Name: Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a quantificar F-actina em neurônios corticais de rato para avaliar integridade sináptica e plasticidade. Este protocolo combina cultura primária, imunocitoquímica e análise de imagens.

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Este trabalho foi financiado por doações do NIH DA013137, DA031604 e HD043680. O apoio parcial foi fornecido por uma bolsa de treinamento NIH T32 em ciências biomédicas-comportamentais.

Todos os protocolos de animais foram revistos e aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia: A3049-01). 1. baixa densidade Embryonic Neuronal Cultura <ol><li> Preparação para a primária neurônio cultura cortical <ol><li> soluções: <ol><li> Preparar a solução da poli-L-lisina por dissolução de 5 mg de poli-L-lisina em 10 ml de tampão de borato. </li><li> Preparar uma solução de trabalho por diluição de 1 ml de poli-L-lisina em 49 ml da tampão de Borato. </li><li> Preparar tampão de borato, pH 8,4, iniciando com 395 ml de dH 2 O e em seguida a adição de todos os ingredientes (1,24 g de ácido bórico + 1,9 g de bórax). Ajustar o pH para 8,4 com NaOH 1 M. Ajustar a 400 ml e filtrar com filtro de membrana de nylon 0,2 m sob o capô. </li><li> Preparar a solução de HBSS, pH 7,2, iniciando com 445 ml de dH 2 O e a adição de todos os outros ingredientes (50 mL de Stock 10X HBSS + 1,2 g de HEPES). Ajustar o pH para 7,2 com HCl 1 N, BRIng para 500 ml e filtrar com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô. </li><li> Prepare meio de plaqueamento: DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10%. Filtro com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô. </li><li> Preparar o meio de crescimento completo: Para 50 mL de meio Neurobasal, adicionar os suplementos (500 ul de GlutaMax (100X) + 500 ul de glucose + 1 ml de B-27 (50X) + 500 ul de solução de antibiótico-antimicótico (100X) + 100 ul de 7,5% Bicarbonato de sódio. Filtro com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô. </li></ol></li><li> Dois dias antes da cultura: <ol><li> Brasão de doze 35 mm pratos com fundo de vidro com 2 ml de solução de trabalho de poli-L-lisina, e manter sob o capô O / N. </li></ol></li><li> Um dia antes da cultura: <ol><li> Agente de revestimento vazio dos pratos e enxaguar com DDH 2 O. Permitir pratos para secar por uma hora sob o capô. </li><li> Prepare meio de plaqueamento (DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10% (10% da solução total). Pipeta 2 ml de meio emcada prato, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. Nota: É importante evitar a pratos de cultura de plástico, quando a cultura. Use de pratos com fundo de vidro (para microscópios invertidos) ou lamelas de vidro (para microscópios verticais) produz imagens nítidas e claras. Comparado a um prato de plástico de baixo, o prato com fundo de vidro evita tons indesejados ou brilho durante microscopia fluorescente. </li></ol></li></ol></li><li> Protocolo de cultura celular: <ol><li> Colocar refrigerado Tampão HBSS (100-150 ml), 100 mm pratos de petri, fórceps, tesouras, tubos de 50 ml e 15 ml tubos sob luz UV na capa. </li><li> Euthanize rato grávida de inalação letal de 5% sevoflurano sob o capô fora da sala de cultura. </li><li> Esterilizar com 70% de EtOH, tenda a pele da parte inferior do abdômen, utilizando fórceps durante o corte da cauda para cima no meio da cavity.Open abdominal do útero usando uma tesoura para expor a placenta. </li><li> Remover 8-10 E18 fetos. Place 8-10 fetos em placas de Petri contendo solução de HBSS. </li><li> Segure a parte de trás da cabeça do feto com uma pinça, em seguida, usar a tesoura para cortar a cabeça do corpo. Coloque-o em uma outra placa de petri preenchida com 5-7 ml de HBSS. Transferir prato para capuz. </li><li> Encha dois prato adicional petri 100 mm, com HBSS frio. </li><li> Peel lado crânio, e colher cérebro em uma nova placa de petri preenchida com HBSS. </li><li> Use uma pinça curvas acentuadas, cerebelo separada e tronco cerebral do cérebro, em seguida, transferir cérebro para uma nova placa de Petri com HBSS frio nele. </li><li> Use uma pinça para fixar, separar os hemisférios com uma pinça curva. Remover meninges; isolar córtex frontal e peças de transferência para marcados tubos de centrífuga de 15 ml. </li><li> Encha o tubo de 15 ml com frescos 2 ml HBSS e adicionar 20 ul de tripsina EDTA (10x mistura concentrada com 0,5% de tripsina e EDTA 5,3 mM.) A cada tubo de 15 ml. </li><li> Incubar 10-15 min à temperatura ambiente. Agite cuidadosamente tubo a cada poucos minutos, não permitem resolver. </li><li> After 10-15 min, o uso pipeta de vidro para remover velho HBSS e lavar duas vezes com HBSS novo. </li><li> Mergulhe na inibidor de tripsina (1 mg / ml, 2 mg Inibidor de tripsina em 2 ml de HBSS), misture bem e deixe descansar 5 min. Lavar duas vezes com HBSS fresco. </li><li> Usando uma pipeta de vidro com bulbo de borracha, pedaços de cérebro Triturar 10-15 vezes muito lentamente, de modo a evitar bubbles.Triturate novamente utilizando uma pipeta calibrada e uma ponta estéril com um diâmetro de ponta reduzida muito lentamente até à homogeneidade. </li><li> Transferência dissociada células a densidade desejada para pré-preparados pratos de cultura revestidos (50 células / mm2). Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Após 24 h, substitua meio DMEM / F12 com meio Neurobasal sem soro crescimento completo feitos na hora. </li><li> Manter as células em todos os momentos em CO 2/95% ar ambiente incubadora humidificada de 5% de, pelo menos, 12-14 dias antes da experimentação. Suplemento as células a cada 5-6 dias com meio Neurobasal fresco substituindo aproximadamente 50% do meio velho. </li></ol></li></ol> 2. Labeling fluorescentes e Imunocitoquï¿½ica Nota: A marcação imunofluorescente de culturas de células corticais primárias foi realizado em pratos de vidro de fundo de cultura de células de 35 mm com um volume de trabalho de 1 ml. <ol><li> Lava-se a placa com fundo de vidro duas vezes com tampão fosfato salino pH 7,4 (PBS). </li><li> Fixar as células com paraformaldeído a 4% durante 15 min à TA. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min. </li><li> Tratar as células durante 20 minutos à TA com uma coloração específica F-actina, AlexaFluor 488 faloidina (01:40, 25 ul de faloidina em 1 mL de PBS). </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS e bloquear com soro de cabra normal a 10% à temperatura ambiente durante 1-2 h. </li><li> Dilui-se o anticorpo policlonal anti-galinha MAP2 (1: 2500) em PBS com soro de cabra normal a 2% e incubar O / N a 4 o C. </li><li> Após a incubação, lavar duas vezes em PBS. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário (R AlexaEd cabra-594 conjugado anti-IgG de galinha (1: 500) com soro de cabra normal a 2% e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar com PBS e adicionar 10 mL / prato de Hoescht corante. </li><li> Incubar 3 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com PBS. Nota: As células marcadas agora pronto para o passo 3 (contagem de pontos lacrimais F-actina). </li><li> Preservar amostra de células com 100 ml de reagente Antifade como um agente de lamínula e manter a 4 ° C no escuro para armazenamento a longo prazo. Nota: faloidina é relativamente estável em PBS a 4 ° C no escuro durante 1 semana e fluorescência podem ser preservados com antifade reagentes lamínulas. No entanto, imagens óptimas são obtidas a partir de 1-3 dias após coloração com faloidina desde pode começar a difundir para fora com o armazenamento prolongado. </li></ol> Contando puncta 3. F-actina <ol><li> Ligue microscópio de fluorescência e mudar para 20 × objetiva. microscópio software Open, e configurar programa em 1280 × 960 pixels tamanho da imagem, e 0,1resolução de imagem / pixel 7 mm a 1 × zoom. </li><li> Adquirir imagens de co-marcado F-actina / neurônios MAP2 sob verde (495 nm) / vermelho (613 nm) canais fluorescentes. </li><li> Escolha 5 Green (F-actina) / vermelho (MAP2) immunolabeled / Blue (Hoescht) imagens fluorescentes de neurônio individual com mandris dendríticas claramente definidos. </li><li> Identificar os F-actina estruturas ricas em segunda ordem segmento dendríticas (gama de comprimento 25-75 mm) com imunofluorescência MAP2 contínua. </li><li> Gire a região selecionada de imagens para um nível horizontal. Copie e cole como uma nova imagem. </li><li> Subtrair o fundo das imagens, usando uma ajustes consistentes para cada prato. </li><li> Contar o puncta verde brilhante F-actina e traçar o comprimento do segmento dendrítica selecionados manualmente por observadores independentes treinados. Exportar os dados para um arquivo de planilha. </li><li> Calcula-se a densidade dividindo F-actina total de pontos lacrimais marcada (N) por o comprimento (L) da MAP2 marcado dendritos. Dados expressos como o número de F-acpontos lacrimais estanho por 10 uM de dendrite Nota: puncta (tamanho ≤1.5 uM) de fluorescência F-actina com uma intensidade de pico de pelo menos 50% superior à média de intensidade de coloração no eixo dendríticas foram incluídos em cada segmento seleccionado dendrítica. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse a declarar.

