Name: A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a purificar e quantificar simultaneamente N-glicanos e proteínas do plasma usando LC-MS/MS. Este método de alta vazão melhora a precisão analítica e facilita estudos de glicômica e proteômica em larga escala.

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Esta pesquisa foi generosamente financiada pelo NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), pelo NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology no NC State Grant (T32GM008776), pelo Programa de Bolsas GAANN do Departamento de Educação dos EUA em Biotecnologia Molecular no NC State Grant (P200A140020), pela WM Keck Foundation e pela North Carolina State University. O plasma de galinha foi obtido com a ajuda do Dr. James N. Petitte e Rebecca Wysocky no Departamento de Ciência Avícola da Universidade Estadual da Carolina do Norte.

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<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
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</ol>

Temos uma relação de colaboração com a Cambridge Isotope Laboratories (CIL) para disseminar o reagente e a tecnologia P2GPN para a comunidade científica mais ampla na forma de um produto (GTK-1000). No entanto, não recebemos nenhuma receita com base na venda deste produto.

Métodos quantitativos de alto rendimento são necessários para facilitar a análise rotineira de glicanos. Nos últimos trinta anos, a análise glicômica foi limitada a um subconjunto de grupos de pesquisa, apesar de sua importância em doenças, aplicações clínicas e farmacêuticas. O método de purificação e marcação FANGS-P2GPN para glicômica e proteômica realiza a mesma análise em uma única alíquota de amostra, reduzindo o custo de suprimentos e a quantidade de material necessário (particularmente importante em estudos em humanos e camundongos). Além disso, os esforços para minimizar a variabilidade nas preparações são extremamente importantes, pois cada etapa adicional contribui para o erro, potencialmente mascarando mudanças importantes, mas pouco abundantes, nos estudos de caso-controle. O acoplamento de FANGS à marcação de hidrazida hidrofóbica permite que amostras de proteínas e glicanos sejam executadas na mesma coluna RPLC, aumenta a ionização de glicanos, fornece quantificação relativa e pode ser aplicada quantitativamente ao plasma.
Para a análise de N-glicanos, é fundamental usar o nível sugerido de PNGase F para atingir a desglicosilação completa. Embora os glicanos sejam expostos a solventes, a desnaturação das proteínas e o excesso de enzimas ajudam a garantir uma clivagem eficiente e completa. Para uma quantificação precisa dos glicanos, é necessário garantir que eles estejam completamente secos após a derivatização para extinguir a reação e evitar reações cruzadas ao misturar as espécies NAT e SIL. Finalmente, ao estender o fluxo de trabalho para a análise de glicossítios, o tempo das etapas é fundamental para minimizar a desamidação não específica. Os protocolos modificados fornecidos para análise combinada de glicômica e proteômica funcionam de forma consistente quando realizados de acordo.
O fluxo de trabalho alcança a quantificação relativa precisa de N-glicanos do plasma em comparação com o método SPE padrão-ouro. Não há viés aparente nos tipos de glicanos extraídos em termos de peso molecular, hidrofilicidade e estrutura composicional. Embora não tenhamos explorado a análise qualitativa de glicanos ligados a O, esperamos que o FANGS possa acomodar a adição de uma etapa de eliminação de β após a digestão da PNGase F de glicanos ligados a N. No entanto, os procedimentos exigiriam modificações significativas para a limpeza do reagente antes da espectrometria de massa, e a análise de peptídeos será significativamente afetada. Para proteômica, a mesma profundidade de cobertura de proteoma é alcançada em comparação com os métodos tradicionais de FASP. É importante ressaltar que os métodos atingem uma taxa mínima de descoberta falsa para desamidação de N-glicanos. Embora o método seja compatível com a marcação de 18O de Asn durante a etapa de digestão da PNGase22,23, a baixa taxa de descoberta de falso local de glicosilação sugere que pode não ser necessário, reduzindo ainda mais os custos e a complexidade.
O proteoma não é enriquecido para glicoproteínas neste método, o que tem vantagens e desvantagens. Certas glicoproteínas pouco abundantes podem não ser detectadas na análise. No entanto, a ocupação de sítios glicosilados por proteína, pode ser comparada entre amostras biológicas. Além disso, o erro e o viés introduzidos na purificação da afinidade da lectina ou no enriquecimento químico são eliminados. Em conclusão, o acoplamento de FANGS à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano resulta em um método simplificado, quantitativo e de alto rendimento para a análise em tandem do glicoma e do proteoma com grande potencial de aplicação em estudos clínicos de caso-controle.

