Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

O objetivo geral desta Quantificação de Actina Filamentosa Punta em neurônios cultivados é introduzir um método útil para estudar a integridade e cognitividade das estruturas sinápticas. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo da neurociência sobre espinogênese, plasticidade sináptica e estabilidade sináptica. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um protocolo detalhado para cultura neuronal primária, seguindo a identificação e quantificação de pontos de F-actina.

Quando o objetivo de realização é desconhecido, é necessário estimar a integridade geral das estruturas fundântricas ratia. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando estávamos estudando o dano neuronal induzido por drogas de abuso como cocaína e proteínas tóxicas para HIV como tat e JP 120 Dois dias antes de montar o revestimento de cultura 12, placas de fundo de vidro de 35 milímetros, com dois mililitros de solução de trabalho de poli-L lisina. E guarde os pratos no exaustor durante a noite para manter sua esterilidade.

No dia seguinte, descarte o agente de revestimento e lave a louça com água bidestilada Deixe a louça secar por uma hora sob o capô. Em seguida, transfira dois mililitros de meio de revestimento para cada prato.

E incube os pratos durante a noite a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. No dia da cultura, coloque o cérebro colhido em uma placa de Petri contendo HBSS frio. Em seguida, prendendo um cérebro com uma pinça, use a pinça curva para separar os hemisférios e remover as meninges.

Isole os córtices frontais e transfira as peças para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Adicione dois mililitros de HBSS fresco e 20 microlitros de tripsina EDTA ao tubo e incube os tecidos neurais por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Com um giro suave a cada poucos minutos.

No final da incubação, use uma pipeta de vidro para aspirar todo o HBSS antigo. E enxágue os córtices duas vezes com HBSS fresco. Após a segunda lavagem, mergulhe o tecido no inibidor de tripsina.

Misture bem e deixe a amostra descansar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave os lenços duas vezes com HBSS fresco. Agora use uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha para triturar muito lentamente os pedaços do cérebro 10 a 15 vezes.

Em seguida, usando uma pipeta calibrada equipada com uma ponta estéril com diâmetro reduzido, triturar muito lentamente a pasta do tecido novamente. Quando a solução for homogénea, colocar as células em placas com a densidade adequada nas placas de cultura pré-revestidas para uma incubação durante a noite na incubadora de cultura de células. Após 24 horas, substitua o meio de plaqueamento por meio basal estreito sem soro de crescimento completo recém-preparado.

E retorne as células à incubadora de cultura de células por pelo menos 12 a 14 dias. O revestimento de baixa densidade é importante para visualizar os neurônios individuais. E o meio basal do neurônio é fundamental para minimizar a perfuração do astrocise dentro das culturas de células.

Para rotular as células para imunocitoquímica, primeiro lave a placa de cultura de células com fundo de vidro duas vezes com PBS. Em seguida, fixe as células com paraformaldeído a quatro por cento por 15 minutos em temperatura ambiente. Seguido por duas lavagens de PBS.

Em seguida, permeie as células com 0,1% de Triton X 100 em PBS por cinco minutos e rotule-as com uma coloração específica de F-actina à temperatura ambiente. Após 20 minutos, enxágue as células duas vezes com PBS e bloqueie qualquer coloração inespecífica da superfície celular com soro de cabra normal a 10%. No final da incubação, rotule as células durante a noite a quatro graus Celsius com anticorpo anti-mapa dois policlonal de galinha.

Na manhã seguinte, enxágue as células duas vezes com PBS e marque-as com anticorpo secundário apropriado. Após duas horas em temperatura ambiente, enxágue as células com PBS novamente e rotule-as com 10 microlitros de huxs por três minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células duas vezes finais com PBS e preserve-as com 100 microlitros de reagente anti-desbotamento.

Dentro de três dias após essa coloração, ligue o microscópio fluorescente e selecione a objetiva 20 X. Em seguida, no software do microscópio, defina o tamanho da imagem de pixel para 1600 por 1200 e a resolução de imagem de 0,17 mícron por pixel para zoom de 1 X. Transfira o prato de células para o estágio do microscópio.

E adquira imagens dos neurônios do mapa 2 da F-actina marcados com co sob os canais fluorescentes verde e vermelho. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, escolha cinco imagens de neurônios individuais nos canais verde, vermelho e azul com mandris dendríticos claramente definidos. E use a imunofluorescência contínua do mapa dois para identificar as estruturas ricas em F-actina nos segmentos dendríticos de segunda ordem.

Gire a região selecionada das imagens horizontalmente. E copie e cole a região como uma nova imagem. Em seguida, subtraia a fluorescência de fundo da imagem e use o software para contar o número de pontos de F-actina verde brilhante.

Use observadores independentes treinados para medir o comprimento dos segmentos dendríticos selecionados. Em seguida, exporte os números de pontos e os dados de comprimento do segmento dendrítico para um arquivo de planilha. Certifique-se de que os observadores incluam pontos de postura de actina F com uma intensidade de fluorescência rosa de pelo menos 50% acima da intensidade média de coloração na haste dendrítica em cada segmento selecionado.

Finalmente, calcule a densidade de acordo com a fórmula, expressando os dados como o número de pontos de F-actina por dez mícrons de dendrito. Aqui, as imagens de contraste de interferência diferencial demonstram as alterações morfológicas observadas no desenvolvimento de neurônios corticais de ratos fetais nos dias 4 a 27 en vitro. Observe o aumento no comprimento e no número de dendritos à medida que os neurônios primários de ratos cultivados amadurecem.

Como a marcação de F-actina com faloidina é muito rápida, é possível estimar visualmente a integridade da rede sinapto-dendrítica antes de prosseguir com a marcação imunocitoquímica de anticorpos. O Map2 cora os dendritos intactos, confirmando que os pontos de F-actina estão localizados nos dendritos neuronais e não localizados em outras células, como os astrócitos. Em imagens de alta resolução, estruturas ricas em F-actina contendo filopódios phi, saliências da coluna vertebral e manchas de F-actina podem ser observadas.

Neste experimento para avaliar o HIV 1 tat induz lesão sinapto-dendrítica, a coloração Map2 revelou menos ramos dendríticos e diminuição da F-actina em neurônios corticais de ratos após o tratamento com HIV 1 tat. De fato, os pontos de F-actina aumentam ou diminuem em resposta ao tratamento experimental. Por exemplo, neste experimento, quando os neurônios cultivados foram tratados com memantina, antagonista do receptor NMDA não competitivo, o puncta positivo para F-actina experimentou um aumento significativo na densidade.

Em contraste, o tratamento com a combinação de metanfetamina mais HIV1 tat resultou em uma perda significativa do F-actin puncta. Depois de adquirir imagens de alta resolução dos neurônios F-actina Map2 marcados com carvão, lembre-se de ter dois observadores treinados selecionando segmentos dos dendritos de segunda ordem para análise das densidades de pontos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa em neurociência.

Não apenas para o monitoramento da sinaptopatia aguda, mas também para o estudo da recuperação sináptica e processos experimentais de restauração neural. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um método confiável que meça a integridade sináptica da rede dendrítica neural.