Name: Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar células imunes da gengiva murina para estudar imunidade oral e periodontite. Este método permite obter células viáveis suficientes para análises funcionais detalhadas.

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Os autores foram financiados em parte pelo programa interno do NIDCR (N.M.M) e apoiados por uma Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B para J.E.K) e por uma bolsa do Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research (para J.E.K). Os autores agradecem a Teresa Wild pela revisão crítica do manuscrito.

Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo seguido orientações necessários e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use, NIDCR / NIH. 1. preparar com antecedência <ol><li> Prepare meio completo: RPMI suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FBS. </li><li> Prepare a mídia de DNase: 50 ml de meio RPMI suplementado com 7,5 ug DNase (Faça fresco, manter em gelo em todos os momentos). </li><li> Prepare meios colagenase-ADNase: 5 ml de meio de ADNase mais 3,2 mg / mL de colagenase tipo IV (Adicione fresca, manter em gelo em todos os momentos). </li><li> tampão FACS pré-cool: 0,5% FBS diluído em PBS. </li><li> Pré-cool centrífuga a 4 ° C. </li><li> incubador agitador Aquece-se até 37 ° C. </li></ol> 2. Isolamento, Dissecção e isolamento de células a partir gengivais Blocks <ol><li> Eutanásia ratos por expondo-os a CO2 numa câmara apropriada, de acordo com orientações de AraC. </li> &lt;li&gt; Abra a cavidade torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Para perfundir, fazer uma incisão na veia cava inferior e perfundir 3 ml de PBS através do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 3 ml com uma agulha G 27. </li><li> Imobilizar o corpo ea cabeça do mouse sobre uma almofada com o estômago virado para cima. </li><li> Corte cada comissura do lábio para o pescoço com uma tesoura, que separa a pele que cobre mandíbula e pescoço região, expondo os tecidos e músculos subjacentes. Dissecar o lábio inferior para descobrir a mandíbula. </li><li> Corte entre os incisivos inferiores para separar ambos os lados da mandíbula e imobilizar cada lado para aceder à cavidade oral. </li><li> Visualizar e dissecar o paladar de distância a partir da cavidade nasal. </li><li> Dissecar áreas usando uma lâmina de 10 e incluem áreas molares superiores e inferiores com circundante gengiva (Figura 1). Fazer incisões verticais imediatamente anterior ao primeiro molar e posterior ao terceiro molar e uma incisão horizontal naa borda da gengiva (colarinho branco de tecido dentes adjacentes). </li><li> Coloque o maxilar e mandibular blocos em um tubo de 50 ml com 5 ml de colagenase / DNase (manter em gelo). </li><li> Incubar numa incubadora com agitação a 37 ° C durante 1 hora e durante os últimos 5 minutos de incubação adicionar 50 ul de EDTA 0,5 M. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de ADNase frio para o tubo de 50 ml com os tecidos e agitar suavemente para misturar. </li><li> Transferir os 4 blocos de tecidos em uma caixa de Petri e cobrir com 500 ul de meios de DNase. Remover gengiva de cada bloco de tecido, utilizando uma lâmina de bisturi e apontando a lâmina para as áreas gengivais e interdentais. </li><li> Transferir os tecidos e os meios de comunicação a partir do prato de petri, bem como os meios de comunicação de ADNase anteriores utilizados durante a dissecção, para um novo tubo de 50 ml através do filtro de células (70 um de tamanho). Lavar com media DNase (3-5 ml) todos os instrumentos utilizados e filtro. </li><li> Usando o êmbolo estéril de uma seringa de 3 ml, triturar o tecido contra o filtro,filtragem com meios ADNase fria (30 a 35 ml). </li><li> Lave o filtro de células com a mídia DNase frio. </li><li> Centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 6 minutos. </li><li> Descartar o sobrenadante, re-suspender em 1 mL de meio completo. </li><li> Contagem de células (a quantidade esperada deve variar entre 8 x 10 5-1,2 x 10 6 células, com uma viabilidade&gt; 80%), utilizando um contador de células automatizado. </li></ol> 3. Estímulo e FACS coloração de células gengivais <ol><li> Estimular a suspensão de célula única com PMA (50 ng / ml) e ionomicina (2,5 fig / ml) na presença de 1 ul / ml de brefeldina A. </li><li> Incubar por 3,5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Girar para baixo e lava-se com PBS e centrifugação a 4 ° C; 314 g durante 6 min. </li><li> Corar as células utilizando uma mancha de viabilidade seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Stain para marcadores extracelulares (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ ou formigaibodies de escolha) seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Lavam-se as células com tampão FACS frio e centrifugação a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Suavemente vortex para perturbar o sedimento celular. </li><li> Fixar as células com 2% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as células com tampão FACS frio, centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min e mancha de citocinas intracelulares. <ol><li> Encher os tubos de FACS com uma solução fria de saponina a 0,5% diluído em tampão de SCAF e centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Adicionar 300 uL de solução de saponina a 0,5% para os tubos de FACS, incubar durante 15 minutos no escuro a 4 ° C e depois centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Corar as células de marcadores intracelulares (IL-17A e IFNy ou citocinas de escolha) seguindo as instruções do fabricante. Lavam-se as células com solução de saponina a 0,5% e centrifuga-se a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Lave novamente com FACSde tampão e centrifuga-se a 4 ° C, 314 xg durante 5 min. </li><li> Re-suspender as células em 300 ul de tampão de FACS. </li></ol></li><li> Analisar os resultados em um citômetro de fluxo. </li></ol> 4. Análise por Citometria de Fluxo <ol><li> células visualizar a serem analisados ​​na frente (FSC) e dispersão lateral (SCC) e portão para excluir detritos. </li><li> Selecionar células individuais com área de dispersão para a frente (FSC-A) vs. altura parâmetros (FSC-H). </li><li> Células portão que são vivo (como indicado através de coloração de viabilidade) e positiva para o marcador CD45 + hematopoiéticas para posterior análise (Figura 2A e 2C). </li><li> Continue a análise de marcadores específicos, como mostrado na Figura 2 e na Figura 3. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