No campo de proteómica, a preparação da amostra do filtro auxiliado (FASP) tem sido amplamente adoptada para a sua capacidade de minimizar a quantidade de material de partida, diminuir a amostra de preparação de artefactos, e maximizar a taxa de transferência de amostra 1. No entanto, um tal processo tem ainda a surgir e ganhar espaço para o campo de glycomics. Desenvolvimento de high-throughput, os fluxos de trabalho quantitativos são necessários por causa do papel integrante da glicosilação em defesa biológica e sua modulação por câncer ou doenças 2,3. Nos mamíferos, N-glicanos são constituídos por unidades de repetição de sacarídeos (hexoses (HEX), hexosaminas (HexNAc), ácidos siálicos (NeuAc), e fucoses (Fuc)), que decoram uma estrutura de núcleo (Hex 3 HexNAc 2) 4 ligado covalentemente para asparagina. Embora o glycospace é consideravelmente grande quando isómeros são contados (&gt; 10 12), ela é muito pequena numa base composição e pesos moleculares variam tipicamente de 1,000-8,000 Da 5 &lt;/ Sup&gt;. A homogeneidade de composição da classe e suas propriedades hidrofílicas de glicanos representam desafios únicos para purificação, separação e espectrometria de massa (MS) fluxos de trabalho 6. Tradicionalmente, os N-glicanos são digeridos a partir de proteínas ou péptidos por pï¿½tido N -glycosidase F (PNGase F) e, em seguida, enriquecido por cromatografia por afinidade de lectina 7, capturado por esferas de hidrazida 8, ou purificados por meio de extracção em fase sólida (SPE) 9,10. Enquanto estes métodos são altamente eficazes, eles introduzem passos extra para dessalinização e limitar o número de amostras simultaneamente processados. Durante a última década, têm sido propostos uma série de plataformas de alto rendimento para glycomics. Kim et ai. Publicado um método semi-automatizado usando, uma placa de SPE de 96 poços operado a vácuo 11. Alternativamente, um método de afinidade-filtro (N -glyco-FASP) foi desenvolvido pelo grupo de Mann, que exigiu a derivação inicial do filtro com uma composição de lectinas 12. Por último, o grupo Thomas-Oates proposto um método semi-quantitativo, o filtro de separação Aided N-glicano (PRESAS), o qual explorado o tamanho de composição estreita do glycospace 13. Baseando-se no peso molecular filtros de corte, pequenos contaminantes foram primeiro lavadas para o lixo e, em seguida N-glicanos foram digeridos e fluido. proteínas desglicosiladas permanecem no filtro no presente protocolo, e pode ser submetido a FASP em-linha. A identificação e quantificação dos glicanos por ionização por electrospray (ESI) MS requer separações off-line para resolução (parcial) de isómeros e derivatização para a detecção de espécies de baixo abundantes. Rotulagem na individualidade quando normalizar com a estratégia de glicano etiquetas hidrazida confere compatibilidade com cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) 14,15. O 4-fenetil-benzo-hidrazida (P2PGN) tag hidrofóbico medeia a hidrofilicidade dos glicanos, ENHancing ionização por, em média, quatro vezes 16. Embora outras técnicas, tais como a permetilação 17 ou químicos de marcação reactivo a amina 18, oferecem vantagens semelhantes, na reacção hidrazida, glicanos são feitos reagir 1: 1 estequiometricamente em condições fáceis. A quantificação relativa ser efectuada por análise conjunto de amostras derivados com nativa (NAT) ou 13 C 6 etiquetas estável isótopos (SIL). O método a seguir evolui FANGS para aplicações de plasma e casais se para a tag hidrofóbico P2GPN para a quantificação relativa preciso. Além disso, ele foi projetado para executar proteômica shot-gun, profiling desamidação e glycomics quantitativos em uma única alíquota de amostra, sem comprometer a integridade das análises.

