Name: Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a usar manipulações de perda e ganho de função para investigar determinantes do destino celular precoce em embriões de camundongos pré-implantação. Este método identifica receptores específicos de estágio que controlam a diferenciação da massa celular interna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores também gostaria de reconhecer o grupo do Dr. Xiong na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia para a fabricação e compartilhando as construções para neogenin vetores de cDNA e shRNA. Este estudo foi apoiado por bolsas do Programa Básico de pesquisa da ciência (2013R1A1A4A01012572) financiado pela Fundação coreana Investigação e por uma bolsa de investigação da Universidade Sahmyook.

NOTA: Todos os procedimentos para a criação e dos cuidados dos animais foram realizados de acordo com os regulamentos IACUC da Universidade Sahmyook, Seul, Coreia do Sul. 1. A superovulação, Reprodução e isolamento Oviduto <ol><li> Manter consanguíneos C57BL / 6 com as seguintes condições: 22 ± 3 ° C, ~ 60% de humidade, 12 h ciclo de luz / escuro, e água e comida ad libitum. </li><li> Induzir a superovulação de camundongos fêmeas de 3-5 semanas de idade, por uma injecção intraperitoneal de 5 IU égua prenhe gonadotrofina sérica (PMSG) em 0.1 ml / cabeça seguido de 48 horas mais tarde por uma injecção intraperitoneal de 5 UI gonadotrofina coriônica humana (hCG) em 0.1 ml /cabeça. </li><li> Imediatamente após a injecção de hCG, companheiro fêmeas induzida por superovulação com machos sexualmente maduros da mesma estirpe, mantendo-os na mesma gaiola durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, confirmar acasalamento bem-sucedido pela presença de um tampão de acoplamento ou rolhão vaginal sobre o aparelho genital feminino. </li><li> Sacrificar ratos fêmea grávidapor CO 2 intoxicação seguido por deslocamento cervical 18-20 h após a injecção de hCG. </li><li> Abrir a cavidade abdominal através do corte da pele e, em seguida, a camada peritoneal com uma tesoura fina. </li><li> Pegar os cornos uterinos com uma pinça fina e puxe para fora do útero, oviduto, ovário e almofada de gordura suavemente da cavidade corporal. </li><li> Corte a área entre o oviduto e do ovário com uma tesoura fina. Reposicionar a pinça e cortar o útero perto do oviduto, deixando, pelo menos, 1 cm da parte superior do útero em anexo. </li><li> Transferir a ampola oviductal a um prato de 35 milímetros de Petri contendo meio de M16 à temperatura ambiente. Reúnem-se os ovidutos de vários murganhos no mesmo prato. </li><li> Coloque os pratos sob um microscópio estereoscópico para a recuperação de embriões. </li></ol> 2. Recuperação e Cultura de 2-Pronuclear (2-PN) Embriões <ol><li> Corte a extremidade de um G agulha hipodérmica 30 ou 32, transformá-lo em uma ponta romba, e usá-lo como uma agulha de lavagem. </li><li> Usaruma pinça fina para fazer deslizar a extremidade do oviduto para a agulha de descarga. Pressione suavemente a ponta da agulha de lavagem contra o fundo do prato para segurá-la no lugar. Lavar o oviduto com ~ 0,1 mL de meio M16 para libertar os embriões 2-Pn para uma placa de Petri. </li><li> Recuperar os embriões 2-PN, juntamente com áreas massas cumulus do meio M16 corado sob o microscópio estereoscópico usando uma pipeta de vidro esterilizado e transferi-los para uma nova placa de Petri. </li><li> Separar as células do cumulus dos embriões 2-Pn por digestão enzimática com 1,0 ml de 0,1-0,5% de hialuronidase em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) a 37 ° C durante 5-10 min. </li><li> Desnudar embriões pipetando suavemente com uma pipeta de vidro e remoção física das células do cumulus. </li><li> Lavar embriões desnudadas três vezes com 30-50 mL de fresco salino tamponado com fosfato (PBS) por embrião. </li><li> Incubar embriões em uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros em meios M16 suplementado com 10 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA, Fractião V) a 37 ° C em 5% de CO2 num incubador humidif içado até que a micro-injecção é feito, que é geralmente inferior a 4 horas mais tarde. </li></ol> 3. Embrião Transcrição Reversa (RT) e Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) <ol><li> Recolher pelo menos 10 embriões de cada estágio até ao estádio de blastocisto e reuni-los em 4,0 mL de 5x transcriptase solução de pré-mistura reversa contendo a transcriptase inversa, um inibidor de RNase, iniciador oligo dT, 6mers aleatórios, mistura de dNTP, e o tampão de reacção numa tubo de PCR. </li><li> Adicionar isento de ARNase H2O destilada até um volume total de 20 ul e sonicar os embriões reunidas durante 30 segundos a 200 W. Inicia-se a reacção de RT imediatamente a 42 ° C durante 1 h seguido de 5 minutos