar controlos negativos e positivos, tal como descrito no Passo 1.3.5. </li><li> Após a imersão, pipetar uma aliquota de 100 ul de cada amostra para um dos 80 poços de amostra designado numa nova placa de 96 poços de ELISA tal como mostrado na Figura 1 Permitir que as amostras a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente. (Nota: as microplacas também pode ser incubadas O / N a 4 ° C). </li><li> Lavar os poços três vezes comPBS-Tween e depois adicionar 300 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de albumina de soro bovino (PBS-BSA) a cada poço. </li><li> Após 30 min à TA, lavar duas vezes com PBS-Tween. </li><li> Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-albumina de ovo anticorpo primário diluído 1: 8000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada poço e incubar durante 1 h à TA. </li><li> Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e em seguida adicionar 50 uL de IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluído a 1: 2000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 h à TA. </li><li> Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de substrato TMB a cada poço. </li><li> Após 10 min, ler os poços com um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> Calcular o valor da absorvância média dos insectos 8 de controlo negativo em cada placa de ELISA e, em seguida, calcular o desvio padrão com base nos controlos negativos reunidas from todas as placas de ELISA de um dado estudo 12. </li><li> Adicionar seis vezes o desvio padrão combinado para a média obtida para cada placa de ELISA para se obter um valor limite positivo de ELISA. Qualquer amostra de insectos originando um valor de absorvância igual a ou maior do que este valor é considerado positivo para a presença da marca proteína. </li></ol>

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.

O procedimento de imunomarcação de proteínas artrópode foi descrita pela primeira vez quase um quarto de século atrás 9. Desde então, o procedimento foi adaptado para estudar os padrões de dispersão de uma ampla variedade de artrópodes, usando administrados internamente e externamente de IgG / IgYs. Estas proteínas têm provado marcadores firmes para a grande variedade de espécies de insectos testadas até à data. No entanto, como mencionado acima, a principal limitação para a utilização de IgG / IgYs é que ele...

Acompanhando o movimento de pragas de artrópodes, inimigos naturais (parasitóides e predadores), e polinizadores na natureza é essencial para compreender melhor como para melhorar os serviços ecossistêmicos. O componente-chave para a maioria dos tipos de pesquisa dispersão é ter um método confiável para marcar o artrópode (s) de interesse. Uma variedade de materiais (por exemplo, tintas, corantes, pós coloridos, tags, elementos raros, proteínas) têm sido utilizados para marcar os artrópodes para avaliar sua dinâmica populacional, capacidades de dispersão, alimentando comportamentos, e outras interações ecológicas 1,2. A adequação de um marcador utilizado para qualquer dada pesquisa dispersão será dependente do tipo de estudo a ser conduzido. Há três grandes categorizações para a marcação artrópodes: (1) marca-release-recaptura (MRR), captura de marcação (2), e auto de captura-marcação-(3). Para a pesquisa marca de liberação e recaptura, o investigador normalmente marca os artrópodes coletivamente no laboratóry e libera-los em um ponto central no campo. Os artrópodes são então recapturado em vários intervalos espaciais e temporais, utilizando diferentes dispositivos de captação (por exemplo, rede de varredura, de vácuo, armadilha pegajosa) 3,4,5. Os espécimes recapturados são examinados para a marca específica para distinguir liberado de indivíduos nativos. Para a pesquisa de captura-marcação, o investigador geralmente se aplica a marca diretamente no campo usando equipamento de pulverização (por exemplo, pulverizador costal, lança e bico pulverizador). Os melhores marcadores para pesquisa captura-marcação são baratos e de fácil aplicação para o habitat do artrópode. Para a pesquisa de auto-captura marcação, o investigador geralmente se aplica a marcas de um artrópode bait 6,7 ou 8 ninho entrada. Por sua vez, o artrópode própria marca internamente por devorar a isca marcada ou externamente por &quot;escovar&quot; contra a marca à medida que sai do ninho. Como mencionado acima, muitos tipos de marcadores têm sido nósed para marcar uma variedade de espécies de artrópodes. No entanto, muito poucos são úteis para todos os três destas categorias de investigação de dispersão. O desenvolvimento do processo de imunomarcação de proteínas foi um grande avanço para a marcação de insetos. Imunomarcação de proteínas coloca um rótulo em artrópodes interna ou externamente, que, por sua vez, é detectado através de um ensaio anti-proteína específica imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os primeiros marcadores de proteínas utilizadas foram tais imunoglobulina de coelho (IgG) e IgG de galinha / IgY 9,10. Eles provaram ser muito eficazes para marcas MRR e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Infelizmente, as proteínas IgG / IgY são caros e não são, portanto, prático para a investigação captura-marcação ea maioria dos tipos de pesquisa de auto-captura marcação. Subsequentemente, os testes ELISA de detecção de proteína de segunda geração foram desenvolvidos para proteínas contidas na clara do ovo de galinha (albumina), leite de vaca (caseína) e leite de soja (inibidor de tripsina de proteína). Cada ensaio é altamente sensível, específico, e, maisimportante, utiliza proteínas que são muito menos caros do que as proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas têm se mostrado eficazes para MRR, captura-marcação e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Neste artigo, nós descrevemos e demonstrar como conduzir marca proteína estudos de retenção de laboratório. Tais estudos são a primeira fase da pesquisa necessária para qualquer tipo de estudo de campo de dispersão. Especificamente, é fundamental que os investigadores sabem quanto tempo a marca será mantida nas espécies de artrópodes segmentados antes de embarcar em estudos de dispersão de campo. Aqui, descrevemos e demonstrar como interna e externamente marcar insetos para MRR, captura-marcação e estudos tipo de campo auto-captura marca. Nós, então, demonstrar como detectar a presença das marcas com ELISAs indiretos e de sanduíche.

