In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina
8 de janeiro de 2016
Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.
O objetivo geral da imagem bioluminescente é obter imagens in vivo do transiente funcional do cálcio, um proxy para a atividade, por períodos mais longos e em estruturas cerebrais profundas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como como é a atividade basal do cérebro da mosca durante o sono. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer excitação usando o laser.
Isso permite obter imagens transitórias de cálcio mais profundamente no tecido e por um longo período de tempo sem o fotobranqueamento e a toxicidade, em comparação com a imagem clássica de cálcio. Este método pode fornecer informações sobre a atividade cerebral basal na drosófila e também pode ser usado com outros organismos modelo, como o camundongo. Para começar, prepare a linha de interesse de drosophila melanogaster e as soluções experimentais, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.
Em seguida, anestesiar com gelo uma única drosófila, transferindo-a para um frasco de vidro no gelo por dois minutos. Em seguida, mova a mosca para uma placa de Petri resfriada e use uma pinça para colocar suavemente a mosca dentro de uma ponta de pipeta de 1000 microlitros, aparada de forma que a ponta fique em um ângulo de aproximadamente 35 graus. Usando uma escova, empurre e alinhe suavemente cada mosca de modo que a cabeça fique completamente além da borda da ponta e a região dorsal fique parcialmente exposta.
Em seguida, aplique cola dental preparada da cabeça até a borda da ponta da pipeta. Tome cuidado extra para evitar o topo da cabeça. A colagem da cabeça é fundamental porque prendê-la na posição correta é essencial para uma dissecção e imagem bem-sucedidas.
Além disso, a má colagem levará ao vazamento da solução de ringer e à morte da amostra antes da imagem. Em seguida, coloque a ponta da pipeta, com a mosca anexada, através do orifício na câmara de gravação e pressione suavemente para prendê-la no lugar. Em seguida, use uma cola de silicone preparada para prender o lado plano da câmara onde ela encontra a ponta da pipeta, a fim de evitar vazamentos.
Fixe um pedaço de torneira sobre o canal de profusão, a borda curta e estendendo-se até a parte de trás da câmara. Em seguida, coloque a câmara com a mosca sob o microscópio e ligue a lâmpada fluorescente. Em seguida, pipete um mililitro de solução de campainha para a câmara.
Usando uma faca cirúrgica fina, faça incisões paralelas da parte de trás da cabeça da mosca até a região antenal em ambos os lados. Em seguida, corte ao longo da borda do olho e faça uma incisão perpendicular acima da antena que conecta as incisões anteriores. Faça uma incisão final na parte de trás da cabeça e, em seguida, use uma pinça fina e afiada para remover a cutícula.
Segure e limpe suavemente qualquer tecido respiratório exposto até que o cérebro e o corpo do cogumelo fluorescente sejam claramente visualizados. Em seguida, use uma pinça ultra-afiada para agarrar e beliscar cuidadosamente o tecido do epitélio neural que cobre o cérebro para removê-lo e permitir a permeação da celenterazina. Usando uma pipeta, lave o tecido duas vezes com um mililitro de solução de ringer para remover quaisquer detritos que sobraram da dissecção e, em seguida, coloque a amostra em uma caixa escura.
Em seguida, pipete um mililitro de solução de ringer, contendo cinco benzil-celenterazina micromolar na câmara. Feche a caixa e incube a amostra à temperatura ambiente por no mínimo duas horas. Comece ligando o microscópio no computador.
Além disso, resfrie a câmera para 80 graus Celsius negativos. Em seguida, configure o sistema de drenagem e ajuste os controles ambientais para 20 graus Celsius. Em seguida, abra o gerador de imagens de fótons, crie uma nova pasta e nomeie a primeira gravação.
Em seguida, configure o sistema de profusão adicionando o cloreto de potássio, a nicotina e a solução de ringer aos seus respectivos reservatórios. Ajuste o fluxo para que cada solução descarregue a dois mililitros por minuto. Em seguida, coloque a amostra no suporte sob o microscópio e ajuste a ampliação para 5X.
