Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune
16 de fevereiro de 2016
Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento, caracterização fenotípica e análise funcional de células imunes de gengiva murino.
O objetivo geral deste método é isolar células imunes da gengiva para a caracterização detalhada das respostas imunes relacionadas à imunidade oral e à periodontite. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunidade oral, como quais fatores celulares estão implicados na patogênese da periodontite. As principais vantagens desta técnica são que ela permite a avaliação da rede de células imunes orais e o isolamento de um número suficiente de células viáveis para investigações in vitro subsequentes.
Como primeiro passo deste protocolo, comece colocando pinos para imobilizar o corpo do camundongo e abra as cavidades torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Em seguida, faça uma incisão na veia cava e use uma seringa de 3 mililitros, equipada com uma agulha de 27 graus, para perfundir 3 mililitros de PBS através do ventrículo esquerdo. Quando todo o sangue tiver sido removido, prenda a cabeça do camundongo sobre uma bandeja de dissecação, com o estômago voltado para cima.
Em seguida, use uma tesoura para cortar cada comissura do lábio em direção ao pescoço, separando a pele que recobre a região da mandíbula e do pescoço, e expondo os tecidos e músculos subjacentes. Corte entre os incisivos inferiores para separar os dois lados da mandíbula. Imobilize cada lado da mandíbula separada com agulhas de calibre 25 para acessar a cavidade oral.
Após identificar o palato, utilize uma lâmina cirúrgica número 10 para fazer incisões verticais logo anterior ao primeiro molar e posterior ao terceiro molar. Em seguida, dissecar o tecido da cavidade nasal e também separar os blocos da mandíbula. Em seguida, remover o tecido em excesso da borda da gengiva e transferir os blocos maxilares e mandibulares para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 5 mililitros de colagenase e DNase sobre gelo.
Digira o tecido em um incubador com agitação a 37 graus Celsius durante uma hora, adicionando 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante os últimos cinco minutos. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio de DNase frio aos tecidos e misture suavemente o conteúdo do tubo por meio de movimentos de rotação. A seguir, transfira os quatro blocos de tecido para uma placa de Petri.
E cubra-os com 500 microlitros de meio de DNAse fresco. Use um bisturi para remover a gengiva de cada bloco de tecido. E transfira todo o conteúdo da placa para um filtro celular de 70 mícrons colocado sobre um tubo de 50 mililitros.
Lave a placa de Petri e a peneira com 3 a 5 mililitros de meio de DNase fresco. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa estéril de 3 mililitros para esmagar o tecido gengival contra a malha da peneira. Enxágue a peneira com 30 a 35 mililitros de meio de DNase frio e centrifugue o filtrado.
Em seguida, ressuspenda o palato em 1 mililitro de meio completo e determine o número de células viáveis. O isolamento e o processamento de células imunes conforme demonstrado fornece um número suficiente de células para realizar uma estimulação ex-vivo e a caracterização dos padrões de secreção de citocinas pelas células gengivais de animais tanto selvagens quanto susceptíveis à periodontite. De fato, a composição das células imunes gengivais murinas pode ser analisada conforme demonstrado nestes gráficos de densidade que avaliam os compartimentos de células T e células natural killer em camundongos knockout de LFA susceptíveis à periodontite.
Utilizando estratégias de seleção apropriadas, a produção intracelular de citocinas por células T TCR beta CD4 positivas, TCR beta CD8 positivas, TCR gama delta positivas, bem como por células NK e células linfoides inatas, também pode ser determinada. Após dominar a técnica, as células podem ser isoladas em três horas para imunomarcação, se o procedimento for realizado corretamente. Ao tentar executar este procedimento, é importante lembrar de completar todos os passos de forma eficiente e rápida, mantendo as células sobre gelo sempre que não estiverem sendo manipuladas.
Após este procedimento, outros métodos, como a classificação celular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas à função de subpopulações celulares específicas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica para isolar e caracterizar células imunes da gengiva murina. O método tem como objetivo aprimorar a compreensão da imunidade oral e da periodontite.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Oral
- Periodontia
Antecedentes
- Compreender as respostas imunes na cavidade oral é essencial para abordar doenças periodontais.