<table><tbody><tr><td>Recipiente de armazenamento de alimentos (para criação de insetos)</td> <td>Rubbermaid / Tupperware</td><td>Vários tamanhos</td><td>Vários fabricantes e fornecedores. O tecido de malha é colado em uma janela</td></tr><tr><td>Nebulizador de pequeno volume (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Disponível online e em lojas de suprimentos médicos. Outras marcas também funcionarão.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1.6 ml com tampa</td><td>Produtos de Laboratório Continental</td><td>4445.X</td><td>Qualquer tipo semelhante funcionará. Preferimos marcas que tenham tampas fáceis de abrir.</td></tr><tr><td>Caixa de armazenamento de isopor para tubos de microcentrífuga (grade 5x20)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>Este design é bom porque não sobrecarrega os tubos.</td></tr><tr><td>Dispensador, repetidor</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Qualquer coisa semelhante ajudará a acelerar a dispensação.</td></tr><tr><td>Pilões, moedores de lenços descartáveis de plástico, 1,5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Disponível com vários fornecedores. Os pilões podem ser limpos e autoclavados para reutilização.</td></tr><tr><td>Placas BD Falcon ELISA, 96 poços (fundo plano)</td><td>Pipeta BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation, manual (20-200 &micro; l)</td> <td>VistaLab</td><td>1057-0200 ou 1070-0200</td><td>Qualquer tipo semelhante funcionará. Este modelo é ergonômico.</td></tr><tr><td>Reservatórios, reagente estéril</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Qualquer coisa semelhante funcionará.</td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica, 8 canais (50-1.200 &micro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>Se você tivesse que escolher um modelo eletrônico, esse tamanho é mais útil.</td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica, 8 canais (10-300 &micro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Qualquer coisa semelhante funcionará.</td></tr><tr><td>Arruela de placa múltipla (8 posições, reta)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>Qualquer coisa semelhante funcionará para a lavagem manual de pratos.</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas com detecção de absorbância</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Qualquer coisa semelhante funcionará.</td></tr><tr><td>Frango IgG/IgY</td><td>Estados Unidos Biológico</td><td>I1903-15R</td><td>Também disponível de outras fontes</td></tr><tr><td>Claras de ovo</td><td>Mercearia</td><td>" Todos os brancos", " Batedores de ovos", etc.</td><td>Misture 5 ml com 95 ml de dH2O para solução a 5%</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L para fazer TBS</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L para fazer TBS e 8.0&nbsp; g&#8288;/&#8288; L para PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1,14 g/L para PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0,2 g/L para PBS</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0,2 g/L para PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, Grau EIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Adicionar 0,5 ml por L ao PBS após a dissolução dos sais.</td></tr><tr><td>PBS com 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Misture 1 pacote em 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Anti-Frango IgY (IgG) (molécula inteira) anticorpo produzido em coelho (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &micro; l em 50 ml de Leite</td></tr> em <tr><td>Pó, Leite em Pó ou Fresco (1%)</td><td>Mercearia</td><td></td><td>Misture 10 g com 1 L dH2O para solução a 1%</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Frango IgY (IgG) (molécula inteira)-Peroxidase produzido em coelho (1:10.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &micro; l em 1 L de leite a 1%</td></tr><tr><td>Anti-Ovo de Galinha Albumina anticorpo produzido em coelho (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &micro; l em 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Conjugado de Peroxidase IgG Anti-Coelho de Cabra (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Diluir 0,5 ml em 1 L PBS-BSA, depois adicionar 1,3&nbsp; ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolímero de silício-poliéter</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Adicionar como último ingrediente</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administrando e detecção de marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de pesquisa