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético (50%)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, grau HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Amônio</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Reagente Bradford A6141</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>B6916</td><td>Alternativa: Kit de ácido bicinchonínico (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>Centrífugas alternativas que atingem 14.000 x g são adequadas</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol, 1&nbsp; M em solução</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120 LCs</td><td>alternativos de nano ou ultra alta pressão produzirão dados semelhantes, como: 1. Dionex UltiMate&Ograve; 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Águas).</td></tr><tr><td>Suporte para Tubos Flutuantes</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fornos de Laboratório Padrão Isotemp da Fisher Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>Incubadoras alternativas que atingem 56&nbsp; &deg; C são adequados</td></tr><tr><td>para Ácido Fórmico</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td>Forno Microondas <td>GE 56302</td><td></td></tr><tr><td>General</td><td>Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>Qualquer micro-ondas com configurações de potência ajustáveis é adequado</td></tr><tr><td>Kit de Marcação de Glicanos INLIGHT&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>O kit INLIGHT fornece versões NAT e SIL do reagente P2GPN.</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &, C18 fase estacionária a granel</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>Alternativa de mídia em massa</td><td>: Qualquer fase C18 estacionária 5&nbsp; </td></tr><tr><td>mM Mascot Daemon Software e Server</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternativa: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>Metanol, grau HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Self-Pack Coluna: 360&nbsp; &#956; m, OD 75&nbsp; &#956; m ID, 15&nbsp; &#956; m, não revestido, 5 por caixa, 50 cm</td><td>Novo Objective</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (sem glicerol), 75.000&nbsp; unidades/ml</td> Espectrômetro de Massa Híbrido Quadrupolo-Orbitrap Q Exactive HF da <td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Precisão alternativa de alta massa (5&nbsp; ppm) espectrômetros de massa fornecerão dados semelhantes</td></tr><tr><td>RNase B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina do Pâncreas Suíno</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Concentrador de Vácuo 51456</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de Vácuo Savant SPD131DDA SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>Concentradores de vácuo alternativos são adequados</td></tr><tr><td>Filtros Vivacon 500 30 kDa&nbsp;</td><td>Alternativa VN01H22 da Sartorius Stedim Biotech</td><td></td><td>: Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra 0.5 com Ultracel-10&nbsp; Membrana kDa (Millipore UFC501096)</td></tr> <tr><td>Água, grau HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Água, 18O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>A adição de 18O na etapa de digestão da PNGase F é opcional e pode não ser necessária para estudos de desamidação concluídos com 95% de confiança</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative glycomics e proteomics combinada estratégia de purificação

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Há um desejo crescente nas ciências biológicas e clínicas de integrar e correlacionar várias classes de biomoléculas para desvendar a biologia, definir caminhos, melhorar o tratamento, entender doenças e ajudar na descoberta de biomarcadores. A glicosilação ligada a N é uma das modificações pós-traducionais mais importantes e robustas em proteínas e regula funções celulares críticas, como sinalização, adesão e função enzimática. As técnicas analíticas para purificar e analisar N-glicanos permaneceram relativamente estáticas na última década. Embora precisos e eficazes, eles geralmente exigem conhecimentos e recursos significativos. Embora alguns esquemas de purificação de alto rendimento tenham sido desenvolvidos, eles ainda não encontraram ampla adoção e muitas vezes dependem do enriquecimento de glicopeptídeos. Um método promissor, desenvolvido por Thomas-Oates et al., separação de N-glicanos auxiliada por filtro (FANGS), foi demonstrado qualitativamente em tecidos. Aqui, adaptamos o FANGS ao plasma e o acoplamos à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano, a fim de obter quantificação relativa precisa por cromatografia líquida, espectrometria de massa e ionização por eletrospray aprimorada. Além disso, projetamos uma nova funcionalidade para o protocolo, obtendo tandem, proteômica shotgun e análise do local de glicosilação no plasma de galinha. Mostramos que os N-glicanos purificados em filtro e derivatizados por marcadores hidrofóbicos de hidrazida foram comparáveis em termos de abundância e classe aos da extração em fase sólida (SPE); este último é considerado um padrão-ouro na área. É importante ressaltar que a variabilidade nos dois protocolos não foi estatisticamente diferente. Os dados proteômicos coletados de acordo com os dados glicômicos tinham a mesma profundidade em comparação com um resumo padrão de tripsina. A desamidação do peptídeo é minimizada no protocolo, limitando a desamidação inespecífica detectada nos motivos de glicosilação. Isso permitiu a análise direta do local de glicosilação, embora o protocolo também possa acomodar a marcação do local de 18O. No geral, demonstramos um novo protocolo baseado em filtro imparcial e de alto rendimento em linha para análise quantitativa de glicômica e proteômica.

