In Situ Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar filmes de proteínas adsorvidas em soluções aquosas, usando o Sistema de Análise na Interface de Vácuo Líquido e espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre biomoléculas e a biointerface. Por exemplo, caracterização de proteínas adsorvidas em uma superfície sólida.

As principais vantagens desta técnica é que as biomoléculas podem ser iniciadas in situ no meio líquido e em combinação com o mapeamento molecular. Embora esse método possa fornecer informações sobre biomoléculas na interface sólido-líquido, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo investigação de células cancerígenas individuais, interações medicamentosas e fixação de biofilmes. Em uma seringa de cinco mililitros, retire dois mililitros de uma solução de etanol a 70%.

Conecte a seringa à extremidade de entrada do dispositivo SALVI e injete lentamente um mililitro do líquido ao longo de 10 minutos. No final da injeção, remova a seringa e conecte a entrada e a saída do SALVI usando uma união de poliéter-éter-cetona. Manter o microcanal SALVI cheio da solução de etanol a 70% à temperatura ambiente durante quatro horas.

Em seguida, encha uma segunda seringa com água deionizada estéril. Conecte-o à entrada do SALVI e injete lentamente a água deionizada no dispositivo ao longo de 10 minutos. Remova a seringa e reconecte a entrada e a saída do dispositivo.

Para imobilizar um filme de proteína, comece retirando dois mililitros de solução de fibronectina em uma seringa. Conecte a seringa à entrada do dispositivo SALVI e injete lentamente um mililitro do líquido ao longo de 10 minutos. Em seguida, remova a seringa e reconecte novamente a entrada e a saída.

Incube a configuração em uma placa de cultura limpa em temperatura ambiente por 12 horas. Após a incubação, injete lentamente um mililitro de água deionizada estéril ao longo de 10 minutos e, em seguida, reconecte a entrada à saída. Para começar, coloque o estágio ToF-SIMS em uma superfície plana e limpa.

Coloque o dispositivo SALVI no palco com o wafer de silício e a membrana de nitreto de silício voltados para cima. Fixe o dispositivo SALVI ao stage usando quatro peças de fixação de metal e aparafuse as peças de metal que prendem o canto do dispositivo na placa de metal com quatro parafusos. Em seguida, enrole suavemente a tubulação PFTE conectada ao canal microfluídico.

Use quatro peças de metal e quatro parafusos para segurar a parte rígida. Certifique-se de que o dispositivo esteja posicionado no espaço aberto no palco, para que não interfira no feixe de íons primário durante a análise. Em seguida, monte o copo de Faraday no palco usando um parafuso.

Em seguida, abra a porta de bloqueio de carga ToF-SIMS e coloque a platina horizontalmente na plataforma de carregamento antes de fechar a porta. Ligue a bomba de vácuo e deixe a câmara de bloqueio de carga bombear para cerca de 10 a menos seis milibares. Em seguida, mova o dispositivo SALVI para a câmara principal após cerca de 30 minutos, uma vez estabilizado o vácuo.

Ajuste o feixe de íons primário e o analisador do ToF-SIMS para adquirir uma resolução espacial de aproximadamente 400 nanômetros seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Em seguida, encontre o canal microfluídico usando o microscópio óptico. Use o centro de imagem óptica como referência e alinhe-o para ser consistente com o centro de imagem de íons secundário.

A demonstração visual desta etapa é crítica, pois é difícil de aprender, porque a amostra é mais espessa do que as amostras sólidas normais e é difícil ajustar as configurações para encontrar o melhor foco do canal. Antes de cada medição, use um feixe de oxigênio de um quiloelétron-volt para escanear a janela de nitreto de silício por cerca de 15 segundos para remover a contaminação da superfície. Além disso, use uma pistola de inundação de elétrons para compensar a carga de superfície durante todas as medições.

Em seguida, selecione o modo positivo ou negativo antes de iniciar a aquisição de dados. Use o bismuto de 25 quiloelétron-volts mais três como o feixe de íons primário em todas as medições. Para perfis de profundidade, escaneie o feixe de íons primário em uma área redonda com um diâmetro de cerca de dois micrômetros com uma resolução de 32 pixels por 32 pixels.

Para minimizar o tempo necessário para perfurar a membrana de nitreto de silício, use um feixe de íons primário de largura de pulso longo. Após a perfuração da membrana de nitreto de silício, mantenha a mesma corrente por cerca de 200 segundos para obter dados suficientes para reconstruções de imagens bidimensionais. Para coleta de dados, reduza a largura de pulso para 80 nanossegundos para adquirir espectros com melhor resolução de massa.

Continue esta aquisição por cerca de mais 200 segundos. Usando a interface microfluídica SALVI, o feixe de íons primário pode bombardear diretamente o filme de fibronectina hidratada. Vários aglomerados de água e fragmentos de aminoácidos são indicados pelos dados de espectrometria de massa ToF-SIMS.

Isso fornece evidências diretas da propriedade das moléculas de água ao redor e dentro das moléculas de proteína hidratadas. Aqui, pode-se ver a série temporal do perfil de profundidade do filme de fibronectina hidratada e da água deionizada. As intensidades dos segundos íons selecionados são insignificantes antes que a membrana de nitreto de silício seja perfurada.

Uma vez que a membrana de nitreto de silício é perfurada, as intensidades dos íons secundários aumentam significativamente. O processo de largura de pulso curta é usado para obter dados com melhor resolução de massa para reconstruções de imagem e espectro. As imagens 2-D do filme de fibronectina hidratada e da água deionizada representam as contagens de íons secundários selecionados da amostra.

Quanto mais brilhante a imagem, maior a contagem de íons secundários. Essas imagens intuitivas fornecem uma comparação clara de íons secundários selecionados entre diferentes amostras, o que é útil na análise de dados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um microrreator precisa estar livre de vazamentos antes de ser instalado na câmara de vácuo.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia e biointerfaces explorarem a adsorção de proteínas, a fixação de biofilme, as monocamadas montadas na superfície e muitos outros fenômenos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar várias amostras líquidas usando SALVI e o ToF-SIMS líquido.