de incubação a 95 ° C. </li><li> Para cada 5,0 ml de solução de ADNc gerado, realizar a amplificação de PCR normal com iniciadores para neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, sequências iniciadoras OCT3 / 4, ou β-actina (dado na Tabela </strong&gt; 1. PCR consiste em 40 ciclos de 15 seg de incubação a 95 ° C, 30 segundos à temperatura de emparelhamento (mostrada na Tabela 1), e 30 seg a 72 ° C. </li><li> Os produtos de PCR separados por electroforese em gel de agarose a 2% e visualizar o gel com luz UV, após coloração com brometo de etídio. </li><li> Normalizar a expressão do gene alvo contra os níveis de beta-actina. </li></ol> 4. Imunocitoquï¿½ica de Embriões <ol><li> Fix embriões de cada fase com paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente seguido por uma breve lavagem 3 vezes com PBS contendo 0,01% de BSA. </li><li> permeabilizar as membranas celulares por incubação de embriões de 10 em 1,0 ml de PBS contendo 0,1% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Para bloquear a ligação não específica incubar os embriões permeabilizadas em 1,0 ml de PBS suplementado com soro de cabra normal a 10% durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a embriões sagacidade bloqueadoh coelho anticorpos anti-neogenin em diluição 1: 100 em PBS contendo BSA a 0,1% durante a noite a 4 ° C. </li><li> Depois de três lavagens de 30 s cada em gotas de PBS, incubar os embriões com qualquer Alexa IgG de cabra anti-coelho 488-conjugado ou de IgG de cabra anti-coelho de 568 conjugado com Alexa diluição de 1: 500 em solução de PBS / BSA a noite a 4 ° C . </li><li> Para visualizar os filamentos de actina, incubar os embriões em 1 ug / ml em PBS faloidina durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Manchar os núcleos por adição de 5 ml de PBS contendo 1 ug / ml de DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato) durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar embriões três vezes brevemente com PBS. </li><li> Transferir os embriões para uma lâmina de vidro e cobri-los com uma gota de óleo mineral. </li><li> Captar imagens de 1000X de ampliação com um microscópio confocal com uma excitação do comprimento de onda apropriado. </li></ol> 5. Preparação de neogenin-RFP e neogenin-siRNA GFP Plasmids <ol><li> Subclonar cDNA que codifica neogenin do mouse em uma proteína fluorescente vermelha (RFP) molecular contendo vector, resultando em neogenin-flag-RFP. </li><li> Subclone pequeno ARN em gancho de segmentação neogenin para uma proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP) molecular contendo vector, resultando em pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (mostrado na Figura 1). </li><li> Amplificar tanto neogenin-flag-RFP e plasmídeos pcDNA-EmGFP-miR-neogenin e purificá-los com os métodos convencionais. </li><li> Ajustar as concentrações finais de plasmídeos para ~ 1,0 ug / ml em tampão estéril de Tris-EDTA (TE). </li></ol> 6. A microinjecção de plasmídeos em 2-PN Embriões <ol><li> Lave as desnudas 2-PN embriões uma vez, brevemente, com a mídia M16 frescos. </li><li> Centrifugar os embriões 2-Pn durante 10 min a 1000 x g numa centrífuga de bancada para permitir a observação dos pró-núcleos. </li><li> Incubar os embriões em uma micro gota de 20-30 ul de meios de M16 por embrião sob óleo mineral a 37 ° C em 5% de CO 2 durante um additional 1-2 h. </li><li> Fabricação pipetas de injeção e pipetas segurando puxando tubos capilares de borosilicato de vidro (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) com um extrator mecânico. </li><li> Fabricar pipetas de injeção ter blunt dicas e aberturas polidas de &lt;comprimento da ponta 500 mm e diâmetro interno de 1-2 mm ponta usando um microgrinder e uma microforger. </li><li> Fabricar segurando pipetas de tal modo que eles têm pontas rombas e aberturas polida com um diâmetro interior de 20 um e um diâmetro externo de 100 um. </li><li> pipetas de injecção de carga com uma quantidade suficiente (&gt; 200 nl) de uma solução de plasmídeo em 1,0 ug / uL. </li><li> Microinject ~ 10 ul de uma solução de plasmídeo para cada embrião 2-PN em um dos pró-núcleos utilizando um microinjector ligada a um micromanipulador motorizado; durante este processo, manter os embriões em posição através da aplicação de pressão negativa com uma pipeta de exploração. </li><li> Após a microinjeção, lave os embriões de 2 PN 3 vezes com meios M16 fresco para lESS de 1 min de cada vez. </li><li> Cultura de embriões 2-Pn em uma gota de meios frescos M16 em uma placa de cultura de plástico coberta por uma gota de óleo mineral para evitar a evaporação meios. </li><li> Observe os embriões em intervalos de 24 horas, sob um contraste de interferência diferencial (DIC) microscópio invertido na ampliação de 200X. </li></ol>

