Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

O objetivo geral deste método é isolar células imunes gengivais para a caracterização aprofundada das respostas imunes relacionadas à imunidade oral e periodontite. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunidade oral, como quais fatores celulares estão implicados na patogênese da periodontite. As principais vantagens desta técnica são que ela permite a avaliação da rede de células imunes orais e o isolamento de células viáveis suficientes para investigações in vitro a jusante.

Como primeiro passo deste protocolo, comece colocando pinos para imobilizar o corpo do camundongo e abra as cavidades torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Em seguida, faça uma incisão na veia cava e use uma seringa de 3 mililitros, equipada com uma agulha de calibre 27, para profundir 3 mililitros de PBS através do ventrículo esquerdo. Quando todo o sangue tiver sido liberado, prenda a cabeça do camundongo em uma almofada de dissecação, com o estômago voltado para cima.

Em seguida, use uma tesoura para cortar cada comissura do lábio em direção ao pescoço, separando a pele que cobre a mandíbula e a região do pescoço e expondo os tecidos e músculos subjacentes. Corte entre os incisivos inferiores para separar os dois lados da mandíbula. Imobilize cada lado da mandíbula separada com agulhas de calibre 25 para acessar a cavidade oral.

Depois de identificar o palato, use uma lâmina cirúrgica número 10 para fazer incisões verticais logo anteriores ao primeiro molar e posteriores ao terceiro molar. Em seguida, disseque o tecido para longe da cavidade nasal e também disseque os blocos da mandíbula. Em seguida, elimine o excesso de tecido da borda da gengiva e transfira os blocos maxilar e mandibular para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 5 mililitros de colagenase e DNase no gelo.

Digerir o tecido em uma incubadora agitadora a 37 graus Celsius por uma hora, adicionando 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante os últimos cinco minutos. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio DNase frio aos tecidos e misture suavemente o conteúdo do tubo girando. Em seguida, transfira os quatro blocos de tecido para uma placa de Petri.

E cubra-os com 500 microlitros de meio DNase fresco. Use um bisturi para remover a gengiva de cada bloco de tecido. E transfira todo o conteúdo do prato para um filtro de células de 70 mícrons em cima de um tubo de 50 mililitros.

Lave a placa de Petri e a peneira com 3 a 5 mililitros de meio DNase fresco. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa estéril de 3 mililitros para esmagar o tecido gengival contra a malha do filtro. Enxágue o filtro com 30 a 35 mililitros de meio DNase frio e centrifugue o filtrado.

Em seguida, ressuspenda o palato em 1 mililitro de meio completo e determine o número de células viáveis. O isolamento e processamento de células imunes, como acabamos de demonstrar, produz um número suficiente de células para realizar uma estimulação ex-vivo e caracterização dos padrões de secreção de citocinas de células gengivais de animais selvagens e suscetíveis à periodontite. De fato, a composição de células imunes gengivais murinas pode ser analisada conforme demonstrado nesses gráficos de densidade que avaliam os compartimentos de células t e natural killer em camundongos knockout LFA suscetíveis à periodontite.

Usando as estratégias de gating apropriadas, a produção de citocinas intracelulares de células T TCR beta CD4 positivas, TCR beta CD8 positivas e TCR gama delta positivas, bem como NK e células linfóides inatas, também pode ser determinada. Uma vez dominadas, as células podem ser isoladas em três horas para imunocoloração se a técnica for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de concluir todas as etapas com eficiência e rapidez, mantendo as células no gelo sempre que não estiverem sendo manipuladas.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como a classificação de células, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas à função dos subconjuntos de células específicos.