Name: Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a analisar a ativação dependente de fosforilação do fator de transcrição IRF3 usando SDS-PAGE de alta resolução, Native-PAGE e imunoblot com anticorpos fosfoespecíficos. Este método sensível e acessível permite distinguir diferentes formas ativadas do IRF3 em resposta imune inata.

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Os autores agradecem aos membros anteriores e atuais do laboratório pelo desenvolvimento dos protocolos. O trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) [concessão # MOP-130527] e do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá [NSERC-355306-2012]. NG recebeu uma cadeira de pesquisa de nível II do Canadá. AR é bolsista do programa de treinamento da Rede de Pesquisa em Saúde Respiratória do Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

NOTA: O protocolo é descrito aqui, usando células A549 infectadas com o vírus Sendai (SeV). No entanto, o protocolo de SDS-PAGE e PAGE nativa também funciona com todos os tipos de células humanas e de murino testadas até agora, particularmente células mielóides estimuladas com vários estímulos de activação 9,15,19,24,25 IRF3. 1. A infecção de células A549 <ol><li> Manter células A549 em cultura numa placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 em 20 ml F12K médio / Ham contendo 10% de soro inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) e 1% de L-glutamina (F12K completo / meio Ham). NOTA: Todas as soluções utilizadas para a cultura de células e tratamentos devem ser estéreis. </li><li> Aos 24 horas antes da infecção, Aspirar o meio e lava-se as células com 10 ml de água destilada salina tamponada com fosfato (D-PBS) à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% a cada placa para cobrir as células e incuba-se a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Pare a incubação, logo que thcélulas e começar a separar a partir da placa por suavemente batendo a placa com uma mão. Inativar a tripsina por adição de 10 ml de meio completo F12K / Ham pré-aquecido por placa e transferência das células para um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 350 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 8 ml de meio F12K / Ham completo para se obter uma suspensão de célula única homogénea. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Semente as células a uma densidade de 1 x 10 6 culas por placa de 60 mm em 4 ml de meio F12K / Ham pré-aquecida completa. Incubar durante 20 - 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. Depois de 20 - 24 horas, as células formam uma monocamada confluente a 90% (o que corresponde a 1,5 x 10 6 células). </li><li> Remover o meio e lava-se as células com 2 ml de F12K isento de soro / meio Ham (SFM). Adicionar 2 ml de SFM fresco por placa de 60 mm. </li><li> Descongelar uma alíquota do vírus Sendai (SeV) (armazenado alíquotas a -80 ° C) em gelo e brevemente vórtex. </li><li> Diluir the vírus em pré-aquecido SFM obter 60 HAU / 100 l. Misturar por pipetagem cima e para baixo suavemente e adicione 100 ml de vírus diluído por placa para executar a infecção em 40 HAU / 10 6 células. Não adicionar o vírus na placa de controlo não infectados. </li><li> Incubam-se as células na incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2. Agitar as placas à mão 3 ou 4 vezes, ou utilizando um agitador orbital ou de balanço automática colocado directamente na incubadora, durante a primeira hora de infecção. </li><li> Às 2 h pós-infecção, adicionar 2 ml de meio F12K / Ham contendo 20% de HI-FBS a obter uma concentração final de 10% de HI-FBS. </li><li> Incubam-se as células na incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 1, 4 e 7 horas adicionais, para atingir o tempo total de infecção de 3, 6 e 9 horas, respectivamente. Em cada um desses momentos, vá para a etapa 2.1. </li></ol> 2. Preparação de Extratos de células inteiras (WCE) <ol><li> Remover o meio de infecção. Colher as células por raspagem em 1 mlde gelo-D-SBF frio e transferir a suspensão de células a um pré-arrefecida de 1,5 ml tubo de centrífuga. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 16.000 xg, a 4 ° C durante 20 segundos e decanta-se cuidadosamente todos os vestígios de D-PBS. NOTA: Nesta etapa, o sedimento de células pode ser directamente submetido a extracção de proteínas ou congelados rapidamente em azoto líquido ou banho de gelo / etanol seco e armazenado a -80 ° C até a lise. </li><li> Preparar o tampão de lise contendo 50 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10% de glicerol e 1% de Nonidet P-40 em água desionizada (ddH2O). Extemporarily adicionar protease (1 ug / mL de leupeptina e aprotinina a 2 / ml ug) e inibidores de fosfatase (fluoreto de sódio 5 mM, 1 mM de ortovanadato de sódio activado, 2 mM de fosfato de p-nitrofenilo e 10 mM de glicerof osf ato-β pH 7,5). NOTA: O tampão de lise sem inibidores podem ser armazenadas a 4 ° C. Um protocolo específico para a activação de ortovanadato de sódio é descrita na Tabela de Reagentes específico / Equipment. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 70 ul de tampão de lise. Tipicamente, a concentração será de cerca de lisado de 2 ug / uL. </li><li> Incubar em gelo durante 20 min. Flash congelar o lisado por incubação num banho de azoto líquido durante 15 segundos. Descongelar o lisado à temperatura ambiente até que esteja completamente derretida e vórtice durante 10 seg. Repita o / descongelamento / ciclo vortex congelamento 3 vezes. <ol><li> Alternativamente, executar o passo de congelação num banho de etanol / gelo seco durante 1 min. </li></ol></li><li> Centrifugar a 16.000 xg, a 4 ° C durante 20 min. Transferir o sobrenadante (correspondente ao WCE) para um novo 1,5 ml pré-arrefecido tubo de centrífuga. Manter o WCE em gelo em todos os momentos. </li><li> Quantificar proteínas utilizando qualquer procedimento de quantificação de proteína compatível com o tampão de lise, tais como à base de proteína de Bradford ensaio de 26. </li></ol> 3. Resolução do WCE por alta resolução SDS-PAGE <ol><li> Preparar três géis desnaturantes de electroforese. <ol><li> Para a detecção deFormas IRF3, despeje dois geles de um mínimo de 16 cm de comprimento com um gel de separação composto por 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl a pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS ), 1% de persulfato de amónio e 0,1% TEMED em ddH2O e um gel de empilhamento composto por 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% de SDS, 1% de persulfato de amónio e 0,1% TEMED em ddH 2 O. Cuidado! Acrilamida, TEMED e SDS são tóxicos e / ou irritantes. Usar luvas de protecção e manipular sob uma coifa. </li><li> Para a detecção de proteínas SEV, verter um gel de um mínimo de 8,5 cm de comprimento com características semelhantes às do gel descrito em 3.1.1, excepto em que o gel de separação contém 12% de acrilamida. </li></ol></li><li> Desnaturar o WCE obtido no passo 2.6 pela adição de 1: 4 (v / v) de tampão 5x de carga (125 mM de Tris-HCl a pH 6,8 (RT), 10% de SDS, 20% (p / v) de glicerol, 0,0005% de azul de bromofenol e 25% β-mercaptoetanol em ddH2O), seguido por aquecimento a 100 °C durante 10 min. Rotação rápida dos tubos para derrubar a condensação que se forma no cap. Cuidado! β-mercaptoetanol é tóxico por inalação. Usar luvas de protecção e manipular sob uma coifa. </li><li> Montar os géis do aparelho de migração. Encha as câmaras superiores e inferiores com tampão de corrida contendo 25 mM de base Tris, 0,1% de SDS e 192 mM de glicina em água destilada (dH2O). </li><li> Carga de 14 mL de padrão de peso molecular em um bem de cada 16 centímetros gel e 7 ul de padrão de peso molecular em um poço do 8,5 centímetros gel. Carga 30 ug de WCE desnaturado (preparada tal como descrito no passo 3.2) por poço de os dois geles preparados no passo 3.1.1 para detecção formas IRF3. Carga 8 - 10 ug de WCE desnaturado (preparada tal como descrito no passo 3.2) por poço em o gel preparado no passo 3.1.2 para análise SeV. </li><li> Executar os géis a 30 mA de corrente constante até a frente de migração atinge o fundo do gel. NOTA: A migração normalmente dura approximately 3 horas para 16 centímetros um gel e 45 min para um 8,5 centímetros gel. </li><li> Prossiga para a transferência para membranas de nitrocelulose (etapa 5). </li></ol> 4. Análise de IRF3 Dimerization por Native-PAGE NOTA: Este método foi originalmente descrito pelo grupo do Dr. T. Fujita 27. <ol><li> Prepare os superiores (-) e inferior (+) buffers de eletroforese câmara. O tampão de câmara superior é composto por 25 mM de Tris-HCl a pH 8,4 (RT), glicina 192 mM e 1% de desoxicolato de sódio (DOC) em ddH 2 O. A câmara inferior contém tampão de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) e 192 mM de glicina em ddH 2 O. NOTA: As memórias intermédias superior e inferior da câmara de electroforese pode ser armazenado a 4 ° C até à sua utilização. No entanto, certifique-se de que eles são pré-aquecida até à TA antes de realizar a eletroforese. </li><li> Pour um gel não desnaturante de resolução de um mínimo de 8,5 cm de comprimento contendo 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl a pH 8,8 (RT), 1% de muniçãopersulfato nium e 0,1% TEMED em DDH 2 O. </li><li> Pré-correr o gel a 40 mA de corrente constante durante 30 min em gelo. Pressionar o aparelho de correr para o gelo, aproximadamente, ao nível do tampão de electroforese