Em seguida, insira o tubo de profusão no canal através da punção. Defina o microscópio para o modo fluorescente e, em seguida, centralize e coloque os corpos dos cogumelos em foco. Quando os corpos dos cogumelos estiverem em foco, altere a ampliação para 20X.
Recentralize a imagem e ajuste o foco. Em seguida, posicione o aparelho de drenagem sobre a piscina de drenagem e ajuste a altura do shunt de drenagem, de modo que a ponta fique logo acima da piscina de drenagem. Em seguida, lave a amostra com solução de ringer por 30 segundos para verificar se há drenagem adequada.
Por fim, puxe a blindagem para baixo para vedar o aparelho de qualquer luz externa. Usando o sistema automatizado no programa de imagem de fótons, faça ajustes finos no foco e obtenha uma imagem fluorescente de referência dos corpos dos cogumelos. Ajuste a velocidade do fóton para a velocidade de gravação desejada, que deve ser de uma imagem a cada 50 milissegundos até uma a cada segundo ou mais.
Em seguida, selecione o modo de fóton e abra o obturador. Em seguida, insira o genótipo, sexo, idade e número da amostra nas entradas de log. Ajuste a posição das caixas da região de interesse sobre o cálice, os corpos celulares e os lobos mediais, clicando nas caixas e arrastando-as para a posição enquanto mantém o controle.
Agora, registre os valores da linha de base por cerca de cinco a 10 minutos. Em seguida, ligue o interruptor para iniciar o fluxo de nicotina. Ao mesmo tempo, pressione enter e adicione uma nota para indicar que o fluxo de nicotina começou.
Após um minuto, pare o fluxo e faça outra anotação no log significando que o fluxo foi interrompido. Em seguida, lave a amostra com solução de campainha por cinco minutos. Enquanto a amostra se recupera, desligue a lavagem, ajuste o cronômetro para mais cinco minutos e prepare-se para iniciar o fluxo de cloreto de potássio.
Quando estiver pronto para começar, inicie o fluxo de cloreto de potássio e insira 100 millimolares de cloreto de potássio no registro de amostra. Após um minuto, pare o fluxo e insira o cloreto de potássio desligado "no registro de amostra. Em seguida, lave a amostra com solução de campainha por um minuto e mude o microscópio para o modo fluorescente.
Tire uma imagem fluorescente final e, em seguida, desligue a solução de campainha e remova a amostra. No programa de análise, abra o primeiro arquivo, selecione a guia "controle de exibição" e clique em ROI. Em seguida, segure o controle e selecione uma região de interesse.
Em seguida, ajuste o tamanho, a orientação e a forma das ROIs para abranger o cálice iluminado GFP e os corpos celulares e os lobos mediais. Depois que todas as regiões de interesse forem adicionadas, selecione o filme"guia para reproduzir o vídeo do fóton. Ajuste a segunda largura e os segundos passos conforme desejado.
Em seguida, reajuste o posicionamento do ROI conforme necessário, para que ele permaneça dentro das regiões ativas no vídeo. Selecione algumas capturas de tela representativas da fluorescência GFP, da resposta da nicotina e da resposta do cloreto de potássio. Em seguida, corte as capturas de tela e cole as imagens representativas em um slide de apresentação para análise e comparação tardias.
Ajuste a segunda largura e a segunda etapa para a velocidade de gravação em segundos. Além disso, selecione a duração da análise movendo os marcadores cinza no painel superior para a região entre colchetes, antes do início do estímulo e logo após o término da resposta. Em seguida, selecione suspender visualizações"durante a reprodução e pressione o botão retroceder para redefinir a reprodução do vídeo para o início, seguido pelo botão reproduzir.
Em seguida, selecione o tabela de taxas de contagem de guias"para ajustar as unidades e também ajustar a cor das regiões de interesse, bem como as cores das linhas conforme desejado. Quando a análise for concluída, selecione exportar dados de taxa de contagem. Em seguida, selecione as gravações combinadas do cálice e dos corpos celulares, bem como as das regiões do lobo medial de cada lado e cole essas imagens em um slide com as imagens de resposta.