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoramento movimento artrópode é muitas vezes necessária para entender melhor a dinâmica da população, associados padrões de dispersão, preferências de planta hospedeira, e outras interações ecológicas. Artrópodes são geralmente acompanhados na natureza por marcá-los com uma marca única e, em seguida, re-coleta-los ao longo do tempo e espaço para determinar as suas capacidades de dispersão. Além de marcas físicas reais, tais como pó de cor ou tinta, vários tipos de proteínas têm se mostrado muito eficaz para a marcação de artrópodes para a investigação ecológica. As proteínas podem ser administrados internamente e / ou externamente. As proteínas podem então ser detectados em artrópodes recapturados com um enzyme-linked immunosorbent assay específico para a proteína (ELISA). Aqui nós descrevemos protocolos para marcação externa e internamente artrópodes com a proteína. Dois exemplos experimentais simples são demonstradas: (1) uma proteína de marca interna introduzida para um insecto, proporcionando uma dieta enriquecida em proteína e (2) uma marca de proteína externa um topicamentepplied para um insecto usando um nebulizador médico. Nós, então, relacionar um guia passo-a-passo do sanduíche e métodos indiretos de ELISA utilizados para detectar marcas de proteína sobre os insetos. Nesta demonstração, são discutidos vários aspectos da aquisição e detecção de marcadores de proteína em artrópodes para marca-release-recaptura, captura-marcação, e os tipos de auto de captura de marca-de investigação, juntamente com as várias maneiras que o procedimento imunomarcação tem sido adaptado para atender a uma ampla variedade de objectivos de investigação.

Marcação interna: Os resultados do teste de retenção marca interna são mostrados na Figura 2A. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,054. No geral (todos os quatro tempos do estudo combinado), os insectos tratados sem proteína originou consistentemente valores baixos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por outro lado, todos os insectos alimentados com a dieta...

As proteínas são frequentemente usadas para marcar artrópodes para pesquisa de dispersão. Métodos para administrar marcas de proteínas internas e externas em artrópodes são demonstrados. Técnicas de detecção de marcas de proteínas, por meio de ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) indiretos ou sanduíche, também são ilustradas.