câmara inferior. É importante que o gel não está em gelo. </li><li> Durante a pré-corrida, misturar WCE mantidas em gelo com tampão de carga nativa-PAGE 2x 1: 1 (v / v) contendo 125 mM de Tris-HCl a pH 6,8 (RT), 30% de glicerol e 0,1% de azul de bromofenol em ddH 2 O. </li><li> Carga 8 - 10 ug WCE (preparada tal como descrito no passo 4.4) imediatamente no final da pré-corrida. </li><li> Submeter o gel a 25 mA de corrente constante em gelo, tal como descrito acima para a pré-prazo, até a frente de migração atinge o fundo do gel (cerca de 40 min). </li></ol> 5. Análise de imunotransferência de IRF3 Espécies <ol><li> Preparar o tampão de transferência contendo 25 mM de base Tris e 192 mM de glicina em ddH 2 O. Refrigerar a transferência de tampão a 4 ° C antes da utilização. </li><li> Wet três pedaços de membrana de nitrocelulose cortada num tamanho ligeiramente maior do que os geles em uma caixa de plástico / de vidro contendo o tampão de transferência. Indicar a orientação da membrana através do corte dos cantos. O tampão de transferência pode ser reutilizado 3 vezes. Armazenar o tampão a 4 ° C entre as utilizações. </li><li> Uncast os géis (SDS-PAGE e PAGE nativa) e cortar um canto de cada gel para facilitar a orientação correcta. <ol><li> Para nativa-PAGE em gel a incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante pelo menos 30 min no tampão de SDS-PAGE a corrente para remover o COD antes da transferência para o tampão de transferência. </li></ol></li><li> Incubar os géis de SDS-PAGE (e nativa-PAGE) em tampão de transferência durante 5 - 10 min. </li><li> Montar um sanduíche de transferência por gel em uma cassete de transferência com a membrana para o eletrodo positivo (espuma papel pad / filtro / membrana / gel / filtro de papel / almofada de espuma). Ter cuidado para remover todas as bolhas entre as camadas da sanduíche. </li><li> Realize a transferência como recomendado by fabricante para o aparelho de transferência usado. Observação: executar todas as incubações e lavagens em os próximos passos na mesa vibratória de balanço ou orbital. </li><li> No final do tempo de transferência, incubar as membranas durante 15 min na solução de fixação contendo ácido acético a 7%, etanol a 40% e 3% de glicerol em ddH 2 O. Lavam-se as membranas 3x 5 minutos em PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10,2 mM de Na 2 HPO 4 1,8 mM e KH 2 PO 4 em dH2O). Cuidado! O ácido acético é tóxico, irritante e inflamável. Usar luvas de protecção e manipular sob a coifa. NOTA: A solução de fixação pode ser reutilizado várias vezes. </li><li> Para a membrana nativo-PAGE prosseguir diretamente para a etapa 5.11. </li><li> Lavar as três membranas de SDS-PAGE rapidamente em dH2O antes da incubação durante 1 min em solução Ponceau Red contendo 6,57 mM de Ponceau Red e ácido acético a 1% em ddH 2 O. NOTA: A solução vermelho ponceau pode ser r<html> eused várias vezes. </li><li> Lavar as membranas em dH2O até que o fundo é branco o suficiente para ver as bandas de proteína manchadas de vermelho. Nota os marcadores com um lápis e cortar o excesso de membrana em torno das proteínas. Destain as membranas por incubação durante 5 min em PBS, sob agitação. </li><li> Incubam-se as membranas durante 1 hora à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C em solução de bloqueio (PBS contendo 0,05% de Tween 20 e leite seco a 5% não gordo (PBS-T-leite). Lavam-se as membranas 3x 5 min em PBS-T. NOTA: A lavagem com PBS-T é opcional e só estritamente necessária quando se aplica anticorpos diluídos em PBS-T contendo 5% de albumina de soro bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 e Tabela 1) no passo seguinte. </li><li> Incubar as quatro membranas (a partir de SDS-PAGE e PAGE nativa-) com os anticorpos primários de acordo com a ordem sequencial detalhado na Figura 1 e Tabela 1. Execute 5x lavagens a 5 min em PBS-T. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> Figura 1. Sequência de Análises Immunoblot. O esquema descreve os SDS-PAGE e PAGE nativa-géis individuais necessários para detectar as várias formas fosforiladas e monoméricos / IRF3 dimérica. A ordem específica dos anticorpos aplicados à membrana resultante de cada gel no processo de imunotransferência é descrito. Note-se que os anticorpos anti-actina são utilizados em primeiro lugar para assegurar carga igual das amostras antes da aplicação de quaisquer outros anticorpos específicos. A sequência alternada, com os anticorpos anti-actina sendo aplicada após os anticorpos anti-fosfo-IRF3, também funciona. Decapagem é usado entre anti-actina e anticorpos anti-SEV, ou entre anti-fosfo-IRF3 e anticorpos anti-IRF3 por causa da sobreposição de tamanho dos