Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em Arabidopsis Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

O objetivo geral desta preparação de seção transversal anatômica é quantificar o acúmulo relativo de cristal e celulose na resolução celular, permitindo comparações diretas entre os diferentes tecidos na raiz primária de Arabidopsis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia e desenvolvimento vegetal, como como a composição celular de um determinado tipo de célula afeta o crescimento de um órgão inteiro. Após esterilizar as sementes de Arabidopsis de acordo com o protocolo de texto, espalhe as sementes estéreis em placas contendo 0,8% de ágar planta e meio 0,5XM.

Com o parafilme, embrulhe as placas e cubra com papel alumínio. Armazene as placas a 4 graus Celsius por um a quatro dias para promover uma germinação uniforme. Em seguida, transfira as placas para uma câmara de crescimento adequada para o cultivo de mudas de Arabidopsis, orientando as placas verticalmente para manter o crescimento das raízes no topo do meio de ágar Prepare a solução de Richardson de acordo com o protocolo de texto Filtre através de uma unidade de filtro PVD de 0,22 mícron acionada por seringa antes de usar.

Em seguida, sob uma capa química, prepare 50 mililitros de fixador combinando 38 ml de cacodilato de sódio 0,5M com 2,5 ml de glutaraldeído. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de Richardson à solução de fixação para gerar a solução de fixação final. Use uma placa pré-marcada e, em seguida, coloque 2 a 3 ml de solução de fixação final nos poços para que a solução cubra totalmente as mudas.

Usando uma pinça de plástico, transfira cuidadosamente até 10 mudas para cada poço. Use parafilme para selar as placas antes de armazená-las no escuro a 4 graus Celsius por pelo menos uma noite e até uma semana. Para desidratar as mudas fixas, use uma pinça para pegar as plantas e transferi-las para os poços de novas placas de seis poços marcadas contendo concentrações crescentes de etanol para os tempos listados aqui.

Prepare o meio de infiltração em um pequeno frasco de vidro misturando o conteúdo de um saco de Historesin Activator com 50ml de líquido de resina básica. Insira um ímã e mexa a solução na placa de agitação por 20 minutos. Encha os poços rotulados de uma placa de seis poços com 2 a 3 ml de meio de infiltração.

Então, quando as mudas estiverem totalmente desidratadas, use uma pinça para transferi-las da solução de etanol a 95% para o meio de infiltração, garantindo que estejam totalmente cobertas pelo meio. Armazene as amostras a 4 graus Celsius por pelo menos quatro dias para garantir a máxima penetração nos tecidos vegetais. Para preparar os blocos, coloque pequenas etiquetas marcadas a lápis com o nome da amostra dentro de cada poço incorporando moldes.

Prepare o meio de incorporação adicionando 1ml de endurecedor a 15ml de meio de infiltração. Com cerca de 200 microlitros de meio de incorporação, encha metade de cada poço no molde. E use um pedaço de filme suspenso para cobrir o molde com 1 ml extra de cada lado.

Incube os moldes em temperatura ambiente por pelo menos duas horas para permitir a polimerização parcial. Em seguida, prepare um lote adicional de meio de incorporação e mantenha-o bem para evitar a polimerização enquanto as pontas das raízes estão sendo dispostas no molde. Adicione o meio de incorporação em um prato pequeno e coloque uma muda em um meio.

Sob um escopo de dissecação, use um bisturi para cortar cada ponta da raiz e, em seguida, posicione-a com muito cuidado no molde a cerca de 2 a 3 mm de distância da periferia do molde, verticalmente para seções de transferência ou horizontalmente para seções longitudinais. Depois de organizar o tecido, use um meio de incorporação para preencher completamente o molde e cubra com um filme suspenso. Em seguida, incube em temperatura ambiente por no mínimo duas horas Para secar os blocos, coloque-os em um dessecador com sílica gel seca e deixe em temperatura ambiente durante a noite.

Usando um fabricante de facas equipado com uma ferramenta de pontuação de diamante, prepare facas de vidro a partir de hastes de vidro, cortando a estrada de vidro em um quadrado e, em seguida, cortando o quadrado na diagonal para produzir duas facas. Verifique se ambas as facas têm bordas afiadas. Monte um bloco em um suporte.

Em seguida, com uma lâmina industrial de borda única, remova o excesso de material do bloco até um mm da ponta da raiz para obter uma forma de pirâmide. Divida o bloco moldado em fatias de 2 a 3 mícrons de largura e transfira as fatias para uma lâmina de vidro marcada. Em seguida, adicione gotas de água nas fatias.

É importante preparar seções que sejam uniformes em largura para minimizar a variabilidade dos dados analisados. Coloque as lâminas de vidro nos blocos de calor em fogo baixo até que a água evapore. Para preparar lâminas para visualização sob um microscópio polarizado, dilua a solução de Richardson para 2% da solução original e use cerca de 1ml para cobrir as fatias.

Em seguida, coloque as amostras no bloco de calor por 5 segundos e use água destilada para lavá-las. Depois de secar as lâminas na placa quente, observe as fatias sob um microscópio de dissecação e use um marcador para marcar a parte de trás de uma lâmina para indicar a posição das fatias de interesse. Adicione 100 microlitros de meio de montagem antes de cobrir com a lamínula.

Imagem e análise de acordo com o protocolo de texto. Aqui é mostrada uma seção transversal da raiz primária de Arabidopsis com organização radial de suas células e tecidos constituintes, incluindo células não ciliadas, células ciliadas e córtex. Esta imagem confocal mostra a expressão de BRI1-GFP em células não ciliadas em um fundo mutante BRI1 que inibe a expansão unidirecional das células vizinhas e o crescimento de toda a raiz.

Como visto aqui, seções longitudinais das raízes obtidas do tipo selvagem e de linhagens expressando BRI1 em células não ciliadas exibiram uma orientação semelhante das microfibrilas de celulose com uma alta variabilidade de ângulos presentes nas células meristemáticas em comparação com as células na zona de transição. Isso permite a comparação do acúmulo relativo de cristal na celulose nas células meristemáticas e alongadas correspondentes dos dois fundos genéticos, como mostrado aqui em seções transversais, e revela uma correlação entre a expressão de BRI1 em células não ciliadas e o alto acúmulo local de cristal na celulose. Geralmente, nos vídeos novos para este método terá dificuldade porque é um desafio obter raízes bem orientadas durante o procedimento de incorporação.

Portanto, vários blocos devem ser preparados para seccionamento. Uma vez dominado, uma única seção de bloco pode ser feita em 2 a 3 horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o acúmulo de cristal na celulose é comparável entre as células se elas tiverem orientação semelhante de suas microfibrilas de celulose, conforme determinado pelas seções longitudinais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como consertar mudas de Arabidopsis e como incorporá-las em blocos e como preparar seções transversais de raízes longitudinais e transversais. Você também deve ter uma boa visão dos dados que podem ser obtidos usando microscopia de luz polarizada.