Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

O objetivo geral deste procedimento é detectar simultaneamente ânions de óxido nítrico intracelular e superóxido usando o corante de fluorescência DAF-2DA e DHE em aortas de camundongos intactas recém-isoladas. Este método pode ajudar no laboratório de recuperação de casos de pesquisadores no campo da fisiologia cardiovascular, como disfunção endotelial e desacoplamento de eNOS. A principal vantagem desta técnica é fornecer um método simples e preciso para detecção direta ex vivo e visualização de óxido nítrico e ânion superóxido simultaneamente em vasos sanguíneos intactos.

Para este protocolo, construa um sistema de banho de órgãos que possa ser aquecido a 37 graus Celsius e arejado com 95% de oxigênio e 5% de gás dióxido de carbono de um tanque de gás carbônico. Para começar, prepare tampão de bicarbonato Krebs-Ringer fresco o suficiente conforme necessário para banhar os tecidos de interesse. Por exemplo, 200 mililitros são necessários para aortas em um experimento.

Ligue o sistema de banho de órgão e ajuste o controle de calor para 37 graus Celsius. Depois de lavar as câmaras com o tampão de bicarbonato Krebs-Ringer, adicione cinco mililitros do tampão de bicarbonato Krebs-Ringer a cada câmara e ligue o gás para arejá-lo com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Mantenha as câmaras cobertas.

Além disso, prepare uma garrafa de tampão de bicarbonato Krebs-Ringer gelado com aeração. Após a excisão da aorta torácica, mergulhe imediatamente todo o tecido em um prato com tampão Krebs-Ringer gelado. Sob um microscópio de dissecção, remova o coração e o arco aórtico, mantendo o segmento aórtico torácico no tampão.

Em seguida, disseque a aorta livre de tecido perivascular aderente usando tesoura cirúrgica e fórceps. Em seguida, use uma pinça para agarrar a borda do tecido e lave suavemente o sangue do lúmen vascular usando um tampão Krebs-Ringer gelado administrado por uma seringa. Os coágulos sanguíneos no lúmen vascular devem ser eliminados porque podem causar sinais artificiais e interferir nos sinais fluorescentes e, ao mesmo tempo, a força de lavagem deve ser controlada para não danificar a camada endotelial.

Agora, corte os anéis aórticos limpos em segmentos de três milímetros de comprimento. Depois de preparar os anéis aórticos limpos, manche-os. Tocando apenas o lado adventício dos anéis aórticos com fórceps, sem pinçar os vasos sanguíneos, transfira os segmentos aórticos limpos para as câmaras de banho de órgãos preparadas.

Deixe as artérias se equilibrarem no tampão por 30 minutos. Após meia hora, adicione acetilcolina ao banho de órgãos para obter uma concentração final de um micromolar e incube as artérias por 10 minutos com a acetilcolina. Enquanto isso, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, prepare um mililitro de solução de coloração com tampão Krebs pré-aquecido.

Em seguida, enrole o tubo em papel alumínio para minimizar a exposição à luz e mantenha-o a 37 graus Celsius. Após a estimulação da acetilcolina, transfira os anéis aórticos do banho de órgãos para o tubo de solução de coloração e deixe-os incubar por 30 minutos no escuro com aeração. Todas as etapas deste ponto em diante devem ser feitas com exposição mínima à luz.

Em seguida, transfira os anéis aórticos para um novo tubo cheio de tampão Krebs por um minuto. Execute esta etapa de lavagem três vezes. Em seguida, fixe os anéis aórticos em um banho de solução de paraformaldeído a 4% por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a etapa de fixação, transfira os anéis para a solução DAPI por três minutos em temperatura ambiente para aplicar a contracoloração. Em seguida, lave os anéis aórticos com PBS três vezes por um minuto por lavagem. Seja sempre sensível à fragilidade do tecido endotelial ao mover os anéis.

Sob um microscópio, corte os anéis aórticos longitudinalmente com uma tesoura microcirúrgica em uma lâmina. Em seguida, remova qualquer excesso de líquido na aorta, mantendo-a úmida. Force as aortas enroladas contra uma lâmina com o endotélio voltado para baixo na lâmina de vidro usando duas pinças microcirúrgicas.

Nesse processo, não mova as aortas para frente e para trás. Esta etapa é muito crítica, mas não é fácil de operar. É melhor praticar bem antes do experimento formal.

Em seguida, solte o meio de montagem na aorta. Cubra a lâmina e sele-a com esmalte. Após a secagem ao ar no escuro, crie imagens das lâminas usando microscopia confocal.

Use uma velocidade de varredura de 200 hertz, uma resolução de 1024 x 1024 pixels e tamanho de pilha z de um quarto de mícron. Para observar o DAF-2DA, use um laser de argônio, defina a fluorescência de excitação para 488 nanômetros e a detecção de emissão para 515 nanômetros. Para observar o DHE, defina a fluorescência de excitação para 514 nanômetros e defina a detecção para 605 nanômetros.

Depois de focar em ampliações de 10x, ajuste a objetiva para ampliações de 40x. Agora, defina o alcance da camada endotelial ajustando a posição z no painel de controle, usando os núcleos corados com DAPI como pontos de referência. Em seguida, escaneie a camada endotelial na borda do lúmen através de toda a espessura da camada endotelial e registre as imagens.

Digitalize pelo menos três campos de visão diferentes para cada amostra. Camundongos jovens C57 pretos 6 tornaram-se obesos ao serem alimentados com uma dieta rica em gordura por 14 semanas. Os controles foram alimentados com uma ração normal.

Após 14 semanas, suas artérias torácicas foram examinadas. Antes da coloração, os tecidos foram expostos ao inibidor de eNOS L-NAME por uma hora em um nanomolar. O sinal do DAF-2T, visto em verde, é convertido do DAF-2 sem fluorescência pelo óxido nítrico.

Portanto, a coloração sugere a presença de óxido nítrico em uma célula. Da mesma forma, quando oxidado pelo superóxido, o DHE emite um sinal fluorescente vermelho. Assim, as amostras que mostram mais cor vermelha têm mais superóxido nas células.

A quantificação das imagens de fluorescência confocal revelou uma diminuição na produção de óxido nítrico e um aumento na geração de superóxido sensível a L-NAME na camada endotelial aórtica dos camundongos alimentados com dieta rica em gordura. Esses dados apóiam a noção de que o desacoplamento da eNOS ocorre com a obesidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar óxido nítrico e os ânions superóxido e o uso de corantes fluorescentes em vasos sanguíneos intactos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a camada endotelial intacta durante todo o procedimento de operação. E sempre mergulhe os vasos sanguíneos no tampão Krebs-Ringer para manter as células endoteliais vivas antes da etapa de fixação.

Combinando com este procedimento, outras medidas, como a análise das respostas vasomotoras dos vasos sanguíneos, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como a função fisiológica das células endoteliais na regulação do tônus vascular.