Name: Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a caracterizar defeitos morfogênicos durante o alongamento embrionário em Caenorhabditis elegans usando microscopia de contraste de interferência diferencial. Este método identifica genes reguladores em diferentes fases e regiões do embrião.

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Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá e da Fundação Canadense para Inovação. Obrigado ao Dr. Paul Mains (Universidade de Calgary, Calgary, Canadá) pela cepa let-502(sb118ts). Algumas das cepas foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve novas métricas para caracterizar início e fases tardias de alongamento embrionário. Na seção 1, o passo crítico é a potencial presença de bactérias no teclado. Os embriões são hermeticamente fechado entre a almofada e a lamela durante a aquisição de imagem. Selagem a lâmina é necessário para evitar a dessecação dos animais durante a aquisição que dura mais do que duas horas. Para nosso conhecimento, nenhum dos cimentos usados ​​para montar almofadas de agarose entre l...

Por quase 50 anos, os nematóides Caenorhabditis elegans estabeleceu-se como um modelo poderoso para estudar questões importantes no desenvolvimento, neurobiologia, evolução, interações patógeno-hospedeiro, etc. 1 A força deste modelo no estudo do desenvolvimento encontra-se em: seu ciclo de vida curta de 3 dias; a facilidade com que estes animais podem ser geneticamente alteradas; sua transparência que permite a observação de deslocamento e morfologia celular em animais vivos e seu desenvolvimento que é principalmente extra-uterina. As fases de desenvolvimento do nematóide envolvem embriogênese e quatro estágios larvais (L1 a L4), seguido por idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, epidérmica morfogênese atraiu considerável atenção por sua capacidade de permitir uma melhor compreensão de como epitelial células migram como um grupo, como eles reorganizar suas junções e modificar sua morfologia individual, bem como o seu posicionamento relativo dentro de um epitélio funcional.morfogénese epidérmico é dividido em quatro fases: intercalação dorsal que consiste na reorganização das células epidérmicas dorsal, designado por hipoderme; ventral invólucro, que consiste na migração de células ventrais hipodérmicas para com a linha média ventral, assim, que encerra o embrião de uma monocamada de células epiteliais; início e alongamento final de transformação do embrião em forma de feijão em larvas vermiforme. Seguindo morfogênese, Vigia do embrião e as larvas L1 iniciar a alimentação por meio de bactérias disponíveis no seu ambiente imediato. alongamento embrionário é, por conseguinte, uma fase tardia do desenvolvimento embrionário. Consiste na extensão do embrião ao longo do seu eixo longitudinal e uma redução do seu diâmetro transversal. Isto envolve uma modificação da forma dramática das células hipodérmicas. Alongamento é dividido em um precoce e uma fase tardia. A fase inicial começa na fase vírgula e termina quando os músculos do corpo de parede começam a contrair na fase de 1,75 vezes em wdo tipo DPI (em peso) de embriões - correspondente a embriões que são 1,75 vezes em comprimento em comparação com os embriões não alongado. Morfogênese que ocorrem nessa fase são impulsionadas principalmente pela contração de feixes de filamentos de actina (FBS) localizadas no pólo apical de células hipodérmicas que impulsionam seu alongamento ao longo do eixo antero-posterior do embrião 2. A contração dos corpos estranhos é o controle por fosforilação das cadeias de miosina-luz por três quinases LET-502 / Rock, MRCK-1 e Pak-1 5. A fase final do alongamento, começa quando os músculos do corpo de parede se tornar funcional e começar a contratação. Trata-se de sinalização mecanotransdução dos músculos do corpo de parede para as células dorsal e ventral hipodérmicas e termina quando os animais chocar 3. Alongamento defeitos são geralmente caracterizadas por a percentagem de animais que morrem como embriões (letalidade embrionária; Emb) e aqueles prender o seu desenvolvimento como larvas L1 (fenótipo prisão larval; Lva) e ser significativamente menor do que em peso. A identificação do estágio da prisão de desenvolvimento requer observação microscópica de embriões mortos e presos Larvas 3-6. Recentemente, foi demonstrado que vários genes, tais como o regulador de Cdc42 / Rac efector e pix-1 e Pak-1, o controlo dos processos morfogénicas durante tanto precoce e tardia de alongamento 3,7. Nós também mostrou recentemente que os processos morfogénicas diferem ao longo do eixo ântero-posterior do embrião precoce durante o alongamento 3 7. Estes resultados motivou o desenvolvimento de novas métricas destinadas especificamente às etapas de alongamento precoce ou tardia e outras de medição, permitindo a caracterização da morfologia de embriões ao longo do seu eixo ântero-posterior durante o alongamento inicial. Estes novos métodos consistem na medição do comprimento de embriões no início e no final de alongamento precoce, bem como a largura da sua eleanúncios e caudas. 7 Dois protocolos foram também desenvolvidos para medir o comprimento das larvas recém-nascidas, sincronizados em L1 estágio 7. Os ovos dos embriões protegê-los contra o tratamento alcalino, enquanto hipoclorito larvas, e adultos bactérias presentes no meio de cultura são dissolvidos pelo tratamento. Este tratamento é, então, utilizada para purificar embriões a partir de uma população não sincronizada contendo a maioria dos adultos bem alimentados 8. restrição alimentar é usado para sincronizar as larvas recém-nascidas. Medindo a duração dessas larvas é então usada para detectar defeitos de alongamento. Esta medição é preferido em relação à medição de larvas preso em placas de cultura, porque as larvas que eclodem a partir de embriões não totalmente alongados pode recuperar a &quot;comprimento normal&quot; ao alimentar mas irá manter o seu tamanho reduzido, quando preso na ausência de comida. Aqui, apresentamos protocolos detalhados que permitem a medição da length de alongar embriões, bem como a largura da sua cabeça e cauda utilizando lapso de tempo de microscopia DIC e análise de imagem (Protocolo 1). Nós também fornecemos protocolos detalhados para medir o comprimento de larvas sincronizados usando análise de imagem (Protocolo 2) e citometria de fluxo (Protocolo 3).

