A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

O objetivo geral desse fluxo de trabalho baseado em filtro único é purificar N-glicanos e proteínas de forma fácil e quantitativa em conjunto a partir de amostras biológicas de análise de espectrometria de massa. A escalabilidade, velocidade e reprodutibilidade analítica deste método o tornam diretamente acessível em relação a recursos e conjuntos de habilidades para laboratórios de espectrometria de massa biológica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os pesquisadores investiguem questões de glicômica, ocupação do local de glicosilação e proteômica simultaneamente em estudos biológicos de alto rendimento em larga escala.

Superamos os desafios das medições de N-glicano acoplando esse método a uma estratégia de derivitização personalizada por espectrometria de massa, resultando em quantificação precisa e relativa entre o câncer e os estados de controle. Com variabilidade analítica reduzida, novas interações biológicas podem ser elucidadas entre o glicoma e o proteoma, produzindo informações importantes sobre os estados da doença e novas oportunidades para a descoberta de biomarcadores. Para começar, carregue 2,5 microlitros de plasma em um filtro.

Em seguida, adicione 2 microlitros de solução de ditiotreitol 1M a cada amostra no filtro. Dilua a amostra com 200 microlitros de tampão de digestão PNGase de bicarbonato de amônio 100-MM. Tampe o tubo de amostra do filtro e bata levemente, tomando cuidado para não perturbar o filtro de sua sede.

Incube a amostra a 56 graus Celsius por 30 minutos para desnaturar as proteínas e glicoproteínas. Para alquilar as amostras, adicione 50 microlitros de iodoacetamida 1M para obter uma concentração final de aproximadamente 200 mM. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 60 minutos.

Concentrar a glicoproteína desnaturada no filtro, centrifugando as amostras a 14 000 x g durante 40 minutos antes de rejeitar o fluxo. Lave a amostra com 100 microlitros de tampão de digestão PNGase. Concentre a glicoproteína no filtro e descarte o fluxo.

Repita a etapa de lavagem e concentração duas vezes para um total de três vezes, produzindo um concentrado no volume morto do filtro. Descarte todo o fluxo e o frasco de coleta assim que as lavagens estiverem concluídas. Em seguida, adicione 2 microlitros de peptídeo livre de glicerol N-glicosidase F ou PNGase F ao filtro após transferir para um frasco de coleta fresco.

Adicione 98 microlitros de tampão de digestão PNGase, elevando o volume total para 100 microlitros, e pipete suavemente para cima e para baixo no filtro para misturar. Para o protocolo de pico na digestão, incube as amostras a 50 graus Celsius por 2 horas. Trabalhando rapidamente, remova as amostras e coloque mais 2 microlitros de PNGase sem glicerol F. Leve o vórtice das amostras por 1 a 2 segundos para misturar.

Incube as amostras a 50 graus Celsius por mais 2 horas. Depois de iludir os glicanos centrifugando a amostra a 20 graus Celsius, adicione 100 microlitros de tampão de digestão PNGase ao filtro e centrifugue novamente. Recolher a lavagem que contém o glicano ligado a N restante no mesmo frasco para injetáveis de recolha que o eluente.

Depois de repetir duas vezes, remova o filtro e coloque em um novo frasco de coleta para preparação proteômica. Em seguida, incube as amostras de glicano no freezer de 80 graus Celsius por 30 a 60 minutos até congelar. Em seguida, secar até a conclusão em temperatura ambiente em um concentrador a vácuo por 4 a 6 horas.

Enxágue o filtro que contém os peptídeos desanimados com 400 microlitros de tampão de ureia 8M. Tampe o frasco de coleta e bata levemente para misturar. Concentre os peptídeos no filtro antes de descartar todo o fluxo.

Depois de repetir a lavagem do tampão de uréia mais duas vezes, enxágue o filtro contendo os peptídeos desanimados com o tampão de digestão de tripsina. Tampe o frasco de coleta e bata levemente para misturar antes de concentrar no filtro novamente como antes. Descarte todo o fluxo e repita 2 vezes adicionais para um total de 3 lavagens de tampão de digestão de tripsina.

Colete todos os eluentes e lavagens futuros em um novo frasco de coleta. Em seguida, adicione 50 microlitros de tripsina modificada por suínos em uma proporção de 1:50 de tripsina para proteína para proteômica de descoberta ou uma proporção de 1:5 de tripsina para proteína para experimentos de proteômica quantitativa. Tampe o frasco de coleta e bata levemente para misturar.

Depois de incubar as amostras a 37 graus Celsius por 2 horas, trabalhe rapidamente para remover as amostras e coloque mais 50 microlitros de tripsina na proporção apropriada de tripsina para proteína. Agite levemente as amostras por 1 a 2 segundos para misturar. Em seguida, incube a 50 graus Celsius por mais 2 horas.