A técnica actual produz com sucesso um grande número de células do sistema imunológico (a partir de um único rato) apropriado, não só para a caracterização fenotípica, mas também para estudos funcionais ex vivo. Outro grupo havia publicado anteriormente um protocolo para isolar e caracterizar células imunes gengivais murino e introduziu o valor do uso de multicolor citometria de fluxo no estudo da periodontite em modelos animais 9. Na sequência de resolução de problemas consideráveis ​​a modificação ...

Tecidos gengivais rodeiam a dentição humana e de murídeo e são constantemente expostos ao biofilme complexo do dente 1. A rede celular imune policiais a barreira gengival é vital para manter a integridade do tecido, garantindo a homeostase com os micróbios comensais locais e, ao mesmo tempo, proporcionando uma imunidade eficaz contra o desafio patogénico 2. Para alcançar a homeostase, o sistema imunológico é cuidadosamente adaptado ao ambiente gengival criação de uma rede de células imunes altamente especializados, mas poucos detalhes são conhecidos das populações de células imunes gengivais e seu papel na manutenção da imunidade tecido 2. Quando a homeostase imune é interrompido na gengiva, quer através do aumento da susceptibilidade do hospedeiro e / ou presença de comunidades microbianas dysbiotic, uma condição inflamatória, periodontite surge 3 4. A periodontite é uma doença inflamatória comum, levando à perda do dente sestruturas upporting. Nas suas formas mais graves que é observada em cerca de 10% da população em geral 5. Dissecando os principais fatores envolvidos na susceptibilidade a periodontite e progressão tem sido difícil 6. No entanto, os modelos animais têm sido extremamente útil na compreensão dos mecanismos de iniciação e progressão da periodontite 7. Os modelos podem ser utilizados para definir as populações de células principais e mediadores moleculares que são vitais para a manutenção da homeostase imune e desenvolvimento unidade de periodontite. Essa visão vai transformar a nossa compreensão do controle específico da gengiva da homeostase imunológica e promover nossa compreensão atual da patogênese da doença.