sinais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Os anticorpos primários </td><td> Diluição </td><td> O tampão de diluição </td><td> Incubação </td><td> Anticorpos secundários </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Anti-actina </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 15 min a RT </td><td> Anti-murganho </td><td> Use após SDS-PAGE Antibodyies diluído pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td> Anti-coelho </td><td> Use depois de Native-PAGE. Não é recomendável reutilizar o anticorpo diluído </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td&gt; anti-coelho </td><td> Use após SDS-PAGE. Não é recomendável reutilizar o anticorpo diluído Anti-IRF3-P-396 também está disponível a partir de sinalização celular. Diluição óptima foi definida como 1 / 1.000 para este anticorpo, mas pode variar entre lotes. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td> Anti-coelho </td><td> Use após SDS-PAGE. Não é recomendável reutilizar o anticorpo diluído </td></tr><tr><td> Comprimento total Anti-IRF3 </td><td> 1/7500 </td><td> PBS-T-leite </td><td> 3 h à TA </td><td> Anti-coelho </td><td> Use após SDS-PAGE. Anticorpo de comprimento completo anti-IRF3 pode ser utilizado após nativa-PAGE, mas é menos sensível para detectar o monómero. Anticorpos diluídos pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-NES </td><td> 0,5 ug / ml </td><td> PBS-T-leite </td><td> 3 h à TA </td><td> Anti-coelho </td><td> Use depois de Native-PAGE. Antibodyies diluído pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. </td></tr><tr><td> Anti-SEV </td><td> 1 / 14.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 3 h à TA </td><td> Anti-coelho </td><td> Use após SDS-PAGE. Antibodyies diluído pode ser reutilizado várias vezes, se for armazenado a 4 ° C na presença de 0,02% de azida sódica. </td></tr><tr><td colspan="6"> NOTA: A diluição e buffer utilizado para anticorpos secundários HRP-acoplados precisam ser otimizados, pois varia de uma empresa para a outra. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Especificações de anticorpos utilizados no Processo de imunotransferência. <ol start="13"><li> Incubam-se as membranas com a peroxidase de rábano (HRP) conjugado a anticorpos secundários, conforme descrito na Figura 1 e Tabela 1. Lavam-se as membranas 5x 5 min em PBS-T, seguido por 2x 5 min em PBS, para remover completamente os traços de Tween. </li><li> Incubam-se as membranas durante 1 minuto em um volume de reagente de quimioluminescência reforçada suficiente para cobrir completamente as membranas. Secam-se as membranas, utilizando papel de filtro. </li><li> Coloque as membranas em um analisador de imagem luminescente para visualizar as bandas imunorreactivas. <ol><li> Como alternativa, realizar a detecção de bandas imunorreactivas usando sensíveis filmes X-Ray. </li></ol></li><li> Lavam-se as membranas 3x 5 minutos em PBS. NOTA: Nesta etapa as membranas podem ser mantidos secos. No entanto, se mais de fraccionamento é necessária, é melhor para realizar a decapagem, antes da secagem da membrana. As membranas podem também ser armazenados de curto prazo em PBS. </li><li> Para as membranas que não necessitam de remoção entre incubação com anticorpos (ver Figura 1) proceder directamente para o passo5,20. </li><li> Quando é necessária uma decapagem entre anticorpos (ver Figura 1), incubar as membranas em solução pré-aquecida de extracção contendo 2% de SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) e 0,7% β-mercaptoetanol em ddH2O a 50 ° C durante 20 min sob agitação regular. Lavam-se as membranas 3x 5 minutos em PBS. NOTA: Agitação durante o procedimento de remoção é fundamental. De decapagem pode ser realizada num forno de hibridação. Alternativamente, de decapagem pode ser realizada usando membranas seladas em sacos de plástico e imerso em um banho de água. Neste caso, é importante para agitar as membranas 4 - 5 vezes durante a incubação. </li><li> Incubam-se as membranas durante 1 h à TA ou O / N a 4 ° C em PBS-T-leite. </li><li> Repita os passos 5.12 a 5.16 de acordo com a Figura 1. </li></ol>

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<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo aqui descrito consiste de uma combinação de alta-resolução de SDS-PAGE e PAGE nativa-acoplado com a utilização de vários anticorpos fosfoespecï¿½ico para distinguir o monomérica / dimérica e phosphoforms I-IV da IRF3. Detecção adequado dessas espécies IRF3 é essencial para caracterizar completamente a ativação IRF3 em um ambiente específico. Por exemplo, estimulação por LPS de macrófagos activados, conduz à formação de dimérico, Ser396 / 398 IRF3 fosforilado que exibe uma hipofosforilado (Forma II), mas não ...