Após a eluição dos peptídeos centrifugando como antes por 20 minutos, enxágue os peptídeos restantes do filtro com tampão de têmpera. Eluir o filtro centrifugando como antes por 15 minutos. Depois de quantificar a concentração de peptídeos nas amostras, incubar as amostras de peptídeos no freezer de 80 graus Celsius até congelar.

Em seguida, secar até a conclusão em temperatura ambiente em um concentrador a vácuo por 4 a 6 horas. Em seguida, as proteínas trípticas imediatamente antes da cromatografia líquida, espectrometria de massa ou análise LCMS na fase móvel A até a concentração desejada. As concentrações de peptídeos trípticos de 2,5 microlitros de plasma variam de 100 a 300 nanogramas por microlitro.

Antes da análise do glicano, reconstitua os reagentes de isótopo estável seco marcado com 4-fenetil benzohidrazida, bem como os reagentes nativos de P2GPN em um mililitro de solução de derivitização para uma concentração final de 0,25 miligramas por mililitro. Os reagentes levarão até 10 minutos para solubilizar totalmente. Vórtice extensivamente para garantir a solubilização completa.

Marque os N-glicanos secos com 200 microlitros de reagente P2GPN nativo ou marcado com isótopos estáveis. Pipete para cima e para baixo para ressuspender os glicanos secos. Em seguida, vortex as amostras e gire para baixo por aproximadamente 5 segundos em uma centrífuga de bancada.

Reaja os glicanos com o reagente por 3 horas a 56 graus Celsius. Transfira imediatamente os glicanos da incubadora para o concentrador a vácuo e seque até a conclusão a 55 graus Celsius por 3 a 5 horas. Ressuspenda o N-glicano marcado em 25 a 50 microlitros de água imediatamente antes da análise de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Pipete para cima e para baixo para garantir que os N-glicanos sejam totalmente solubilizados. Depois de centrifugar as amostras como antes por 5 minutos, remova o sobrenadante, tomando cuidado para não deixar a ponta da pipeta tocar o fundo do tubo de centrífuga. Combine um par de amostras nativas e marcadas com isótopos estáveis em uma proporção de 1:1 para análise em tandem de quantificação relativa.

Prepare 2 métodos LCMS diferentes para os fluxos de trabalho de proteômica e glicômica. Para análise de proteínas, injete aproximadamente 400 nanogramas de proteína na coluna em NPA. Execute a amostra a 300 nanolitros por minuto, com um equilíbrio de pré-coluna de 1 microlitro e um equilíbrio de coluna analítica de 5 microlitros.

Ionize as proteínas sob as condições de MS fornecidas no protocolo de texto. Para análise de glicano, injete 5 microlitros de amostras equi-M nativas e marcadas com isótopos estáveis ressuspensas na coluna. Execute a amostra a 300 nanolitros por minuto com equilíbrio pré-coluna de 2 microlitros e equilíbrio de coluna analítica de 5 microlitros.

Em seguida, ionize os glicanos sob as condições de MS fornecidas no protocolo de texto. O protocolo de purificação baseado em filtro foi comparado ao método padrão de extração em fase sólida e as abundâncias de glicanos plasmáticos detectadas entre os 2 protocolos não foram significativamente diferentes. Em ambos os métodos, os mesmos glicanos encontrados perto do limite de detecção, onde a variabilidade aumenta.

A intervariabilidade para misturas equiM de plasma purificado pelo protocolo de extração em fase sólida baseado em filtro ou padrão foi avaliada. Ambos os protocolos tinham distribuições gaussianas cujas médias não eram significativamente diferentes de zero. 80% dos glicanos caíram em uma mudança dupla.

As distribuições de peso molecular dos glicanos detectadas nos protocolos de purificação novos e tradicionais não foram significativamente diferentes e cobriram a mesma faixa. Qualitativamente, nenhum viés entre os glicanos foi observado. As proteínas plasmáticas foram preparadas por preparação de amostra assistida por filtro padrão e vários protocolos em linha.

O número de proteínas identificadas foi semelhante para os vários protocolos. A desamidação inespecífica foi controlada em protocolos de digestão por microondas e indigestão de pico para menos de 10 por cento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a ocupação precisa do local de glicosilação depende da minimização do calor e da exposição ao tempo.

Uma vez dominada, a purificação do N-glicano pecurikene em linha pode ser concluída em 2 dias. Seguindo este procedimento, a quantificação precisa da proteína N-glicano e a ocupação do local de glicosilação podem ser integradas e modeladas usando técnicas estatísticas de ordem superior. Essa técnica oferece a capacidade de ler rapidamente a linguagem complexa que a biologia do câncer fala, comparar quantitativamente as diferenças na terapêutica de proteínas e revelar verdadeiramente a importância da glicosilação em um contexto biológico.