<table><tbody><tr><td>Ágar&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Cloreto de Cálcio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Solução de limpeza&nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de controle de alta</td><td>fluorescência união Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato de potássio, dibásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato de potássio, monobásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (sulfato de magnésio)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(fosfato de sódio, dibásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (cloreto de sódio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Goma de Desenho Pebeo 45&nbsp; ml</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>qualquer loja de arte/artesanato</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr>União<td>tampão de bainha</td><td>Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>união Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novas métricas para caracterizar embryonic alongamento do nemátodo<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecar as vias de sinalização que controlam a alteração dos processos morfogênicos durante o desenvolvimento embrionário requer métricas robustas e sensíveis. O alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans é um estágio tardio do desenvolvimento que consiste no alongamento do embrião ao longo de seu eixo longitudinal. Este estágio de desenvolvimento é controlado pela comunicação intercelular entre as células hipodérmicas e os músculos subjacentes da parede corporal. Esses mecanismos de sinalização controlam a morfologia das células hipodérmicas remodelando o citoesqueleto e as junções célula-célula. A medição da letalidade embrionária e da parada do desenvolvimento nos estágios larvais, bem como a alteração do citoesqueleto e das estruturas de adesão célula-célula em células hipodérmicas e musculares, são fenótipos clássicos que têm sido usados há mais de 25 anos para dissecar essas vias de sinalização. Estudos recentes exigiram o desenvolvimento de novas métricas visando especificamente o alongamento precoce ou tardio e caracterizando defeitos morfogênicos ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Aqui, fornecemos protocolos detalhados que permitem a medição precisa do comprimento e da largura dos embriões alongados, bem como do comprimento das larvas sincronizadas. Esses métodos constituem ferramentas úteis para identificar genes que controlam o alongamento, para avaliar se esses genes controlam as fases inicial e tardia desse estágio e são necessários uniformemente ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Cabeça-, Cauda e Rácio de cabeça / cauda de largura são métricas robusto. Os protocolos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso para caracterizar a função dos reguladores e dos efectores de Rho GTPases pix-1, Pak-1 e deixou-502 durante o alongamento precoce 7.<...

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

O objetivo geral deste grupo de experimentos é identificar defeitos no desenvolvimento do nematodo Caenorhabditis elegans durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário. Este método pode responder a uma questão fundamental na área da genética do desenvolvimento. Ele permite a caracterização de genes que controlam uma fase tardia do desenvolvimento embrionário de Caenorhabditis elegans, denominada alongamento embrionário.A principal vantagem desse grupo de técnicas é que elas identificam genes que controlam tanto a fase inicial quanto a fase tardia do alongamento, bem como aqueles que regulam processos morfogenéticos na parte anterior ou posterior do embrião. Vou demonstrar o procedimento juntamente com Olivier Rocheleau-Leclair, um ex-aluno do laboratório. Esse procedimento exige lentes DIC, prisma e um sistema de captura de vídeo para microscopia de lapso de tempo de pilhas Z.Primeiro, posicione a amostra montada sobre lâmina para visualização. Os detalhes do preparo estão no protocolo textual. Iniciando em baixa magnificação, identifique os embriões em seus estágios pré-morfo gênicos.Em seguida, adicione uma gota de óleo e utilize uma objetiva mais potente. Agora, i

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Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

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O esperma deve navegar com sucesso através do oviduto para fertilizar um oócito. Aqui, nós descrevemos um ensaio para medir a migração do esperma dentro do útero hermafrodita de C. elegans . Este ensaio pode fornecer dados quantitativos sobre a distribuição de espermatozóides dentro do útero após o acasalamento, bem como na velocidade, rotação direcional e frequência de reversão.

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

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