<ol><li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li>
<li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li>
<li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li>
<li>Ovitt, C. E., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Oocyte+Microinjection%2C+Maturation+and+Ploidy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).</li>
<li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li>
<li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development%3A+Its+role+in+compaction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).</li>
<li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989(2014).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes para divulgar.

No presente protocolo, demonstramos novos métodos de microinjecção de materiais genéticos, quer cDNA ou shRNA, para os embriões de ratos de 2 PN para explorar o papel da neogenin na diferenciação celular precoce durante a embriogênese mouse. A modificação genética de embriões pré-implantação é uma técnica poderosa para a descoberta de informações importantes sobre os mecanismos subjacentes moleculares para, por exemplo, a primeira determinação linhagem celular. A modificação genética é um dos métodos mais utilizados par...

Preimplantation o desenvolvimento embrionário pode ser dividido em várias fases distintas, a partir do estádio de uma célula para a mórula e blastocisto. Muito evidência sugere que a polaridade e indicadores de posicionamento desempenhar um papel na determinação do destino da célula precoce no trofectoderma (TE) e a massa celular interna (ICM). No entanto, a natureza dos sinais, como eles são transduzidas em sinais celulares, e os contextos fisiológicos em que tais sinais são capazes de iniciar a diferenciação linhagem de células não são conhecidos. Estas células diferenciadas, em seguida, submetidos a especialização, começando a assumir estruturas características e funções necessárias para a formação de embriões adequada e crescimento da placenta 1-3. embriões pré-implantação são particularmente propício à manipulação por injecção directa de material genético modificados como siRNA ou de cDNA alvo e, portanto, pode ser utilizada para estudar moléculas alvo específicas. Há uma crescente compreensão de que genéticaA análise de embriões de vertebrados é fundamental para fazer avançar nossa compreensão do desenvolvimento embrionário 4. introdução exacta de um gene de tipo selvagem ou uma sua forma mutante em um embrião num contexto oportuna para realizar gain- ou perda de função do gene tem grandemente facilitado o estudo de genes regulados relativamente ao desenvolvimento. Deficitária e ganhar de função através de microinjecção de materiais genéticos em embriões não-mamíferos e mamíferos primeiros individuais é relativamente simples por causa de seu grande tamanho e grande receptividade 5. A microinjecção é tipicamente realizada usando vectores não virais. vantagem particular foi tomada em consideração a facilidade de utilização de vectores não virais mais de vetores virais e transgenes. A perda-rápido ou sistema de expressão de ganho de função em embriões de camundongos foi desenvolvida que nos permite dissecar e entender as funções dos genes na embriologia dos vertebrados 6,7. marcação fluorescente de embriões facilitaria enormemente a seleção de microinjected ou geneticamente manipulado embriões e, ao mesmo tempo conceder um meio para quantificar indirectamente o nível de expressão de ADNc ou siRNA microinjectados com base na intensidade de fluorescência 8. Para realizar esta rotulagem, ADNc de proteína fluorescente, GFP ou RFP, são co-injectados quer como construções de fusão ou separadamente. A intensidade da fluorescência da GFP ou RFP revela a extensão de expressão de siRNA ou DNA estranho para assegurar que deficitária ou ganho-de-função tem sido realizado. Aqui, apresentamos um protocolo de micromanipulação para a técnica função deficitária e ganho-de- que nos permitiu identificar neogenin como um receptor que transmite sinais extracelulares importantes na diferenciação celular no início de embriões de ratos pré-implantação.