<html> O factor de transcrição ubíqua e constitutivamente expresso interferão (IFN) factor regulador 3 (IRF3) é crítica para a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, principalmente, através da indução de IFNp, mas também através da indução da quimioquina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e várias proteínas anti-virais, incluindo a proteína induzida por IFN com tetratricopeptide repete IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activação tem sido relatada após infecção com numerosos vírus, ou a exposição ao ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou lipopolissacárido (LPS) 4. É importante ressaltar que os vírus mais estudados desenvolveram mecanismos para fugir da resposta mediada por IRF3, e, assim, escapar o anfitrião defesa imune inata 5. Assim, a monitorização IRF3 activação é de grande importância para compreender os mecanismos moleculares da defesa do hospedeiro antiviral inata, mas também para identificar a estratégia utilizada pelo vírus para neutralizar esta resposta. ENT &quot;&gt; Muitos relatórios publicados no entanto proporcionar apenas uma limitada análise de activação IRF3 realizada pela monitorização da indução do gene IRF3-alvo (IFNB1 e IFIT1) e / ou ensaio de gene repórter da luciferase associada a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio de baixa resolução (SDS- PAGE) análise de IRF3. No entanto, numerosos estudos bioquímicos, a análise do comportamento de vários mutantes IRF3 e elucidação da estrutura cristalina IRF3 6-11 contribuíram para estabelecer IRF3 que é submetido a uma série complexa de modificações pós-traducionais sequenciais por fosforilação em múltiplos locais. O conjunto de fosforilação envolvida na activação IRF3 parece ser dependente do estímulo e provavelmente do tipo de célula. Em células não infectadas, IRF3 coexiste como as espécies não-fosforilados e hipofosforilado contendo phosphoresidues, incluindo Thr135 e Ser173, no 1 região N-terminal -198 aa 6,12-14. Acumulação deste f hipofosforiladoORM de IRF3 é induzida por indutores de stress, factores de crescimento e agentes que danificam o DNA 6. A fosforilação de resíduos de Ser / Thr na região C-terminal de IRF3 que contém o domínio de transactivação é accionado a seguir a activação por vírus, poli I: C ou LPS em um tipo de célula modo dependente 15-17. C-terminal fosforilação de IRF3 envolve nada menos do que 7 sites de phosphoacceptor distintos organizados em dois grupos principais, Ser385 / Ser386 e Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada um contribuir para a ativação IRF3 através de dimerização, a acumulação nuclear, associação com o CREB ligaï¿½o ao proteína (CBP) / coactivators P300, a ligação ao IFN elemento de resposta sensível (ISRE) sequências de consenso e de transativação de genes alvo 9,10,17-19 DNA. Fosforilação de Thr390 também é pensado para contribuir para a ativação induzida por vírus IRF3 20. Análises de espectrometria de massa de IRF3 demonstraram que Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 resíduos são directamente phosphorylated pelo inibidor da quinase kB ε (IKKε) / vinculativo TANK quinase 1 (TBK1) quinases 9,10. A fosforilação nos resíduos C-terminal é também necessário para a terminação da activação através IRF3 polyubiquitination e degradação mediada por proteassoma 10. Este processo é também dependente da fosforilação em Ser339, que é necessário para o recrutamento de isomerase propil Pin1 10,11. IRF3 espécies que contêm, pelo menos, fosfo-Ser339 / 386/396 resíduos são considerados formas hiperfosforiladas. A seqüência exata ea função de cada local continua a ser um assunto de discussão 10,21. É agora claro que IRF3 activado não representa um estado homogêneo, mas que as espécies activadas diferentes que apresentem características de fosforilação ou dimerização distintas existir 10,22. Para fornecer uma compreensão completa da ativação IRF3 em resposta a patógenos específicos, é necessário, portanto, characterize qual das espécies activadas são induzidas. A indução de genes alvo, IRF3 IFNB1 e IFIT1, provou proporcionar uma leitura fiável para a activação IRF3. No entanto, o acompanhamento expressão destes genes não faz distinção entre diferentes estados de ativação de IRF3. Uma análise abrangente dos estados de ativação IRF3 em um ambiente particular, baseia-se na caracterização detalhada de sua fosforilação e dimerização estado 10. Não fosforilada (forma I), hipofosforilado (forma II) e (hiperfosforiladas formas III e IV) formas IRF3 6,18,23 pode ser resolvido com êxito por mobilidade reduzida em alta-resolução análise de SDS-PAGE. Espécies IRF3 monoméricos e diméricos podem ser eficientemente identificado por análise de PAGE nativa. Estas abordagens são grandemente melhoradas quando utilizada em combinação com anticorpos dirigidos contra fosfoespecï¿½ico IRF3 phosphoacceptor locais distintos. Protocolos padrão permitem que um pobre de resoluçãoproteínas que não permite uma separação eficiente de formas fosforiladas IRF3 distintas. Aqui, descrevemos detalhadamente um procedimento para obter a mais alta resolução para monitorar a indução de espécies distintas IRF3 ativado-vírus usando SDS-PAGE acoplado a nativo-PAGE em combinação com immunoblot utilizando anticorpos totais e fosfoespecï¿½ico. In vivo discriminação entre os diferentes ativado formas de IRF3 é executada com base nos seus deslocamentos de mobilidade observadas em SDS-PAGE. Além disso, IRF3 monómero e dímero podem ser distinguidos por electroforese não desnaturantes. A combinação destas duas técnicas complementares com immunoblot revela-se uma abordagem acessível e sensível para adquirir todas as informações necessárias para uma análise completa da activação mediada por fosforilação de IRF3.