Uma das maneiras mais simples de estimular os corpos dos cogumelos é através da ativação dos receptores nicotínicos ionotrópicos de acetilcolina. A resposta típica à nicotina 25 micromolar, mostrada aqui, começa com a ativação rápida do cálice e dos corpos celulares e dos lobos mediais, e usa a construção GFP-aequorina fundida, que se liga ao cálcio e emite luz. Geralmente, a resposta no cálice e nos corpos celulares dura mais tempo e exibe uma resposta bioluminescente maior do que os lobos, como mostrado nos painéis sequenciais da resposta.
Um registro de amostra da resposta bioluminescente à ativação nicotínica ao longo do tempo é descrito por este gráfico, onde o número de fótons na região de interesse contendo o cálice e os corpos celulares é representado graficamente em preto e o número de fótons na região do lobo medial é mostrado em vermelho. A partir deste gráfico, o comprimento da resposta, o valor do fóton de pico durante a resposta e a área total sob cada curva podem ser determinados. Uma vez dominada, a fase de preparação deve levar apenas duas horas antes da incubação, dependendo do número de moscas.
Além disso, cada gravação pode ser concluída em menos de vinte minutos, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de envelhecer e manter adequadamente o estoque de moscas para garantir a reprodutibilidade entre as amostras. Seguindo este procedimento, outros testes comportamentais podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o efeito que a atividade da estrutura tem sobre o comportamento específico.
O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem a atividade neural de longo prazo no cérebro da drosófila. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras para imagens bioluminescentes no cérebro da mosca. Não se esqueça de que a nicotina pode ser perigosa para sua saúde.
Precauções como luvas devem ser tomadas ao preparar soluções ou limpar este procedimento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma técnica inovadora de imagem bioluminescente para a aquisição funcional de transientes de cálcio in vivo. O método utiliza um construto GFP-aequorina que se liga ao Ca2+ e emite luz, permitindo a aquisição de imagens de longa duração em estruturas cerebrais profundas sem a necessidade de excitação a laser.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurobiologia
- Imagem de cálcio
- Imagem bioluminescente
Contexto
- Transientes de cálcio são indicadores da atividade neuronal.
- Técnicas tradicionais de imagem de cálcio podem causar fotodegradação e toxicidade.
- A obtenção de imagens de estruturas cerebrais profundas é desafiadora com métodos convencionais.
- Compreender a atividade basal do cérebro é essencial para a pesquisa neurobiológica.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a imagem de longa duração de transientes de cálcio.
- Permitir a imagem em regiões cerebrais profundas.
- Fornecer insights sobre a atividade basal do cérebro da mosca durante o sono.
Métodos Utilizados
- Utilização de um construto fusionado GFP-aequorina.
- Preparação de linhagens de Drosophila melanogaster para imageamento.
- Soluções experimentais conforme descritas no protocolo.
- Imageamento in vivo sem excitação a laser.
Resultados Principais
- Imagem de longo prazo bem-sucedida de transientes de cálcio em Drosophila.
- Capacidade de acessar estruturas cerebrais profundas sem fotobranqueamento.
- Conhecimentos sobre a atividade basal do cérebro da mosca.
- Aplicabilidade potencial a outros organismos modelo, como camundongos.
Conclusões
- A técnica de imagem bioluminescente oferece vantagens significativas em comparação com os métodos clássicos.
- Este método pode aprimorar nossa compreensão dos processos neurobiológicos.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esta técnica para diversos organismos modelo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de cálcio bioluminescente utilizando GFP-aequorina permite a aquisição funcional de longa duração em tecidos profundos in vivo, sem necessidade de excitação a laser, superando limitações importantes como o fotobranqueamento e a toxicidade presentes nas técnicas tradicionais de imagem de cálcio. Esta abordagem possibilita o monitoramento contínuo da atividade neuronal em circuitos neurais complexos, fornecendo um indicador dos estados basal e estimulado do cérebro, relevantes para a neurofarmacologia e a validação de alvos. O método aumenta a confiabilidade preditiva em modelos pré-clínicos ao permitir leituras reprodutíveis e quantitativas da dinâmica do cálcio ao longo de períodos prolongados, facilitando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição de transientes de cálcio como um indicador direto da ativação neuronal em resposta a estímulos farmacológicos.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de imagens contínuas com alta resolução temporal de fluxos intracelulares de cálcio em populações neurais geneticamente definidas.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no engajamento do alvo e na modulação da via ao capturar tanto transientes de cálcio por entrada celular quanto sinais de cálcio liberados do estoque ao longo do tempo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera sistemas biológicos transgênicos estáveis (por exemplo, Drosophila, camundongo) com expressão direcionada de GFP-aequorina para medições consistentes e reprodutíveis de fluxo de cálcio.