<table><tbody><tr><td>M16 médio,</td> <td>Gibco BRL (Grand Island, NY)</td> <td>M7292 LOTE# 11A832</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra,&nbsp;</td><td>Dako (Glostrup, Dinamarca)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, Holanda</td><td>G4877-1000IU LOTE#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL LOTE# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>gonadotrofina coriônica humana e gonadotrofina sérica de égua grávida&nbsp;</td><td>(Intervet, Holanda)</td><td>(invitrogen, 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&reg; III Transcriptase reversa</td><td>lifetechnologies</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>PCR pré-mistura</td><td>&nbsp;( Bioneer, Daejon, Coréia do Sul)</td><td>GenDEPOT, A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (grau molecular)</td><td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Paraformaldeído, 4% em PBS</td><td>Affymetrix EUA</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo policlonal anti-neogenina de coelho</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 marcado anticorpo anti-coelho</td><td>Sondas Moleculares (Invitrogen, EUA)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 555 marcado anti-coelho</td><td>anticorpo Molecular Probes (Invitrogen, EUA)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 555 Phalloidin</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, EUA)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&;D sistemas</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>todas as construções de plasmídeos&nbsp;</td><td>Prof. Wen Cheng Xiong na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia (Agusta, GA).</td><td></td><td>para os presentes estudos foram gentilmente cedidos por&nbsp;</td></tr><tr><td>Neon&reg; &nbsp; Sistema de Transfecção</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Microscrope Estéreo</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Micromainpulation com Nikon</td><td>Nikon</td><td>Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td>Micro Injetor</td><td>Nikon Narishige</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>Suporte</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige IM 16</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Nikon Narishige</td><td>Moedor Narishige MF-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Extrator Narishige</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumnet company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora CO2</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&reg; 384-Well Thermal Cycler&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

deficitária e abordagem de ganho de função para investigar celular precoce destino determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

As técnicas de silenciamento e superexpressão de genes são fundamentais para a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento embrionário. A modificação direta do gene alvo em embriões pré-implantação fornece um meio de estudar os mecanismos subjacentes dos genes implicados, por exemplo, na diferenciação celular no trofectoderma (TE) e na massa celular interna (ICM). Aqui, descrevemos um protocolo que examina o papel da neogenina como um receptor autêntico para a determinação do destino celular inicial em embriões de camundongos pré-implantação. Primeiro, discutimos as manipulações experimentais que foram usadas para produzir ganho e perda da função da neogenina por microinjeção de cDNA e shRNA de neogenina; a eficácia dessa abordagem foi confirmada por uma forte correlação entre os níveis de expressão em pares da proteína fluorescente vermelha (RFP) ou da proteína fluorescente verde (GFP) e a quantificação imunocitoquímica da expressão de neogenina. Em segundo lugar, a superexpressão de neogenina em embriões de camundongos pré-implantação leva ao desenvolvimento normal do ICM, enquanto o knockdown da neogenina faz com que o ICM se desenvolva de forma anormal, o que implica que a neogenina pode ser um receptor que retransmite pistas extracelulares para conduzir os blastômeros ao destino celular inicial. Dado o sucesso deste protocolo detalhado na investigação da função de um novo receptor específico do estágio de desenvolvimento embrionário, propomos que ele tenha o potencial de auxiliar na exploração e identificação de outros genes específicos do estágio durante a embriogênese.

