Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

O objetivo geral desta demonstração é descrever como marcar insetos com proteína para pesquisa de dispersão ou migração. Incluídos nesta demonstração estão métodos sobre como detectar as marcas por um sanduíche ou um ensaio de imunoabsorção enzimática indireta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de dispersão de insetos.

Ele pode ser usado para estudar padrões de migração de insetos, preferências de plantas hospedeiras de insetos e disseminação de espécies invasoras. As vantagens dessa técnica são que o método de detecção é simples e barato. Adequado para alto rendimento, e os animais podem ser facilmente marcados diretamente em seu habitat natural.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque parece mais difícil do que é, porque a maioria dos pesquisadores de campo não tem experiência com essa técnica simples. Tive a ideia desse método pela primeira vez em 1989. Estávamos criando predadores de insetos de olhos grandes em uma dieta artificial.

Estávamos preocupados que esses insetos não fossem predadores eficazes de uma praga de insetos Lygus depois de serem criados em cativeiro por um longo tempo em uma dieta não natural. Em outras palavras, eles seriam domesticados. Precisávamos de um método seguro, eficaz e barato para distingui-los após sua liberação no campo de suas contrapartes nativas.

Nenhum dos métodos de marcação atuais se encaixa nesses critérios. Uma experiência anterior que tive usando o procedimento ELISA para realizar análises de conteúdo intestinal de predador para restos de proteínas específicas de Lygus, me deu a ideia de aplicar uma marca de proteína estranha no predador criado em laboratório. Por sua vez, pudemos analisar o campo coletado de insetos de olhos grandes para restos de Lygus e para os restos de proteínas estranhas.

Para começar, colete cerca de 100 insetos de interesse de uma colônia de laboratório ou do campo e divida-os em dois recipientes de criação limpos. Carregue um recipiente com um pacote de dieta regular de 20 mililitros, para servir como controle negativo. Para o outro, amarre um pacote de dieta com um miligrama de IgG-IgY de frango.

Adicione um mililitro de solução e misture bem. Se necessário, use o que os insetos são normalmente alimentados no lugar do pacote. Após 24 horas de criação com esses pacotes de dieta, forneça a ambos os grupos de insetos alimentos normais não marcados.

Nos intervalos de tempo desejados, colete 20 insetos individuais de cada coorte. Congele-os a menos 20 graus Celsius, até que todas as coortes necessárias sejam coletadas para o experimento. Para preparar uma placa de 96 poços para o ELISA, a cada poço adicione 50 microlitros de anticorpo primário IgY anti-frango de coelho diluído um em 500 em solução salina tamponada com Tris, ou TBS.

Deixe a placa carregada incubar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Mais tarde, esvazie os poços e adicione 300 microlitros de solução em bloco a cada poço. Esta é uma solução de leite em pó desnatado a um por cento.

Deixe a placa incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação em bloco, transfira insetos congelados individuais para tubos de microcentrífuga carregados com um mililitro de TBS. Em seguida, homogeneize completamente cada inseto com um pilão limpo.

Quando a placa estiver pronta, carregue cada poço com 100 microlitros de uma amostra de inseto homogeneizada. Cada placa de 96 poços acomoda 80 amostras. Deixe a primeira e a última coluna da placa vazias para controles.

Na primeira coluna, carregue sete alíquotas de 100 microlitros apenas de TBS e carregue um poço com 100 microlitros de TBS com controle positivo de clara de ovo. Na última coluna, carregue 100 microlitros de oito preparações individuais de insetos não marcadas. Deixar incubar as amostras à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora.

Após a incubação, lave cuidadosamente os poços três vezes com Phosphate Buffered Saline Tween, ou PBS-Tween. Através de nossa experiência, aprendemos que a maioria dos erros ocorre durante as etapas de lavagem. Respingos podem levar a uma alta ocorrência de reações falsas positivas, portanto, tome cuidado.

