Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

O objetivo geral deste protocolo é usar manipulações de perda e ganho de função para identificar moléculas específicas do estágio que controlam a diferenciação da massa celular interna de embriões de camundongos durante a pré-implantação. Este método pode ajudar a responder à questão-chave sobre a liberação precoce do destino celular na biologia básica do desenvolvimento, bem como na biologia de células-tronco, ciência animal e biotecnologia reprodutiva, como a clonagem animal. O principal objetivo desta técnica é que o receptor específico do estágio, e há ligantes de uso para aumentar a expressão apenas do fator específico de células-tronco embrionárias durante o desenvolvimento embrionário.

Este protocolo foi desenvolvido em colaboração com vários laboratórios. Então, demonstrando o processo estará meu colaborador, o professor Sang Jin Lee, e seu aluno de pós-graduação, Yong Il Cho. 18 a 20 horas após a última injeção, sacrifique as fêmeas grávidas por intoxicação por dióxido de carbono seguida de luxação cervical.

Em seguida, abra a parte de trás e corte a camada interna com uma tesoura fina. Encontre e pegue os chifres uterinos usando uma pinça fina e puxe-os suavemente para fora da cavidade corporal, junto com o útero, oviduto, ovário e almofadas de gordura. Em seguida, corte a área entre o oviduto e o ovário usando uma tesoura fina.

Em seguida, reposicione a pinça e corte o útero próximo ao oviduto, deixando pelo menos um centímetro da parte superior do útero preso. Agora, transfira a ampola oviductal para a gota de mídia M16 coberta com óleo mineral em uma placa de Petri de 35 milímetros à temperatura ambiente. Junte os ovidutos de vários camundongos no mesmo prato.

Depois de preparar a agulha de uma seringa CC, conforme indicado no protocolo de texto, use uma pinça fina para segurar e entrar na extremidade do oviduto. Em seguida, perfure suavemente e esprema a massa cumulus na fase de gota do meio. Sob um estereomicroscópio, recupere os embriões 2-PN junto com as massas cumulus circundantes, usando uma pipeta de vidro estéril, e transfira-os para uma nova placa de Petri.

Em seguida, dissocie as células do cumulus banhando os tecidos em um mililitro de solução de hialuronidase. Agora, incube o prato a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. O próximo passo é desnudar os embriões.

Usando a pipeta de vidro, flua suavemente a solução do banho para liberar as células do cumulus dos embriões circundantes. Em seguida, lave os embriões desnudos com 30 a 50 mililitros de PBS fresco por embrião. Faça esta lavagem três vezes.

Agora, transfira os embriões para um prato de plástico de 35 milímetros com M16 mais BSA e mantenha-os em uma incubadora umidificada por até quatro horas antes da microinjeção. Antes da microinjeção, lave brevemente os embriões 2-PN desnudos com um mililitro de M16 fresco. Em seguida, transfira os embriões em solução para um tubo de centrífuga e gire-os a 1.000 Gs por 10 minutos.

Agora, transfira cada embrião para uma placa de cultura com 20 a 30 microlitros de meio M16. Isso tornará os pronúcleos visíveis. Cubra o meio com uma fina camada de óleo mineral e incube os embriões a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas.

Enquanto isso, com um extrator mecânico, prepare as pipetas de injeção e as pipetas de retenção de tubos capilares de vidro de borosílica. Em seguida, usando um micromoedor e um microforger, fabrique as pipetas de injeção com pontas rombas e poli-as em aberturas de dois mícrons de largura. O comprimento da ponta deve ser inferior a 500 mícrons.

Da mesma forma, fabrique pipetas de retenção fazendo pontas rombas e polindo suas aberturas em um diâmetro interno de 20 mícrons e um diâmetro externo de 100 mícrons. Agora, carregue as pipetas de injeção com pelo menos 200 nanolitros de solução de plasmídeo a uma concentração de um micrograma de DNA por microlitro. Em seguida, monte a pipeta de injeção em um micromanipulador motorizado.

Em seguida, ajuste o injetor para pulsar bul-ih-ses de cerca de 10 picolitros. Para a microinjeção, prenda os embriões usando pressão negativa da pipeta de retenção. Em seguida, avance e coloque a ponta da pipeta de injeção adjacente à membrana celular logo acima de um dos pronúcleos.

Em seguida, espete a membrana celular, empurre ainda mais para dentro do pró-núcleo e faça a injeção de 10 picolitros. Após a microinjeção, colete os embriões injetados e lave-os três vezes com meio M16 fresco. Cada lavagem pode ter menos de um minuto de duração.

Em seguida, prossiga com a cultura dos embriões cobrindo o meio M16 com uma gota de óleo mineral para evitar que evapore e colocando cada embrião em uma placa de cultura de plástico em uma gota de meio M16. A cada 24 horas, observe os embriões usando um microscópio confocal de varredura a laser com óptica DIC de 488 nanômetros ou 555 nanômetros com ampliação de 200x. A neogenina é expressa transitoriamente durante os estágios iniciais de desenvolvimento da pré-implantação.

Aparece já no estágio de 2 células e dura até o estágio inicial da mórula. Sua expressão é principalmente espacialmente restrita ao exterior das células. Os níveis de expressão de neogenina foram manipulados por microinjeção de zigotos 2-PN com vetores de cDNA de neogenina, ou vetores que abrigam RNA de grampo curto contra a neogenina.

RFP e GFP foram coexpressos como indicadores. O nível de expressão de neogenina resultante foi confirmado tanto por imunofluorescência quanto por immunoblotting. Não houve diferenças morfológicas grosseiras na perda de neogenina ou no ganho de neogenina embriões, nem eles se desenvolveram de forma diferente até o estágio de blastocisto.

No entanto, o desenvolvimento de ICM foi menos pronunciado em embriões com perda de neogenina, conforme medido por três e quatro células ICM positivas. Além disso, houve mais células ICM positivas para três e quatro por blastocisto nos embriões de ganho de neogenina. Esta observação foi confirmada pela análise de rtPCR.

Em embriões de ganho de neogenina, as expressões de Oct três e quatro, SOX2 e Nanog foram dramaticamente aumentadas, em contraste com uma mudança de expressão insignificante em Cdx2 e Tead4. Uma vez dominada, esta parte de microinjeção deste protocolo pode ser concluída em cerca de uma hora. Ao tentar este protocolo, lembre-se de que o embrião 2-PN é uma microinjeção de isolamento otimizada para congelamento e cultura de embriões para minimizar os danos.

Complementando esse método de procedimento, como estudos de drogas, pode ser realizado para responder a perguntas antigas sobre a via de sinalização e assim por diante.