- Saída quantitativa: Fornece leituras baseadas na contagem de fótons que permitem análise cinética de respostas induzidas por agonistas, como nicotina ou cloreto de potássio, apoiando a determinação de curvas dose-resposta e de valores de CE50.
- Escalabilidade: Compatível com sistemas de perfusão e plataformas automatizadas de imageamento de fótons, permitindo triagem padronizada de compostos em múltiplos genótipos e condições.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Facilita o estudo de circuitos de aprendizado e memória (por exemplo, corpos pedunculados em Drosophila) nos quais a sinalização de cálcio está implicada na função cognitiva e em transtornos neuropsiquiátricos.
- Continuidade Translacional: Permite a imagem longitudinal desde a atividade basal até desafios farmacológicos e recuperação, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco em etapas pré-clínicas.
- Redução de Incertezas Mecanísticas: Reduz a ambiguidade no mecanismo alvo ao associar a exposição ao composto com dinâmicas de cálcio mensuráveis em tempo real em tecido neural intacto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce como uma leitura funcional após o engajamento do alvo, conectando ensaios bioquímicos e triagem fenotípica mediante a validação baseada em atividade em tempo real da modulação de alvos neurais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da obtenção de imagens de respostas de cálcio a neuromoduladores (por exemplo, nicotina) em regiões cerebrais definidas, permitindo a redução de riscos de alvos envolvidos na sinalização sináptica.
- Triagem: Fornece dados reprodutíveis e quantitativos de fluxo de cálcio por meio de contagem de fótons, permitindo a comparação da eficácia e da duração da ação de compostos entre grupos experimentais.
- Análises: Gera curvas de taxa de contagem e métricas de área sob a curva que permitem às equipes comparar magnitude da resposta, cinética e recuperação entre condições, apoiando a análise de relação estrutura-atividade (SAR).
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir a obtenção de imagens em circuitos conservados (por exemplo, corpos pedunculados) implicados em respostas comportamentais, com aplicabilidade a modelos de mamíferos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudos longitudinais, reduzindo a necessidade de preparação repetida de modelos e apoiando a padronização entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao permitir a observação direta da atividade neuronal mediada por cálcio, sem artefatos de fototoxicidade ou esvaecimento fluorescente.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio de repórteres geneticamente codificados e sistemas de perfusão controlados, minimizando a variabilidade entre ensaios e laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao fornecer dados funcionais sustentados e de alta resolução que reduzem a eliminação em estágios avançados por efeitos inesperados nas redes neurais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis quantitativos de resposta ao cálcio, apoiando a eficiência de capital na otimização de fármacos líderes.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em sistemas genéticos modelo (por exemplo, GAL4/UAS em Drosophila) e biologia molecular para geração e validação de linhagens transgênicas.
- Depende de infraestrutura para detecção de fótons, incluindo câmeras refrigeradas (-80°C), detectores de fótons e sistemas de perfusão para troca de solução.
- Necessita padronização dos protocolos de carregamento com coelenterazina, tempos de incubação e gravação da linha de base para garantir comparabilidade entre amostras.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir a abordagem entre espécies (por exemplo, camundongo versus mosca) devido a diferenças na penetração da barreira hematoencefálica e entrega de cofatores.
- Limitações práticas incluem a necessidade de condições de ambiente escuro durante a detecção de fótons e o manuseio cuidadoso da coelenterazina, que é sensível à luz e requer preparo fresco.