Após as lavagens, adicione 50 microlitros de IgG-IgY anti-frango de coelho conjugado à peroxidase de rábano e diluído um a 10.000 em solução de leite a um por cento. Deixe a solução incubar nos alvéolos por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Mais tarde, lave a placa três vezes com PBS-Tween como antes.

Em seguida, carregue os poços com 50 microlitros de substrato TMB. Você pode começar a ver uma mudança de cor imediatamente. Deixe a placa incubar por 10 minutos antes de lê-la com um espectrofotômetro de microplacas.

Leia a placa a 650 nanômetros e registre os valores. Para marcar insetos externamente, prepare garrafas plásticas de um litro com orifícios de acesso e divida 100 insetos em duas garrafas. Em seguida, borrife os insetos em um recipiente com um mililitro de água destilada, que serve como controle negativo.

Em seguida, conecte um nebulizador médico a uma saída de ar e ajuste o fluxo de ar para que o nebulizador produza vapor. Pulverize os outros insetos com um mililitro de solução de clara de ovo de galinha a cinco por cento. O processo de pulverização deve levar entre dois e cinco minutos para ser concluído.

Em seguida, faça os furos e deixe a solução secar completamente à temperatura ambiente. Depois de secos, transfira os insetos de volta para seus recipientes normais de criação, com sua dieta padrão e mantenha-os normalmente. Posteriormente, colete os insetos em intervalos de tempo predeterminados para teste.

Para verificar a retenção da marca externa, use um procedimento idêntico ao ensaio ELISA para testar a retenção da marca interna, com pequenas modificações. Depois que os insetos forem transferidos para tubos de microcentrífuga com TBS, deixe-os de molho em um agitador orbital a 120 RPM por uma hora, em vez de homogeneizá-los. Depois de molhar os insetos, pipete 100 microlitros da solução nos poços da placa e deixe a placa incubar por pelo menos uma hora.

Depois de lavar as amostras de insetos, adicione 300 microlitros de PBS com um por cento de BSA a cada poço. Após 30 minutos em temperatura ambiente, lave os poços duas vezes com PBS-Tween. Em seguida, a cada poço, adicionar 50 microlitros de anticorpo primário anti-albumina de ovo de coelho, diluído um em oito mil na silhueta PBS-BSA.

Incube a placa por pelo menos uma hora e lave os poços como antes. Em seguida, a cada poço, adicionar 50 microlitros de IgG anti-coelho de cabra conjugada à peroxidase de rábano e diluída uma em dois mil, na silhueta PBS-BSA. Deixe a placa incubar por pelo menos uma hora, em temperatura ambiente e, em seguida, prossiga com o protocolo conforme descrito anteriormente.

A retenção da nota interna foi testada em quatro momentos. No geral, os insetos tratados sem proteína produziram valores de ELISA consistentemente baixos. Considerando que, todos os insetos alimentados com a dieta enriquecida com proteína produziram valores de ELISA consistentemente fortes.

As marcas externas também foram testadas em quatro momentos. Os insetos que foram marcados topicamente com clara de ovo produziram valores consistentemente fortes. Previsivelmente, os controles negativos borrifados de água registraram valores de ELISA muito baixos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como marcar insetos e analisá-los quanto à presença da marca. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas e 30 minutos se for executada corretamente. Ao longo de um dia, 16 placas de ensaio com mais de 1000 amostras podem ser processadas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o ensaio é extremamente sensível. Como tal, é imperativo que todas as superfícies, recipientes e equipamentos estejam livres de contaminação por proteínas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem padrões de dispersão locais e em toda a área de insetos em habitats agrícolas, urbanos, florestais e outros habitats naturais.

Demonstramos em um exemplo de pequena escala aqui, no entanto, a técnica tem sido usada em uma escala muito maior para marcar os insetos diretamente em seu habitat natural usando equipamentos de pulverização comercial. Ficamos surpresos com as aplicações criativas de nossos colaboradores.