<table><tbody><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi #3</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi #10</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>10010-00</td> Pinça <td>de estéril</td></tr><tr><td></td><td>Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas com chanfro regular&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 G, 12,7 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Seringas Monoject</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>ponta Luer-lock, 3 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Sem Cálcio e Magnésio</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Sem L-glutamina</td></tr><tr><td>DNase I de pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV</td><td>Gibco (por Life technologies)</td> <td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gemini Bioprodutos</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina 50 mg / ml</td><td>Qualidade biológica</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Strep</td><td>Gibco (por Life technologies)</td> <td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco (por Life technologies)</td> <td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Qualidade biológica</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Polipropileno, estéril</td></tr><tr><td>70 &mu; Filtros de células M</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Tubos FACS estéreis</td></tr> de <tr><td>5 ml Corning</td><td></td><td>352052</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Contém brefeldina Uma solução</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Sal de Cálcio Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponina da casca de quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas Aqua corrigível</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse gamma delta TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IFN-&gama; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival imune

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

As redes de células imunes nos tecidos desempenham um papel vital na mediação da imunidade local e na manutenção da homeostase tecidual, mas pouco se sabe sobre as populações de células imunes residentes na mucosa oral e na gengiva. Estabelecemos uma técnica para o isolamento e estudo de células imunes de tecidos gengivais murinos, uma área de exposição microbiana constante e um local vulnerável a uma doença inflamatória comum, a periodontite. Nosso protocolo permite uma caracterização fenotípica detalhada das populações de células imunes residentes na gengiva, mesmo em estado estacionário. Nosso procedimento também produz células suficientes com alta viabilidade para uso em estudos funcionais, como a avaliação da secreção de citocinas ex vivo. Essa combinação de caracterização fenotípica e funcional da rede de células imunes gengivais deve ajudar a investigar os mecanismos envolvidos na imunidade oral e na homeostase periodontal, mas também avançará nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na imunopatologia local.

Para ilustrar a aplicação do protocolo, mostramos resultados representativos que examinam a rede de células imunes na gengiva de ratos com e sem periodontite (WT vs. LFA - / -, a Figura 2a - C). Representante FACS gráficos mostram células CD45 + hematopoiéticas ao vivo na gengiva (Figura 2A, 2C). Isolamento e tratamento de células do sistema imunológico com este protocolo produz cél...

Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento, caracterização fenotípica e análise funcional de células imunes de gengiva murino.

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

O objetivo geral deste método é isolar células imunes da gengiva para a caracterização detalhada das respostas imunes relacionadas à imunidade oral e à periodontite. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunidade oral, como quais fatores celulares estão implicados na patogênese da periodontite. As principais vantagens desta técnica são que ela permite a avaliação da rede de células imunes orais e o isolamento de um número suficiente de células viáveis para investigações in vitro subsequentes.Como primeiro passo deste protocolo, comece colocando pinos para imobilizar o corpo do camundongo e abra as cavidades torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Em seguida, faça uma incisão na veia cava e use uma seringa de 3 mililitros, equipada com uma agulha de 27 graus, para perfundir 3 mililitros de PBS através do ventrículo esquerdo. Quando todo o sangue tiver sido removido, prenda a cabeça do camundongo sobre uma bandeja de dissecação, com o estômago voltado para cima.Em seguida, use uma tesoura para cortar cada comissura do lábio em direção ao pescoço, separando a pele que recobre a região da mandíbula e do pescoço, e expondo os tecidos e músculos subjacentes. Corte entre os incisivos inferiores para separar os dois lados da mandíbula. Imobilize cada lado da mandíbula separada com agulhas de calibre 25 para acessar a cavidade oral.Após identificar o palato, utilize uma lâmina cirúrgica número 10 para fazer incisões verticais logo anterior ao primeiro molar e posterior ao terceiro molar. Em seguida, dissecar o tecido da cavidade nasal e também separar os blocos da mandíbula. Em seguida, remover o tecido em excesso da borda da gengiva e transferir os blocos maxilares e mandibulares para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 5 mililitros de colagenase e DNase sobre gelo.Digira o tecido em um incubador com agita&ccedil;&atilde;o a 37 graus Celsius durante uma hora, adicionando 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante os &uacute;ltimos cinco minutos. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio de DNase frio aos tecidos e misture suavemente o conte&uacute;do do tubo por meio de movimentos de rota&ccedil;&atilde;o. A seguir, transfira os quatro blocos de tecido para uma placa de Petri.E cubra-os com 500 microlitros de meio de DNAse fresco. Use um bisturi para remover a gengiva de cada bloco de tecido. E transfira todo o conteúdo da placa para um filtro celular de 70 mícrons colocado sobre um tubo de 50 mililitros.Lave a placa de Petri e a peneira com 3 a 5 mililitros de meio de DNase fresco. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa estéril de 3 mililitros para esmagar o tecido gengival contra a malha da peneira. Enxágue a peneira com 30 a 35 mililitros de meio de DNase frio e centrifugue o filtrado.Em seguida, ressuspenda o palato em 1 mililitro de meio completo e determine o número de células viáveis. O isolamento e o processamento de células imunes conforme demonstrado fornece um número suficiente de células para realizar uma estimulação ex-vivo e a caracterização dos padrões de secreção de citocinas pelas células gengivais de animais tanto selvagens quanto susceptíveis à periodontite. De fato, a composição das células imunes gengivais murinas pode ser analisada conforme demonstrado nestes gráficos de densidade que avaliam os compartimentos de células T e células natural killer em camundongos knockout de LFA susceptíveis à periodontite.Utilizando estratégias de seleção apropriadas, a produção intracelular de citocinas por células T TCR beta CD4 positivas, TCR beta CD8 positivas, TCR gama delta positivas, bem como por células NK e células linfoides inatas, também pode ser determinada. Após dominar a técnica, as células podem ser isoladas em três horas para imunomarcação, se o procedimento for realizado corretamente. Ao tentar executar este procedimento, é importante lembrar de completar todos os passos de forma eficiente e rápida, mantendo as células sobre gelo sempre que não estiverem sendo manipuladas.Após este procedimento, outros métodos, como a classificação celular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à função de subpopulações celulares específicas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este método para isolar células do sistema imunológico funcional do coração fornece uma alternativa aos métodos convencionais de digestão da colagenase, que causa a ativação de células imunes indesejadas, resultando em uma capacidade de resposta diminuiu dessas células. Nosso método de isolamento de rendimentos funcional cardíaca células do sistema imunológico, evitando os problemas associados com a digestão enzimática.