<img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> Figura 1:. O esquema do método FANGS-P2GPN marcação hidrofóbico acoplado (Método A) para a proteômica e glycomics combinados análise é dado passos que diferem entre glycomics de processamento e em tandem Glycomics apenas e análise do proteoma e com identificação do local de glicosilação, são destacados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A in-line e proteómica glycomics, P2GPN método de marcação hidrófobo à base de filtro (Método A) foi validado para a identificação, quantificação, e polarização peso molecular usando amostras de plasma de galinha em pool (Figura 1). Para exclusiva experimentos Glycomics, inter-comparações nas abundâncias de N-glicanos extraído pelo métodoA a carbograph SPE (ouro-padrão, Método B) foram feitas (Figura 2). Não houve diferenças significativas nas abundâncias de glicanos entre os dois métodos. A variabilidade intra-foi também avaliada quantificando-se a SIL: NAT proporção de glicanos extraídos pelo mesmo método. Os log 2 -distributions de ambos os métodos foram gaussiano, centrada no zero, e não é significativamente diferente (Figura 3A-B). O peso molecular varia entre os dois protocolos completamente sobrepostas, sugerindo que o filtro não discriminaram N-glicanos com base no intervalo de peso molecular e de hidrofilicidade (Figura 4). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> Figura 2: Uma mistura equimolar de NAT e SIL N-glicanos extraiu-se pelo Método A ou Método B foi preparado a partir de 2,5 mL de plasma de galinha (n = 4) As amostras foram Anal.yzed por UPLC-MS de acordo com os parâmetros recomendados sugeridas na secção 6. As abundâncias para cada glicano, em cada canal NAT / SIL, foram calculados por integração da área sob o cromatograma de iões extraídos (MMA = 3 ppm), corrigindo para o molecular sobreposição de peso e ajuste pelo TGNF. Estas proporções são mostrados com os seus erros padrões. As abundâncias de Método B: Método A glicanos N não foram significativamente diferentes (p&gt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> Figura 3: A variabilidade intra-no (A) Método A (n = 133) ou (B) Método B (n = 123) foi comparada estratégias. NAT e SIL misturas equimolares de N-glicanos, a partir do mesmo esquema de extracção, Foram analisadas mais de três repetições técnicas. O log 2 -distributions foram centradas em zero e não foram significativamente diferentes entre os dois fluxos de trabalho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> Figura 4: As gamas de pesos moleculares de glicanos a partir de cada uma das estratégias foram comparados. Os dois fluxos de trabalho rendeu glicanos abrangendo a mesma faixa de peso molecular. N-glicanos detectado em um protocolo contra o outro caiu um pouco acima do limite de detecção (1 × 10 5 abundância) e não refletem tendência sistemática. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-page = &quot;1&quot;&gt; A retenção das proteínas desglicosilada pelo filtro peso molecular ativado in-line proteoma ampla análise e local de glicosilação identificação. Vários protocolos para a purificação combinada de glicanos e proteínas foram comparados com uma preparação FASP tradicional sem desglicosilação (Tabela 5). O nosso filtro típico de 18 horas com base PNGase F digestão, seguido por digestão de tripsina FASP (protocolo Std) resultaram em níveis significativos de desamidação não-específica, o que pode interferir com a identificação de glycosites. Por conseguinte, um método utilizando um tempo de incubação mais curto a temperatura elevada (50 ° C) e um passo de pico-a PNGase F (protocolo SPI) foi explorada como uma alternativa, juntamente com um protocolo de digestão microondas (protocolo MD), para minimizar não- desamidação específica. Os glicanos observadas nos novos métodos de digestão não foram significativamente diferentes em composições ou abundâncias do padrão 18 horas, 37 ° C filtro PNGase F digest ( <strong&gt; Figura 5). Combinado com uma curta incubação de tripsina, desamidação não específica foi significativamente reduzida, com uma taxa de falsos positivos para glycosites &lt;5% (Tabela 5). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> proteínas </td><td></td><td colspan="4"> peptídeos </td><td></td><td colspan="4"> péptidos desamidados </td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4"> glicoproteínas </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> MD </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> 10 </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . Tabela 5: Comparação de dados proteomic de uma tripsina padrão digerir versus o método de marcação em-linha PRESAS-P2GPN foram feitas preparações foram realizadas com (+) e sem (-) de PNGase F para determinar as taxas de desamidação e estimativa não específica de fundo glycosite taxas de falsos positivos. As proteínas foram identificadas com 1% de taxa de descoberta de falsas (FDR); peptídeos foram filtradas com base na confiança peptídeo &quot;alta&quot; em Proteome Discoverer 1.4 (q &lt;0,01); glycosites foram identified com base em sequências únicas contendo desamidação do motivo conservado de glicosilação (NXS / T); e glicoproteínas foram definidos como proteínas identificadas contendo, pelo menos, um glycosite identificado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> Figura 5: encurtado protocolos para glicanos foram desenvolvidos para minimizar a desaminação das amostras e em comparação com o 18hr PRESAS PNGase F Digest. As diferenças médias em abundâncias foram de 10% e 5% para o MD (2.2.3) e (2.2.2) SPI protocolos, respectivamente. Dos 48 glicanos identificados, 90% apresentaram menor que a variação de 1,5 vezes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