Neste protocolo, descrevemos a cultura de neurônios corticais de rato em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar dendritos de neurônios individuais. Em seguida, usamos faloidina e coloração MAP2 para detectar alterações dendríticas. Em seguida, foi utilizado um software especializado para quantificar mudanças na puncta F-actina. Para determinar mudanças na puncta F-actina toda a rede neuronal de um neurônio individual deve ser claramente visível, ...

O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método fiável de medição (estimativa) de integridade sináptica da rede dendrítica neuronal. Aqui nós descrevemos quantificação de puncta F-actina em ratos primário neurônios cultivados usando uma combinação de coloração faloidina e detecção imunocitoquímica (ICC) de dendrites com posterior análise usando software especializado (NIS-Elements). Falotoxina rotulados têm afinidade semelhante tanto para grandes e pequenos filamentos (F-actina), mas não se ligam a monomérica actina globular (G-actina), ao contrário de alguns anticorpos de actina 1. A ligação não específica de faloidina é insignificante, proporcionando assim fundo mínima durante imagiologia celular. Faloidina é muito menor do que os anticorpos que seria normalmente usado para marcar as proteínas celulares para a microscopia de fluorescência, o que permite muito mais intensa marcação da actina F por faloidina. Assim, imagens detalhadas de localização F-actina em neurônios pode serobtida através do uso de faloidina etiquetada. Phalloidin (F-actina) coloração das dendrites neuronais gera discretos &quot;pontos quentes&quot; ou brilhante &quot;puncta&quot;, que representam uma variedade de estruturas dendríticas, incluindo espinhas maduras, sinapses não-espinhosos 2 e espinhas imaturos. Espinhos imaturos incluem filopódios finas e algumas formas de morfologia remendo, e pode representar o início de spinogenesis 3. Espinhos imaturos e patches não-espinhosos falta PSD95 4. Mudanças na produção de chumbo F-actina para alterações subsequentes não só espinhos, mas também estruturas dendríticas adicionais, tornando assim faloidina uma ferramenta importante para a investigação de integridade synaptodendritic 5-7. Em geral, o número de (F-actina) puncta faloidina-positivos refletem um equilíbrio entre as sinapses ativas (excitatórios e inibitórios), dinâmica de actina e estabilidade sinapse 8. Embora seja importante para o estudo específico tYpes de sinapses (isto é, espinhas excitatórios), quando o alvo de um tratamento é desconhecido, é necessário primeiro estimar a integridade geral de uma variedade de estruturas dendríticas. Uma vez que a actina F é um componente importante das espinhas dendriticas e outras estruturas, incluindo sinapses inibitórias, um número alterado de pontos lacrimais F-actina pode indicar um synaptopathy. Este synaptopathy pode então ser mais investigada para alterações mais específicos. O nosso método de quantificação para a detecção de vários tipos / sinápticas estruturas produz uma estimativa global das alterações sinápticas dendríticas (aumentos e diminuições) após vários tratamentos experimentais.

