Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

O objetivo geral desta Quantificação de Pontos de Actina Filamentosa em Neurônios Cultivados é apresentar um método útil para estudar a integridade e a cognitividade das estruturas sinápticas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da neurociência sobre espinogênese, plasticidade sináptica e estabilidade sináptica. A principal vantagem desta técnica é que fornece um protocolo detalhado para cultura neuronal primária, seguido da identificação e quantificação de pontos de F-actina.

Quando o alvo de avaliação é desconhecido, é necessário estimar a integridade geral das estruturas fundânticas da retina. Tivemos a ideia inicial deste método ao estudar os danos neuronais induzidos por drogas de abuso, como a cocaína, e por proteínas tóxicas do HIV, como a tat e a JP 120. Dois dias antes de preparar o cultivo, recubra 12 placas de vidro de fundo com diâmetro de 35 mm com dois mililitros de solução de trabalho de poli-L-lisina. Em seguida, armazene as placas no fluxo laminar durante a noite para manter sua esterilidade.

No dia seguinte, descarte o agente de revestimento e lave as placas com água bidestilada. Deixe as placas secarem por uma hora sob a capela. Em seguida, transfira dois mililitros de meio de plaqueamento para cada placa.

E incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. No dia do cultivo, colocar o cérebro colhido em uma placa de Petri contendo HBSS frio. Em seguida, segurando o cérebro com pinças, usar a pinça curva para separar os hemisférios e remover as meninges.

Isole os córtices frontais e transfira os fragmentos para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Adicione dois mililitros de HBSS fresco e 20 microlitros de tripsina-EDTA ao tubo, e incube os tecidos neurais por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente, com suave agitação a cada poucos minutos.

No final da incubação, use uma pipeta de vidro para aspirar todo o HBSS antigo. E lave os córtices duas vezes com HBSS fresco. Após a segunda lavagem, imerja o tecido no inibidor de tripsina.

Agite bem e deixe a amostra repousar por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os tecidos duas vezes com HBSS fresco. Agora, use uma pipeta de vidro com uma bolsa de borracha para triturar muito lentamente os pedaços de cérebro de 10 a 15 vezes.

Em seguida, utilizando uma pipeta calibrada equipada com ponteira estéril de diâmetro reduzido, triture novamente muito lentamente a suspensão de tecido. Quando a solução estiver homogênea, plaque as células na densidade apropriada em placas de cultura pré-revestidas para uma incubação noturna na incubadora de cultura celular. Após 24 horas, substitua o meio de plaqueamento por meio basal restrito completo, sem soro, recém-preparado.

Retorne as células ao incubador de cultivo celular por pelo menos 12 a 14 dias. O plaqueamento em baixa densidade é importante para a visualização dos neurônios individuais. E o meio basal para neurônios é essencial para minimizar a perfuração dos astrocitos dentro das culturas celulares.

Para marcar as células para imunocitoquímica, lave primeiro o recipiente de cultura celular com fundo de vidro duas vezes com PBS. Em seguida, fixe as células com paraformaldeído a quatro por cento durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após isso, realize duas lavagens com PBS.

Em seguida, permeabilize as células com Triton X-100 a 0,1 por cento em PBS por cinco minutos e marque-as com um corante específico para F-actina à temperatura ambiente. Após 20 minutos, lave as células duas vezes com PBS e bloqueie qualquer marcação não específica na superfície celular com soro de cabra normal a 10%. Ao final da incubação, marque as células durante a noite a quatro graus Celsius com anticorpo anti-map dois policlonal de galinha.

Na manhã seguinte, lave as células duas vezes com PBS e marque-as com o anticorpo secundário apropriado. Após duas horas à temperatura ambiente, lave novamente as células com PBS e marque-as com 10 microlitros de huxs durante três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células mais duas vezes com PBS e preserve-as com 100 microlitros de reagente anti-desvanecimento.

Em até três dias após essa coloração, ligue o microscópio de fluorescência e selecione a objetiva de 20 X. Em seguida, no software do microscópio, defina o tamanho da imagem em pixels como 1600 por 1200 e a resolução da imagem de 0,17 mícron por pixel para zoom 1 X. Transfira o recipiente com as células para a platina do microscópio.

E adquira imagens do mapa de F-actina duplamente marcado em neurônios MAP2 nos canais fluorescentes verde e vermelho. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, escolha cinco imagens de neurônios individuais nos canais verde, vermelho e azul com arborações dendríticas bem definidas. E utilize imunofluorescência contínua com MAP2 para identificar as estruturas ricas em F-actina nos segmentos dendríticos da segunda ordem.

Gire horizontalmente a região selecionada de imagens. Em seguida, copie e cole a região como uma nova imagem. Depois, subtraia a fluorescência de fundo da imagem e utilize o software para contar o número de pontos brilhantes verdes de F-actina.

Utilize observadores independentes treinados para medir o comprimento dos segmentos dendríticos selecionados. Em seguida, exporte os números de pontuações e os dados de comprimento dos segmentos dendríticos para um arquivo de planilha. Certifique-se de que os observadores incluam pontuações de postura de F-actina com intensidade de fluorescência rosa de pelo menos 50% acima da intensidade média da marcação no eixo dendrítico em cada segmento selecionado.

Por fim, calcule a densidade de acordo com a fórmula, expressando os dados como o número de pontos de F-actina por dez mícrons de dendrito. Aqui, imagens de contraste de interferência diferencial demonstram as alterações morfológicas observadas em neurônios corticais fetais de rato em desenvolvimento nos dias 4 a 27 em cultura. Observe o aumento no comprimento e no número de dendritos conforme os neurônios primários de rato em cultura amadurecem.

Como a marcação de F-actina com faloidina é muito rápida, é possível estimar visualmente a integridade da rede sinapto-dendrítica antes de prosseguir com a marcação por anticorpos para imunocitoquímica. O Map2 marca os dendritos intactos, confirmando que as puncta de F-actina estão localizadas nos dendritos neuronais e não em outras células, como astrócitos. Em imagens de alta resolução, é possível observar estruturas ricas em F-actina que contêm filopódios phi, protrusões de espinhos e manchas de F-actina.

Neste experimento para avaliar a lesão sinapto-dendrítica induzida pelo HIV-1 tat, a marcação para Map2 revelou menor número de ramificações dendríticas e redução do F-actina em neurônios corticais de ratos após o tratamento com o HIV-1 tat. De fato, os pontos de F-actina aumentam ou diminuem em resposta ao tratamento experimental. Por exemplo, neste experimento, quando os neurônios em cultura foram tratados com o antagonista não competitivo do receptor NMDA, memantina, os pontos positivos para F-actina apresentaram um aumento significativo na densidade.

Em contraste, o tratamento com a combinação de metanfetamina mais HIV1 tat resultou em uma perda significativa dos pontos de F-actina. Após adquirir imagens de alta resolução dos neurônios Map2 marcados para F-actina, lembre-se de que dois observadores treinados devem selecionar segmentos das dendrites de segunda ordem para análise das densidades dos pontos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa em neurociência.

Não apenas para o monitoramento da sinaptopatia aguda, mas também para o estudo da recuperação sináptica e de processos experimentais de restauração neural. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver um método confiável para medir a integridade sináptica da rede dendrítica neural.