O objetivo geral deste fluxo de trabalho baseado em um único filtro é purificar de forma fácil e quantitativa N-glicanos e proteínas em conjunto a partir de amostras biológicas para análise por espectrometria de massas. A escalabilidade, velocidade e reprodutibilidade analítica deste método tornam-no diretamente acessível, em termos de recursos e conjuntos de habilidades, aos laboratórios de espectrometria de massas biológicas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite aos pesquisadores investigar simultaneamente questões de glicômica, ocupação de sítios de glicosilação e proteômica em estudos biológicos de grande escala e alto rendimento.Superamos os desafios das medições de N-glicanos acoplando este método a uma estratégia de derivatização adaptada à espectrometria de massas, resultando em quantificação relativa precisa entre estados de câncer e controle. Com a variabilidade analítica reduzida, novas interações biológicas podem ser elucidadas entre o glicoma e o proteoma, fornecendo insights fundamentais sobre estados de doenças e novas oportunidades para a descoberta de biomarcadores. Para começar, carregue 2,5 microlitros de plasma em um filtro.Em seguida, adicione 2 microlitros de solução de ditiotreitol 1 M a cada amostra no filtro. Dilua a amostra com 200 microlitros de tampão de digestão PNGase de bicarbonato de amônio 100 mM. Tampe o tubo de amostra do filtro e vortexie suavemente, tomando cuidado para não deslocar o filtro de sua posição.Incube a amostra a 56 graus Celsius por 30 minutos para desnaturar as proteínas e glicoproteínas. Para alquilar as amostras, adicione 50 microlitros de iodoacetamida 1 M para obter uma concentração final de aproximadamente 200 mM. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 60 minutos.Concentre a glicoproteína desnaturada no filtro por meio da centrifugação das amostras a 14.000 x g durante 40 minutos antes de descartar o fluxo passante. Lave a amostra com 100 microlitros de tampão de digestão PNGase. Concentre a glicoproteína no filtro e descarte o fluxo passante.Repita a etapa de lavagem e concentração duas vezes, totalizando três vezes, obtendo um concentrado no volume morto do filtro. Descarte todo o fluxo passante e o frasco coletor assim que as lavagens forem concluídas. Em seguida, adicione 2 microlitros de peptídeo N-glicosidase F sem glicerol ou PNGase F ao filtro após transferi-lo para um frasco coletor novo.Adicione 98 microlitros de tampão de digestão PNGase, completando o volume total a 100 microlitros, e pipete suavemente para cima e para baixo no filtro para homogeneizar. Para o protocolo de digestão com adição, incube as amostras a 50 graus Celsius por 2 horas. Trabalhando rapidamente, retire as amostras e adicione 2 microlitros adicionais de PNGase F livre de glicerol. Vortexie levemente as amostras por 1 a 2 segundos para misturar.Incube as amostras a 50 graus Celsius por mais 2 horas. Após a eluição dos glicanos por centrifugação da amostra a 20 graus Celsius, adicione 100 microlitros de tampão de digestão PNGase ao filtro e centrifugue novamente. Colete a lavagem contendo quaisquer glicanos N-ligados remanescentes no mesmo frasco de coleta que o eluato.Após repetir duas vezes, remova o filtro e coloque-o em um novo tubo de coleta para o preparo em proteômica. Em seguida, incube as amostras de glicanos no congelador a 80 graus Celsius por 30 a 60 minutos, até congelar completamente. Depois, seque por completo em temperatura ambiente em um concentrador a vácuo por 4 a 6 horas.Lave o filtro contendo os peptídeos desaminados com 400 microlitros de tampão de ureia 8 M. Tampe o frasco de coleta e vortexe suavemente para misturar. Concentre os peptídeos no filtro antes de descartar todo o fluxo passante.Após repetir a lavagem com tampão de ureia mais duas vezes, enxágue o filtro contendo os peptídeos desaminados com tampão de digestão da tripsina. Tampe o frasco de coleta e vortexe suavemente para homogeneizar antes de concentrar novamente no filtro, como anteriormente. Descarte todo o fluxo passante e repita mais 2 vezes, totalizando 3 lavagens com tampão de digestão da tripsina.Colete todos os eluentes e lavagens futuros em um novo frasco de coleta. Em seguida, adicione 50 microlitros de tripsina modificada de porco numa proporção de 1:50 (tripsina:proteína) para proteômica exploratória ou numa proporção de 1:5 (tripsina:proteína) para experimentos de proteômica quantitativa. Tampe o frasco de coleta e vortexe levemente para homogeneizar.Após incubar as amostras a 37 graus Celsius por 2 horas, trabalhe rapidamente para remover as amostras e adicionar 50 microlitros adicionais de tripsina na proporção apropriada de tripsina para proteína. Vortexie levemente as amostras por 1 a 2 segundos para homogeneizar. Em seguida, incube a 50 graus Celsius por mais 2 horas.Após a eluição dos peptídeos por centrifugação, como antes, por 20 minutos, lave os peptídeos remanescentes no filtro com tampão Quench. Elua do filtro por centrifugação, como antes, por 15 minutos. Após quantificar a concentração de peptídeos