<table><tbody><tr><td>Pratos com Fundo de Vidro de 35 mm No. 1.5 lamínula</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico solução</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tesoura</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo normal</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Frango policlonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-conjugado cabra anti-frango IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Coloração de células vivas ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements pacote de software</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E microscópio fluorescente invertido controlado por computador&nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Filtro de membrana de nylon</td><td>Nalgene Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de filamentosas actina (f-actina) puncta no rat neurônios corticais

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

proteína actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na spinogenesis, plasticidade sináptica, e estabilidade sináptica. Mudanças nas estruturas ricas F-actina dendríticas sugerem alterações na integridade sináptica e conectividade. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de rato primária neurônios corticais, coloração faloidina para puncta F-actina, e técnicas de quantificação subsequentes. Em primeiro lugar, o córtex frontal de embriões de rato E18 são dissociados em cultura celular de baixa densidade, em seguida, os neurónios cultivados in vitro durante pelo menos 12-14 dias. Após o tratamento experimental, os neurônios corticais estão manchadas com AlexaFluor 488 faloidina (para rotular o puncta F-actina dendrítica) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2; para validar as células neuronais e integridade dendrítica). Finalmente, software especializado é usado para analisar e quantificar dendrites neuronais selecionados aleatoriamente. F-actina estruturas ricas são identificados na segunda ordem ramos dendríticas (variação de comprimento 25-75 &amp;# 181; m) com imunofluorescência MAP2 contínua. O protocolo apresentado aqui vai ser um método útil para investigar mudanças nas estruturas sinapse dendríticas subsequentes aos tratamentos experimentais.

Nos presentes métodos, primeiro cultura rato neurônios corticais em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar os dendritos de neurônios individuais. Na Figura 1, o contraste interferência diferencial (DIC) imagens mostram as alterações morfológicas no desenvolvimento de rato fetal neurônios corticais nos dias 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Note-se que o comprimento e o número de dendritos aumentar com a maturação de ne...

A actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na espinogênese, plasticidade sináptica e estabilidade sináptica. A quantificação de pontos de F-actina é, portanto, uma ferramenta útil para estudar a integridade das estruturas sinápticas. Este protocolo descreve os procedimentos de quantificação de pontos de F-actina marcados com faloidina em culturas neuronais corticais primárias de baixa densidade.