Descobrimos que neogenin é transitoriamente expressa durante os primeiros estágios de desenvolvimento de embriões de ratos pré-implantação, aparecendo tão cedo quanto na fase 2-célula e duradoura até o início mórula mas tornar-se deficiente no final de mórula e estádios de blastocisto (Figura 2A). Além disso, a distribuição espacial da neogenin estava restrita principalmente para fora das células. Os resultados das análises de RT-PCR foram consistentes com a natureza tra...

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar manipulações de perda e ganho de função para identificar moléculas específicas de cada estágio que controlam a diferenciação da massa celular interna de embriões de camundongo durante o período pré-implantação. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a definição inicial do destino celular na biologia do desenvolvimento básico, bem como na biologia de células-tronco, ciência animal e bio-tecnologia reprodutiva, como a clonagem animal. O principal objetivo desta técnica é identificar o receptor específico para cada estágio, bem como seus ligantes, com o intuito de aumentar a expressão de fatores específicos de células-tronco embrionárias durante o desenvolvimento embrionário.Este protocolo foi desenvolvido em colaboração com diversos laboratórios. Assim, demonstrar o processo será minha colaboração com o Professor Sang Jin Lee e seu aluno de pós-graduação, Yong Il Cho. Dezoito a vinte horas após a última injeção, sacrifique as fêmeas prenhes por intoxicação com dióxido de carbono, seguida por dislocação cervical.Em seguida, abra o lado posterior e corte a camada interna com tesoura fina. Localize e segure os cornos uterinos com pinça fina e retire-os suavemente da cavidade corporal, juntamente com o útero, oviducto, ovário e camadas de gordura. Em seguida, corte a região entre o oviducto e o ovário usando tesoura fina.Em seguida, reposicione a pinça e corte o útero próximo ao oviduto, deixando pelo menos um centímetro da parte superior do útero preso. Agora, transfira a ampola do oviduto para a gota de meio M16 coberta com óleo mineral em uma placa de Petri de 35 milímetros à temperatura ambiente. Reúna os ovidutos de vários camundongos na mesma placa.Após preparar a seringa com agulha de 1 CC, conforme indicado no protocolo descrito no texto, use pin&ccedil;as finas para segurar e inserir na extremidade do oviduto. Em seguida, perfure suavemente e expulse a massa de c&uacute;mulos na gota de meio. Sob um microsc&oacute;pio estereosc&oacute;pico, recupere os embri&otilde;es com 2-PN juntamente com as massas de c&uacute;mulos ao redor, utilizando uma pipeta de vidro est&eacute;ril, e transfira-os para uma nova placa de Petri.Em seguida, dissocie as células do cúmulo colocando os tecidos em um mililitro de solução de hialuronidase. Agora, incube a placa a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. O próximo passo é desnudar os embriões.Usando a pipeta de vidro, flua suavemente a solução de banho para liberar as células do cúmulo dos embriões circundantes. Em seguida, lave os embriões desnudados com 30 a 50 mililitros de PBS fresco por embrião. Realize esta lavagem três vezes.Agora, transfira os embriões para uma placa plástica de 35 milímetros com M16 mais BSA e mantenha-os em uma incubadora umidificada por até quatro horas antes da microinjeção. Antes da microinjeção, lave brevemente os embriões desnudados com 2 PN usando um mililitro de M16 fresco. Em seguida, transfira os embriões em solução para um tubo de centrífuga e centrifugue-os a 1.000 ×g por 10 minutos.Agora, transfira cada embrião para uma placa de cultura contendo 20 a 30 microlitros de meio M16. Isso tornará os pronúcleos visíveis. Cubra o meio com uma fina camada de óleo mineral e incube os embriões a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas.Enquanto isso, com um puxador mecânico, prepare as pipetas de injeção e as pipetas de retenção a partir de tubos capilares de vidro