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Quente em um 37 &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Para cultura de células.</td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA 0,25%</td> <td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Vírus Sendai Cantell Cepa</td><td>Charles River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td> <td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Corte a extremidade da ponta e pipete lentamente, pois é muito grossa.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Marca registrada correspondente ao detergente Octylphenoxy poli(etilenooxi)etanol (Nonidet P-40)</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Ativação do ortovanadato de sódio 0,2 M : 1) Ajuste o pH para 10,0 usando 1 N NaOH ou 1 N HCl. O pH inicial da solução de ortotovanadato de sódio pode variar com muitos produtos químicos. 2) A solução é amarela em pH 10,0. 3) Ferva até ficar incolor. 4) Resfrie para RT. 5) Reajuste o pH para 10,0 e recoloque as etapas 3-4 até que a solução permaneça incolor e se estabilize em 10,0. Armazenar as alíquotas de ortovanadato de sódio activado a -20 °C.</td></tr><tr><td>sal dissódico de fosfato p-nitrofenil hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Ensaio de Proteína Bio-Rad&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>citotóxico</td></tr><tr><td>Acrilamida/Bis-Acrilamida (37.5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>citotóxico</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>Trabalhe sob a coifa. Tóxico e irritante.</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>irritante.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Tóxico e irritante.</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Trabalhe sob a coifa. Tóxico para o sistema nervoso, membranas mucosas. Pode ser tóxico para o trato respiratório superior, olhos, sistema nervoso central.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>irritante.</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose (0,45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>Trabalhe sob a hotte. Tóxico, irritante e inflamável.</td></tr><tr><td>Ponceau vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp;</td><td>Para PBS composição para immunoblot.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>Para composição de PBS para immunoblot.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp;</td><td>Para PBS composição para immunoblot.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Para composição de PBS-T-BSA para immunoblot.</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Cravo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli sorbato 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>Corte a extremidade da ponta e pipete lentamente, pois é muito grossa.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Armazene aliquotado a -20 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Home made19</td><td></td><td>Store aliquotado a -80 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>4947s</td><td>Armazenar a -20 oC.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Home made15</td><td></td><td>Store aliquotado a -80 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Motivo Actif anti-IRF-3 de comprimento total</td><td></td><td>39033</td><td>Armazene aliquotado a -80 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Loja aliquotada em -20 oC.</td></tr><tr><td>Reagente de Quimioluminescência Western Lightning Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini aparelho de câmera CCD</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Padrões de Peso Molecular, Ampla Gama</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Loja aliquotada a -20 oC.</td></tr></tbody></table>

uma resolução alta método de monitoramento de ativação fosforilação dependente de irf3

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

O fator de transcrição IRF3 é crítico para a primeira linha de defesa contra patógenos, principalmente por meio da β de interferon e da expressão gênica antiviral. Uma análise detalhada da ativação do IRF3 é essencial para entender como os patógenos induzem ou evitam a resposta antiviral inata. Formas ativadas distintas de IRF3 podem ser distinguidas com base em sua fosforilação e status de monômero versus dímero. A discriminação in vivo entre as diferentes espécies ativadas de IRF3 pode ser alcançada através da separação das formas fosforiladas de IRF3 com base em suas mudanças de mobilidade em SDS-PAGE. Além disso, os níveis de monômero e dímero IRF3 podem ser monitorados usando eletroforese não desnaturante. Aqui, detalhamos um procedimento para alcançar a resolução mais alta para obter o máximo de informações sobre o status de ativação do IRF3. Isso é obtido por meio da combinação de um SDS-PAGE de alta resolução e um PAGE nativo acoplado a imunoblots usando vários anticorpos totais e fosfoespecíficos. Esta estratégia experimental constitui uma abordagem acessível e sensível para adquirir todas as informações necessárias para uma análise completa da ativação mediada por fosforilação de IRF3.