nas amostras, incube as amostras de peptídeos no congelador a 80 graus Celsius até congelar.Em seguida, seque completamente à temperatura ambiente em um concentrador a vácuo por 4 a 6 horas. Em seguida, reconstitua as proteínas digeridas com tripsina imediatamente antes da análise por espectrometria de massa com cromatografia líquida ou LCMS, em fase móvel A, até a concentração desejada. As concentrações de peptídeos triptícos obtidos a partir de 2,5 microlitros de plasma variam de 100 a 300 nanogramas por microlitro.Antes da análise de glicanos, reconstitua os reagentes secos de 4-fenetil benzo-hidrazida marcados com isótopos estáveis, bem como os reagentes P2GPN nativos, em um mililitro de solução de derivatização para uma concentração final de 0,25 miligrama por mililitro. Os reagentes podem levar até 10 minutos para se solubilizarem completamente. Agite vigorosamente em vórtex para garantir a solubilização completa.Marque os N-glicanos secos com 200 microlitros de reagente P2GPN marcado com isótopo estável ou nativo. Pipete para cima e para baixo para re-suspender os glicanos secos. Em seguida, vortexe as amostras e centrifugue por aproximadamente 5 segundos em uma centrífuga de bancada.Reaja os glicanos com o reagente por 3 horas a 56 graus Celsius. Transfira imediatamente os glicanos do incubador para o concentrador a vácuo e seque completamente a 55 graus Celsius por 3 a 5 horas. Re-suspenda o N-glicano marcado em 25 a 50 microlitros de água logo antes da análise por cromatografia líquida e espectrometria de massas.Pipete para cima e para baixo para garantir que as N-glicanas estejam completamente solubilizadas. Após centrifugar as amostras como antes por 5 minutos, remova o sobrenadante, tomando cuidado para não deixar a ponta da pipeta tocar o fundo do tubo de centrífuga. Combine um par de amostras nativas e marcadas com isótopos estáveis em uma proporção de 1:1 para análise tandem de quantificação relativa.Prepare 2 métodos diferentes de CLAE para os fluxos de trabalho de proteômica e glicômica. Para análise de proteína, injete aproximadamente 400 nanogramas de proteína na coluna em NPA. Execute a amostra a 300 nanolitros por minuto, com uma equilibração pré-coluna de 1 microlitro e uma equilibração da coluna analítica de 5 microlitros.Ionize as proteínas nas condições de EM fornecidas no protocolo do texto. Para análise de glicanos, injete 5 microlitros de amostras nativas marcadas com P2GPN e amostras equi-M marcadas com isótopo estável, ressuspendidas, na coluna. Execute a amostra a 300 nanolitros por minuto com equilibração pré-coluna de 2 microlitros e equilibração da coluna analítica de 5 microlitros.Em seguida, ionize os glicanos nas condições de espectrometria de massas fornecidas no protocolo do texto. O protocolo de purificação baseado em filtro foi comparado ao método padrão de extração em fase sólida e as abundâncias dos glicanos plasmáticos detectados entre os dois protocolos não diferiram significativamente. Em ambos os métodos, os mesmos glicanos encontrados próximos ao limite de detecção apresentaram maior variabilidade.A intervariabilidade para misturas equiM de plasma purificado pelo protocolo de extração em fase sólida baseado em filtro ou pelo padrão foi avaliada. Ambos os protocolos apresentaram distribuições gaussianas cujas médias não diferiram significativamente de zero. Oitenta por cento dos glicanos estavam dentro de uma variação de duas vezes.As distribuições de pesos moleculares dos glicanos detectados nos protocolos de purificação novo e tradicional não foram significativamente diferentes e abrangeram a mesma faixa. Qualitativamente, não foi observado nenhum viés entre os glicanos. As proteínas plasmáticas foram preparadas por meio de preparação padrão de amostras com auxílio de filtro e múltiplos protocolos em linha.O número de proteínas identificadas foi semelhante para os diversos protocolos. A desamidação não específica foi controlada nos protocolos de digestão por micro-ondas e de adição de indigestão abaixo de 10 por cento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a ocupação precisa do sítio de glicosilação depende da minimização da exposição ao calor e ao tempo.Uma vez dominado, o procedimento de purificação de N-glicanos pecurikene em linha pode ser concluído em 2 dias. Ao seguir este protocolo, a quantificação precisa de N-glicanos proteicos e a ocupação dos sítios de glicosilação podem ser integradas e modeladas utilizando técnicas estatísticas de ordem superior. Esta técnica permite decodificar rapidamente a linguagem complexa utilizada pela biologia do câncer, comparar quantitativamente as diferenças em terapêuticos proteicos e revelar verdadeiramente a importância da glicosilação em um contexto biológico.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Este vídeo descreve um método para extrair e purificar peptídeos ubiquitinilados contendo peptídeos de diglicina remanescentes de uma mistura complexa de peptídeos. O método apresentado pode ajudar na identificação de locais de ubiquitinação originais na proteína.