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento da rede de células imunes gengivais de um modelo de camundongo. A digestão enzimática libera o tecido gengival dos dentes e ossos aderidos, que é digerido mecanicamente, liberando células imunes da gengiva. As células isoladas estão prontas para experimentos imunológicos.

Isolamento da Rede de Células Imunes Gengivais de Blocos de Dentes Murinos

Este estudo descreve uma técnica eficiente para isolar e processar tecido gengival da cavidade oral do rato de modo a produzir uma cultura de uma única célula. As células resultantes podem ser ainda utilizado para a análise de citometria de fluxo e os estudos moleculares.

Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

Este artigo apresenta dois protocolos: um para medir bactérias anaeróbicas que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro e outro para visualizar bactérias anaeróbicas interagindo com células hospedeiras. Este estudo pode ser aplicado a qualquer tipo de célula anaeróbia cultivável e a qualquer tipo de célula eucariótica.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

A superfície ocular normal exposta consiste em córnea e conjuntiva. As células epiteliais, as células caliciformes e as células imunes estão presentes na conjuntiva. Aqui, uma técnica não invasiva de citologia de impressão é descrita usando um dispositivo de citação de impressão e citometria de fluxo para analisar células imunes na conjuntiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

O objetivo do protocolo é construir um modelo de gengiva humana inflamatória em vitro. Este modelo de tecido co cultiva três tipos de células humanas, HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e macrófagos THP-1, sob condições tridimensionais. Este modelo pode ser aplicado para investigar doenças periodontais, como gengivite e periodontite.

Equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva

No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Aqui apresentamos um método modificado para o isolamento e cultura das células epiteliais gengival humanas adicionando o inibidor de Rocha, Y-27632, ao método tradicional. Este método é mais fácil, menos demorado, melhora as propriedades das células-tronco e produz um número maior de células epiteliais de alto potencial, tanto para o laboratório quanto para aplicações clínicas.

Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632

O protocolo atual apresenta um método rápido, eficiente e suave para isolar células únicas adequadas para análise de RNA-seq unicelular a partir de um incisivo de rato em crescimento contínuo, molar de rato e dentes humanos.

Isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem padronizada para avaliar quantitativamente a integridade da barreira epitelial gengival murina, aplicando topicamente dextranos marcados com fluorescência de diferentes tamanhos moleculares na superfície gengival in vivo, seguido por imagens ex vivo usando um sistema de microscopia de fóton único.

Avaliação funcional da barreira epitelial gengival de camundongos usando traçadores fluorescentes

Aprenda a isolar e caracterizar células imunes da gengiva murina para estudar imunidade oral e periodontite. Este método permite obter células viáveis suficientes para análises funcionais detalhadas.

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

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