A Figura 2 mostra uma imagem de imunotransferência típica de IRF3 detectada com anticorpos e anticorpos totais IRF3 IRF3 fosfoespecï¿½ico contra-Ser396 e Ser398 após resolução de WCE por alta-resolução de SDS-PAGE. Em células não estimuladas A549, IRF3 é detectado como duas bandas a 50 e 53 kDa no SDS-PAGE correspondente à não-fosforilada (Forma I) e o hipofosforilado (Forma II) espécies de IRF3. A exposição de células A549 para SEV para 3 - 9 hr resultados em um desloca...

Aqui descrevemos um procedimento que permite uma análise detalhada da ativação dependente de fosforilação do fator de transcrição IRF3. Isso é obtido por meio da combinação de um SDS-PAGE de alta resolução e um PAGE nativo acoplado a immunoblots usando vários anticorpos fosfoespecíficos.

Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir uma análise detalhada da ativação dependente da fosforilação do fator de transcrição IRF3. Portanto, esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a resposta imune inata mediada pelo interferon. Como um patógeno ativa ou invade a expressão de interferon beta dependente de IRF3.A principal vantagem desta técnica é que ela constitui uma abordagem acessível e sensível para distinguir as diferentes formas ativadas por IRF3 que podem surgir após diferentes estímulos. Embora esse método forneça informações sobre a infecção viral de células humanas, ele também pode ser aplicado a tecidos de camundongos ou humanos sujeitos a outros patógenos ou padrões moleculares associados a patógenos. Demonstrando o procedimento estarão Alexa Robitaille e Melissa Mariani, duas especialistas em Simulink de células do meu laboratório.As células A549 utilizadas neste procedimento são mantidas em cultura em placa de 15 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em meio F-12K Ham completo. Vinte e quatro horas antes da infecção, tripsinizar as células conforme descrito no texto do protocolo e transferi-las para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 350 x G durante três minutos à temperatura ambiente.Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em oito mililitros de meio F-12K Ham completo para obter uma suspensão homogênea de célula única. Depois de contar as células usando um hemoctiômetro, semeie as células a uma densidade de um vezes o décimo ao sexto células por placa de 60 milímetros e quatro mililitros de meio F-12K Ham completo pré-aquecido. Incube por 20 a 24 horas a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono.Após 20 a 24 horas, as células devem formar uma monocamada 90% confluente. Remova o meio e lave as células com dois mililitros de meio F-12K Ham sem soro, ou SFM. Adicione dois mililitros de SFM fresco por placa de 60 milímetros.Diluir em alíquota descongelada do vírus de Sendai em SFM pré-aquecido para obter 60 unidades de hemaglutinação, ou HAU, por 100 microlitros. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, adicione 100 microlitros de vírus diluído gota a gota a cada placa para realizar a infecção a 40 HAU por 10 até a sexta célula. Não adicione vírus na placa de controle não infectada.Incube as células na incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono. Durante a primeira hora de infecção, agite as placas manualmente três ou quatro vezes. Duas horas após a infecção, adicione dois mililitros de meio de presunto F-12K contendo 20% de calor e FDS ativado, para obter uma concentração final de 10% de calor e FDS ativado.Incube as células na incubadora por mais uma, quatro e sete horas para atingir tempos totais de infecção de três, seis e nove horas, respectivamente. As células serão colhidas em cada um desses pontos de tempo para preparação de extratos de células inteiras, conforme demonstrado no próximo segmento de vídeo. Comece este procedimento removendo o meio de infecção.Colha as células raspando um mililitro de DPBS gelado. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro. Pulverizar as células por centrifugação a 16 000 x g a 4 graus Celsius durante 20 segundos.E decantar cuidadosamente todos os vestígios de DPBS. Ressuspenda o pellet celular em 70 microlitros de tampão de lise. Incube no gelo por 20 minutos.Congelar rapidamente o lisado por incubação num banho de azoto líquido durante 15 segundos. Em seguida, descongele o lisado à temperatura ambiente até que esteja completamente derretido. Vórtice por dez segundos.Repita este ciclo de congelamento-descongelamento-vórtice três vezes. Centrifugar a 16 000 x g a quatro graus Celsius durante 20 minutos. Transfira o sobrenadante, que é o extrato celular inteiro, para um novo tubo de centrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro.É importante manter os extratos celulares inteiros no gelo o tempo todo. Para resolver os extratos de células inteiras por SDS-PAGE de alta resolução, prepare três géis de eletroforese desnaturante, dois géis de 16 centímetros para a detecção de formas IRF3 e um gel de 8,5 centímetros para a detecção de proteínas do vírus Sendai. Carregue 14 microlitros de peso molecular padrão em um poço de cada gel de 16 centímetros.Em seguida, carregue 30 microgramas de extrato de células inteiras desnaturado por poço dos dois géis de 16 centímetros. Carregue sete microlitros de peso molecular padrão em um poço do gel de 8,5 centímetros. Carregue de oito a dez microgramas de extrato de células inteiras desnaturado por poço do gel de 8,5 centímetros.Execute os géis a uma corrente constante de 30 miliamperes até que a frente de migração atinja o fundo do gel. A migração tecnicamente dura aproximadamente três horas para um gel de 16 centímetros e 45 minutos para um gel de 8,5 centímetros. Comece esta análise preparando um gel de resolução não desnaturante de no mínimo 8,5 centímetros de comprimento, seguindo o procedimento do texto do protocolo.Pressione o aparelho de corrida no gelo aproximadamente até o nível do tampão de eletroforese da câmara inferior, mas certifique-se de que o gel não esteja no gelo. Pré-execute o gel a 40 miliamperes de corrente constante por 30 minutos no gelo. Durante a pré-execução, misture os extratos de células inteiras mantidos no gelo um a um com o buffer de carregamento Two-X Native-PAGE.Imediatamente no final da pré-execução, coloque oito a dez microgramas de extrato de células inteiras no gel. É importante carregar as amostras perto do fundo do poço para que a cintagem não seja perturbada. Execute o gel a 25 miliamperes de corrente constante no gelo, conforme demonstrado para a pré-execução, até que a frente de migração atinja o fundo do gel.Isso levará aproximadamente 40 minutos. Na conclusão de todas as corridas de gel, as proteínas são transferidas para as membranas de nitrocelulose e fixadas. O procedimento de transferência é descrito no texto do protocolo que acompanha o documento.As três membranas SDS-PAGE, mas não a membrana Native-PAGE, são coradas com solução vermelha de Ponceau para identificar os marcadores de peso molecular. Depois de incubar todas as quatro membranas de SDS-PAGE e Native-PAGE em solução de bloqueio, incubar as membranas com os anticorpos primários de acordo com a ordem sequencial mostrada neste diagrama. As membranas devem ser submetidas a cinco lavagens de cinco minutos em PBS-T antes da incubação com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano apropriados.Depois de remover vestígios de interpolação com PBS, incubar as membranas durante um minuto no volume de reagente de quimioluminescência melhorado suficiente para cobrir totalmente as membranas. Use papel de filtro para secar as membranas e, em seguida, coloque-as no analisador de imagem luminescente para visualizar as bandas imunorreativas. Antes da incubação com os próximos anticorpos primários, lave as membranas três vezes em PBS por cinco minutos de cada vez.Quando for necessária a remoção entre os anticorpos, incubar as membranas em solução de decapagem pré-aquecida a 50 graus Celsius durante 20 minutos sob agitação regular. Detalhes da análise de immunoblot podem ser encontrados no texto do protocolo que acompanha. Aqui é mostrada uma imagem típica de immunoblot de IRF3 detectada com anticorpos totais IRF3 e anticorpos fosfoespecíficos IRF3 contra Ser396 e Ser398, após alta resolução de extratos de células inteiras.Em células não estimuladas, o IRF3 é detectado como duas bandas correspondentes às espécies não fosforilada e hipofosforilada de IRF3. A exposição das células ao vírus Sendai resulta em uma mudança dependente do tempo para as formas hiperfosforiladas três e quatro de migração lenta, que também são especificamente imunodetectadas usando os anticorpos fosfoespecíficos contra Ser396 e Ser398. A figura a seguir mostra um perfil de detecção de IRF3 obtido a partir de extratos de células inteiras resolvidos por PAGE nativo, seguido por immunoblot usando anticorpos anti-IRF3 NES e anticorpos fosfoespecíficos contra Ser386.Em células não estimuladas, o IRF3 é detectado como uma única banda correspondente à forma momomérica. Após a infecção pelo vírus Sendai, os níveis de monômero IRF3 diminuem com o acúmulo concomitante de uma banda de migração lenta que corresponde à forma dimérica de IRF3, que também é especificamente imunodetectada usando anticorpos fosfoespecíficos contra Ser386. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a composição e o comprimento dos diferentes géis são essenciais para obter uma resolução adequada das fosforformas IRF3.Após este procedimento, outros métodos, como ligação ao DNA ou ácidos repórteres de genes, podem ser realizados para avaliar a atividade do IRF3. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como distinguir as diferentes formas ativas de IRF3. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser perigoso e as manipulações devem ser realizadas de acordo com as diretrizes de biossegurança de sua instituição anfitriã.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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