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

O objetivo geral desta demonstração é descrever como marcar insetos com proteína para pesquisa de dispersão ou migração. Incluídos nesta demonstração estão métodos sobre como detectar as marcas por um sanduíche ou um ensaio de imunoabsorção enzimática indireta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de dispersão de insetos.Ele pode ser usado para estudar padrões de migração de insetos, preferências de plantas hospedeiras de insetos e disseminação de espécies invasoras. As vantagens dessa técnica são que o método de detecção é simples e barato. Adequado para alto rendimento, e os animais podem ser facilmente marcados diretamente em seu habitat natural.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque parece mais difícil do que é, porque a maioria dos pesquisadores de campo não tem experiência com essa técnica simples. Tive a ideia desse método pela primeira vez em 1989. Estávamos criando predadores de insetos de olhos grandes em uma dieta artificial.Estávamos preocupados que esses insetos não fossem predadores eficazes de uma praga de insetos Lygus depois de serem criados em cativeiro por um longo tempo em uma dieta não natural. Em outras palavras, eles seriam domesticados. Precisávamos de um método seguro, eficaz e barato para distingui-los após sua liberação no campo de suas contrapartes nativas.Nenhum dos métodos de marcação atuais se encaixa nesses critérios. Uma experiência anterior que tive usando o procedimento ELISA para realizar análises de conteúdo intestinal de predador para restos de proteínas específicas de Lygus, me deu a ideia de aplicar uma marca de proteína estranha no predador criado em laboratório. Por sua vez, pudemos analisar o campo coletado de insetos de olhos grandes para restos de Lygus e para os restos de proteínas estranhas.Para começar, colete cerca de 100 insetos de interesse de uma colônia de laboratório ou do campo e divida-os em dois recipientes de criação limpos. Carregue um recipiente com um pacote de dieta regular de 20 mililitros, para servir como controle negativo. Para o outro, amarre um pacote de dieta com um miligrama de IgG-IgY de frango.Adicione um mililitro de solução e misture bem. Se necessário, use o que os insetos são normalmente alimentados no lugar do pacote. Após 24 horas de criação com esses pacotes de dieta, forneça a ambos os grupos de insetos alimentos normais não marcados.Nos intervalos de tempo desejados, colete 20 insetos individuais de cada coorte. Congele-os a menos 20 graus Celsius, até que todas as coortes necessárias sejam coletadas para o experimento. Para preparar uma placa de 96 poços para o ELISA, a cada poço adicione 50 microlitros de anticorpo primário IgY anti-frango de coelho diluído um em 500 em solução salina tamponada com Tris, ou TBS.Deixe a placa carregada incubar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Mais tarde, esvazie os poços e adicione 300 microlitros de solução em bloco a cada poço. Esta é uma solução de leite em pó desnatado a um por cento.Deixe a placa incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação em bloco, transfira insetos congelados individuais para tubos de microcentrífuga carregados com um mililitro de TBS. Em seguida, homogeneize completamente cada inseto com um pilão limpo.Quando a placa estiver pronta, carregue cada poço com 100 microlitros de uma amostra de inseto homogeneizada. Cada placa de 96 poços acomoda 80 amostras. Deixe a primeira e a última coluna da placa vazias para controles.Na primeira coluna, carregue sete alíquotas de 100 microlitros apenas de TBS e carregue um poço com 100 microlitros de TBS com controle positivo de clara de ovo. Na última coluna, carregue 100 microlitros de oito preparações individuais de insetos não marcadas. Deixar incubar as amostras à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora.Após a incubação, lave cuidadosamente os poços três vezes com Phosphate Buffered Saline Tween, ou PBS-Tween. Através de nossa experiência, aprendemos que a maioria dos erros ocorre durante as etapas de lavagem. Respingos podem levar a uma alta ocorrência de reações falsas positivas, portanto, tome cuidado.Após as lavagens, adicione 50 microlitros de IgG-IgY anti-frango de coelho conjugado à peroxidase de rábano e diluído um a 10.000 em solução de leite a um por cento. Deixe a solução incubar nos alvéolos por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Mais tarde, lave a placa três vezes com PBS-Tween como antes.Em seguida, carregue os poços com 50 microlitros de substrato TMB. Você pode começar a ver uma mudança de cor imediatamente. Deixe a placa incubar por 10 minutos antes de lê-la com um espectrofotômetro de microplacas.Leia a placa a 650 nanômetros e registre os valores. Para marcar insetos externamente, prepare garrafas plásticas de um litro com orifícios de acesso e divida 100 insetos em duas garrafas. Em seguida, borrife os insetos em um recipiente com um mililitro de água destilada, que serve como controle negativo.Em seguida, conecte