borossilicato. Em seguida, utilizando um microretoque e um microforjador, fabrique as pipetas de injeção com pontas rombas e polidas até obter aberturas com largura de dois micrômetros. O comprimento da ponta deve ser inferior a 500 micrômetros.Da mesma forma, fabrique pipetas de retenção produzindo pontas rombudas e polindo suas aberturas até um diâmetro interno de 20 microns e um diâmetro externo de 100 microns. Agora, carregue as pipetas de injeção com pelo menos 200 nanolitros de solução de plasmídeo numa concentração de um micrograma de DNA por microlitro. Em seguida, monte a pipeta de injeção em um micromanipulador motorizado.Em seguida, configure o injetor para pulsos de cerca de 10 picolitros. Para a microinjeção, fixe os embriões utilizando pressão negativa da pipeta de contenção. Em seguida, avance e posicione a ponta da pipeta de injeção adjacente à membrana celular, logo acima de um dos pronúcleos.Em seguida, perfure a membrana celular, avance até o pronúcleo e realize a injeção de 10 picolitros. Após a microinjeção, colete os embriões injetados e lave-os três vezes com meio M16 fresco. Cada lavagem pode durar menos de um minuto.Em seguida, prossiga com o cultivo dos embriões cobrindo o meio M16 com uma gota de óleo mineral para evitar sua evaporação, e colocando cada embrião em uma placa de cultura plástica sobre uma gota de meio M16. A cada 24 horas, observe os embriões utilizando um microscópio confocal de varredura a laser com óptica DIC de 488 nanômetros ou 555 nanômetros com ampliação de 200x. A neogenina é expressa de forma transitória durante os estágios iniciais de desenvolvimento pré-implantação.É evidente já no estágio de 2 células e persiste até o estágio inicial de mórula. Sua expressão é principalmente restrita espacialmente à região externa das células. Os níveis de expressão de neogenina foram manipulados por microinjeção de zigotos com 2 PN com vetores de cDNA de neogenina ou com vetores contendo RNA de cabelo curto contra a neogenina.RFP e GFP foram coexpressos como indicadores. O nível resultante de expressão de neogenina foi confirmado tanto por imunofluorescência quanto por imunoblotting. Não houve diferenças morfológicas evidentes nem nos embriões com perda de neogenina nem nos embriões com ganho de neogenina, e eles não se desenvolveram de maneira diferente até a fase de blastocisto.No entanto, o desenvolvimento da MCI foi menos acentuado em embriões com perda de neogenina, conforme avaliado pelas células da MCI positivas para Oct três e quatro. Além disso, havia mais células da MCI positivas para Oct três e quatro por blastocisto nos embriões com ganho de neogenina. Essa observação foi ainda confirmada por análise de rtPCR.Em embriões com ganho de neogenina, as expressões de Oct três e quatro, SOX2 e Nanog aumentaram drasticamente, em contraste com uma mudança de expressão desprezível em Cdx2 e Tead4. Uma vez dominada, esta etapa de microinjeção deste protocolo pode ser concluída em cerca de uma hora. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que os embriões 2-PN são otimizados para isolamento por microinjeção e cultivo, a fim de minimizar os danos.Complementando este método procedimental, estudos com fármacos, por exemplo, podem ser realizados para responder perguntas antigas sobre a via de sinalização e outras semelhantes.

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

Este artigo tem como objetivo demonstrar o uso de células-tronco embrionárias haploides partehenogenéticas como um substituto para o esperma para a construção de embriões semi-clonados.

Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Aprenda a usar manipulações de perda e ganho de função para investigar determinantes do destino celular precoce em embriões de camundongos pré-implantação. Este método identifica receptores específicos de estágio que controlam a diferenciação da massa celular interna.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Explorar mais vídeos