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

O objetivo geral desta Quantificação de Pontos de Actina Filamentosa em Neurônios Cultivados é apresentar um método útil para estudar a integridade e a cognitividade das estruturas sinápticas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da neurociência sobre espinogênese, plasticidade sináptica e estabilidade sináptica. A principal vantagem desta técnica é que fornece um protocolo detalhado para cultura neuronal primária, seguido da identificação e quantificação de pontos de F-actina.Quando o alvo de avaliação é desconhecido, é necessário estimar a integridade geral das estruturas fundânticas da retina. Tivemos a ideia inicial deste método ao estudar os danos neuronais induzidos por drogas de abuso, como a cocaína, e por proteínas tóxicas do HIV, como a tat e a JP 120. Dois dias antes de preparar o cultivo, recubra 12 placas de vidro de fundo com diâmetro de 35 mm com dois mililitros de solução de trabalho de poli-L-lisina. Em seguida, armazene as placas no fluxo laminar durante a noite para manter sua esterilidade.No dia seguinte, descarte o agente de revestimento e lave as placas com água bidestilada. Deixe as placas secarem por uma hora sob a capela. Em seguida, transfira dois mililitros de meio de plaqueamento para cada placa.E incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. No dia do cultivo, colocar o cérebro colhido em uma placa de Petri contendo HBSS frio. Em seguida, segurando o cérebro com pinças, usar a pinça curva para separar os hemisférios e remover as meninges.Isole os córtices frontais e transfira os fragmentos para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Adicione dois mililitros de HBSS fresco e 20 microlitros de tripsina-EDTA ao tubo, e incube os tecidos neurais por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente, com suave agitação a cada poucos minutos.No final da incubação, use uma pipeta de vidro para aspirar todo o HBSS antigo. E lave os córtices duas vezes com HBSS fresco. Após a segunda lavagem, imerja o tecido no inibidor de tripsina.Agite bem e deixe a amostra repousar por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os tecidos duas vezes com HBSS fresco. Agora, use uma pipeta de vidro com uma bolsa de borracha para triturar muito lentamente os pedaços de cérebro de 10 a 15 vezes.Em seguida, utilizando uma pipeta calibrada equipada com ponteira estéril de diâmetro reduzido, triture novamente muito lentamente a suspensão de tecido. Quando a solução estiver homogênea, plaque as células na densidade apropriada em placas de cultura pré-revestidas para uma incubação noturna na incubadora de cultura celular. Após 24 horas, substitua o meio de plaqueamento por meio basal restrito completo, sem soro, recém-preparado.Retorne as células ao incubador de cultivo celular por pelo menos 12 a 14 dias. O plaqueamento em baixa densidade é importante para a visualização dos neurônios individuais. E o meio basal para neurônios é essencial para minimizar a perfuração dos astrocitos dentro das culturas celulares.Para marcar as células para imunocitoquímica, lave primeiro o recipiente de cultura celular com fundo de vidro duas vezes com PBS. Em seguida, fixe as células com paraformaldeído a quatro por cento durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após isso, realize duas lavagens com PBS.Em seguida, permeabilize as células com Triton X-100 a 0,1 por cento em PBS por cinco minutos e marque-as com um corante específico para F-actina à temperatura ambiente. Após 20 minutos, lave as células duas vezes com PBS e bloqueie qualquer marcação não específica na superfície celular com soro de cabra normal a 10%. Ao final da incubação, marque as células durante a noite a quatro graus Celsius com anticorpo anti-map dois policlonal de galinha.Na manhã seguinte, lave as células duas vezes com PBS e marque-as com o anticorpo secundário apropriado. Após duas horas à temperatura ambiente, lave novamente as células com PBS e marque-as com 10 microlitros de huxs durante três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células mais duas vezes com PBS e preserve-as com 100 microlitros de reagente anti-desvanecimento.Em até três dias após essa coloração, ligue o microscópio de fluorescência e selecione a objetiva de 20 X. Em seguida, no software do microscópio, defina o tamanho da imagem em pixels como 1600 por 1200 e a resolução da imagem de 0,17 mícron por pixel para zoom 1 X. Transfira o recipiente com as células para a platina do microscópio.E adquira imagens do mapa de F-actina duplamente marcado em neurônios MAP2 nos canais fluorescentes verde e vermelho. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, escolha cinco imagens de neurônios individuais nos canais verde, vermelho e azul com arborações dendríticas bem definidas. E utilize imunofluorescência contínua com MAP2 para identificar as estruturas ricas em F-actina nos segmentos dendríticos da segunda ordem.Gire horizontalmente a região selecionada de imagens. Em seguida, copie e cole a região como uma nova imagem. Depois, subtraia a fluorescência de fundo da imagem e utilize o software para contar o número de pontos brilhantes verdes de F-actina.Utilize observadores independentes treinados para medir o comprimento dos segmentos dendríticos selecionados. Em seguida, exporte os números de pontuações e os dados de comprimento dos segmentos dendríticos para um arquivo de planilha. Certifique-se de que os observadores incluam pontuações de postura de F-actina com intensidade de fluorescência rosa de pelo menos 50% acima da intensidade média da marcação no eixo dendrítico em cada segmento selecionado.Por fim, calcule a densidade de acordo com a fórmula, expressando os dados como o número de pontos de F-actina por dez mícrons de dendrito. Aqui, imagens de contraste de interferência diferencial demonstram as alterações morfológicas observadas em neurônios corticais fetais de rato em desenvolvimento nos dias 4 a 27 em cultura. Observe o aumento no comprimento e no número de dendritos conforme os neurônios primários de rato em cultura amadurecem.Como a marcação de F-actina com faloidina é muito rápida, é possível estimar visualmente a integridade da rede sinapto-dendrítica antes de prosseguir com a marcação por anticorpos para imunocitoquímica. O Map2 marca os dendritos intactos, confirmando que as puncta de F-actina estão localizadas nos dendritos neuronais e não em outras células, como astrócitos. Em imagens de alta resolução, é possível observar estruturas ricas em F-actina que contêm filopódios phi, protrusões de espinhos e manchas de F-actina.Neste experimento para avaliar a lesão sinapto-dendrítica induzida pelo HIV-1 tat, a marcação para Map2 revelou menor número de ramificações dendríticas e redução do F-actina em neurônios corticais de ratos após o tratamento com o HIV-1 tat. De fato, os pontos de F-actina aumentam ou diminuem em resposta ao tratamento experimental. Por exemplo, neste experimento, quando os neurônios em cultura foram tratados com o antagonista não competitivo do receptor NMDA, memantina, os pontos positivos para F-actina apresentaram um aumento significativo na densidade.Em contraste, o tratamento com a combinação de metanfetamina mais HIV1 tat resultou em uma perda significativa dos pontos de F-actina. Após adquirir imagens de alta resolução dos neurônios Map2 marcados para F-actina, lembre-se de que dois observadores treinados devem selecionar segmentos das dendrites de segunda ordem para análise das densidades dos pontos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa em neurociência.Não apenas para o monitoramento da sinaptopatia aguda, mas também para o estudo da recuperação sináptica e de processos experimentais de restauração neural. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver um método confiável para medir a integridade sináptica da rede dendrítica neural.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Um método de visualizar e quantificar F-actina termina farpado em cones de crescimento neuronal é descrito. Depois de neurônios cultura em lamínulas, as células são permeabilizadas com uma solução contendo saponina. Em seguida, um de incubação curto com o buffer contendo saponina rodamina-actina incorpora actina fluorescente para fins de actina livre farpado.

Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal

Este vídeo demonstra o procedimento para coloração fluorescente de neurônios corticais de ratos para microscopia. Ele tem como alvo a F-actina e as proteínas dendríticas para analisar a integridade estrutural e calcular a densidade da F-actina, que é crucial para estudar a função e a saúde neuronal.

Quantificação de pontos filamentosos de actina em neurônios corticais de ratos

Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

O presente protocolo descreve um método para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial do axônio usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM).

Propriedades de medição do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial de axônio usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM)

Aprenda a quantificar F-actina em neurônios corticais de rato para avaliar integridade sináptica e plasticidade. Este protocolo combina cultura primária, imunocitoquímica e análise de imagens.

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

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