um nebulizador médico a uma saída de ar e ajuste o fluxo de ar para que o nebulizador produza vapor. Pulverize os outros insetos com um mililitro de solução de clara de ovo de galinha a cinco por cento. O processo de pulverização deve levar entre dois e cinco minutos para ser concluído.Em seguida, faça os furos e deixe a solução secar completamente à temperatura ambiente. Depois de secos, transfira os insetos de volta para seus recipientes normais de criação, com sua dieta padrão e mantenha-os normalmente. Posteriormente, colete os insetos em intervalos de tempo predeterminados para teste.Para verificar a retenção da marca externa, use um procedimento idêntico ao ensaio ELISA para testar a retenção da marca interna, com pequenas modificações. Depois que os insetos forem transferidos para tubos de microcentrífuga com TBS, deixe-os de molho em um agitador orbital a 120 RPM por uma hora, em vez de homogeneizá-los. Depois de molhar os insetos, pipete 100 microlitros da solução nos poços da placa e deixe a placa incubar por pelo menos uma hora.Depois de lavar as amostras de insetos, adicione 300 microlitros de PBS com um por cento de BSA a cada poço. Após 30 minutos em temperatura ambiente, lave os poços duas vezes com PBS-Tween. Em seguida, a cada poço, adicionar 50 microlitros de anticorpo primário anti-albumina de ovo de coelho, diluído um em oito mil na silhueta PBS-BSA.Incube a placa por pelo menos uma hora e lave os poços como antes. Em seguida, a cada poço, adicionar 50 microlitros de IgG anti-coelho de cabra conjugada à peroxidase de rábano e diluída uma em dois mil, na silhueta PBS-BSA. Deixe a placa incubar por pelo menos uma hora, em temperatura ambiente e, em seguida, prossiga com o protocolo conforme descrito anteriormente.A retenção da nota interna foi testada em quatro momentos. No geral, os insetos tratados sem proteína produziram valores de ELISA consistentemente baixos. Considerando que, todos os insetos alimentados com a dieta enriquecida com proteína produziram valores de ELISA consistentemente fortes.As marcas externas também foram testadas em quatro momentos. Os insetos que foram marcados topicamente com clara de ovo produziram valores consistentemente fortes. Previsivelmente, os controles negativos borrifados de água registraram valores de ELISA muito baixos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como marcar insetos e analisá-los quanto à presença da marca. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas e 30 minutos se for executada corretamente. Ao longo de um dia, 16 placas de ensaio com mais de 1000 amostras podem ser processadas.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o ensaio é extremamente sensível. Como tal, é imperativo que todas as superfícies, recipientes e equipamentos estejam livres de contaminação por proteínas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem padrões de dispersão locais e em toda a área de insetos em habitats agrícolas, urbanos, florestais e outros habitats naturais.Demonstramos em um exemplo de pequena escala aqui, no entanto, a técnica tem sido usada em uma escala muito maior para marcar os insetos diretamente em seu habitat natural usando equipamentos de pulverização comercial. Ficamos surpresos com as aplicações criativas de nossos colaboradores.

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Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Este protocolo descreve etapas para usar o novo software, SwarmSight, para o seguimento do frame-por-frame de insetos posições da antena e narigudo de vídeos de câmera web convencional usando computadores convencionais. O software livre, open-source processa quadros cerca de 120 vezes mais rápido do que os seres humanos e realiza-se no melhor do que a precisão humana.

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

Nós descrevemos como quantificar artrópodes da moradia de folha selando as folhas e a extremidade das filiais em um saco, cortando e congelando o material ensacado, e enxaguando o material previamente congelado na água para separar artrópodes do substrato para a quantificação.

Um método para quantificar artrópodes da folhagem-habitação

O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.

Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection

Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.

Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

Os procedimentos são descritos para estudar os comportamentos de sondagem e ingestão de mosquitos Culex tarsalis em mãos humanas usando eletropenetração AC-DC.

Eletropenetrografia AC-DC para o Estudo dos Comportamentos de Sondagem e Ingestão de Mosquitos Culex tarsalis em Mãos Humanas

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

Aprenda técnicas de marcação proteica em artrópodes para pesquisa de dispersão e migração de insetos. Este método utiliza ELISA para detecção e permite estudos de padrões migratórios em habitats naturais.

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

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