Extração baseada em imunoafinidade de peptídeos ubiquitinilados: uma técnica para extrair seletivamente peptídeos marcados com ubiquitina de frações peptídicas purificadas

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

A fim de explorar de forma abrangente a diversidade de glicanos ligados a O, um novo procedimento para eliminação de β redutora em gel, combinado com permetilação e um método de partição rápida de fase, é aplicado à análise de glicanos ligados a O diretamente liberados de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE e passíveis de análise glicômica subsequente por espectrometria de massa.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

O presente protocolo descreve a precipitação de proteínas à base de solventes em condições controladas para recuperação e purificação robustas e rápidas de amostras de proteome antes da espectrometria de massa.

Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Um sistema para a análise automatizada e rápida de glicanos em proteínas foi desenvolvido anteriormente. Este artigo apresenta o protocolo para "análise glicoqualitativa", otimizado para um amplo espectro de usuários, como aqueles envolvidos na análise de estruturas de glicanos em biofármacos e outros materiais glicoconjugados.

Avaliação rápida glicoqualitativa de proteínas recombinantes usando um sistema totalmente automatizado

Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo.  Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Aprenda a purificar e quantificar simultaneamente N-glicanos e proteínas do plasma usando LC-MS/MS. Este método de alta vazão melhora a precisão analítica e facilita estudos de glicômica e proteômica em larga escala.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

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