- As células imunes da gengiva desempenham um papel significativo na imunidade oral.
- Métodos atuais podem não fornecer um número suficiente de células viáveis para análises detalhadas.
- Essa técnica tem como objetivo preencher essa lacuna, permitindo estudos funcionais aprofundados.
Objetivo do Estudo
- Isolar células imunes gengivais para caracterização.
- Investigar os fatores celulares envolvidos na patogênese da periodontite.
- Avaliar a rede de células imunes orais.
Métodos Utilizados
- Imobilização do camundongo e exposição dos órgãos internos.
- Incisão na veia cava para lavagem do sangue.
- Uso de uma seringa para perfundir PBS através do ventrículo esquerdo.
- Preparação do camundongo para análises adicionais.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células imunes viáveis da gengiva.
- Caracterização das respostas imunes relacionadas à saúde bucal.
- Compreensão dos mecanismos da patogênese da periodontite.
- Potencial para investigações in vitro subsequentes.
Conclusões
- Essa técnica fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da imunidade oral.
- Amplia a compreensão da dinâmica das células imunes nos tecidos gengivais.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para obter insights mais profundos sobre doenças periodontais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento preciso e o perfil funcional de células imunes da gengiva permitem a desmistificação mecanicista na imunologia oral e apoiam a validação de alvos para pesquisas de doenças inflamatórias. Este fluxo de trabalho fornece populações celulares com alta viabilidade para fenotipagem quantitativa e ensaios funcionais ex vivo, fortalecendo a confiança preditiva em estudos iniciais de descoberta e translacionais. A abordagem está posicionada para orientar decisões de portfólio em P&D de imunologia e saúde bucal, permitindo a investigação robusta das redes imunes residentes no tecido.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de subpopulações de células imunes implicadas na patogênese inflamatória oral.
- Apóia a validação funcional de alvos por meio de ensaios de secreção de citocinas ex vivo.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer as contribuições das células imunes em modelos de doença.
- Fornece dados quantitativos para triagem de portfólio orientada por hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece células imunes viáveis e fenotipicamente caracterizadas para o desenvolvimento de ensaios subsequentes.
- Permite a preparação reprodutível de amostras biológicas para fluxos de trabalho padronizados de triagem.
- Permite leituras quantitativas da função imune para avaliação de compostos.
- Aprimora a escalabilidade e a prontidão para ensaios em plataformas de triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha o perfilamento de células imunes com modelos orais relevantes para a doença, garantindo continuidade translacional.
- Permite a descoberta de biomarcadores funcionais em estudos pré-clínicos de imunopatologia oral.
- Apoia o avanço com ajuste de risco de estratégias imunomoduladoras direcionadas aos tecidos orais.
- Fornece insights mecanicistas para orientar a seleção de candidatos em fase pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer preparações de células imunes de alta qualidade tanto para estudos mecanicistas quanto para triagem funcional em modelos de doenças orais.
- Biologia da Descoberta: Avança o teste de hipóteses sobre os papéis das células imunes na homeostase e na patologia dos tecidos orais.
- Triagem: Fornece populações celulares viáveis e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e testes de compostos.
- Análises: Permite a medição quantitativa da secreção de citocinas e dos fenótipos das células imunes para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica em modelos orais relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado adaptável a diversos programas de pesquisa em imunologia oral.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa imunológica oral.
- Valor Operacional: Oferece isolamento padronizado, reprodutível e escalável de células imunes para comparação entre estudos.
- Valor Estratégico: Apoia decisões informadas de avançar/não avançar e o desenvolvimento eficiente em termos de capital de ativos em imunologia oral.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e abordagens nos pipelines de imunologia oral e mucosal.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de camundongos e manipulação de células imunes.
- Exige acesso à infraestrutura de citometria de fluxo e ensaios funcionais ex vivo.
- Necessita padronização entre equipes para isolamento e análise de células reprodutíveis.
- A adaptação a outros tecidos mucosos pode exigir otimização do protocolo.
- A viabilidade e o rendimento celular são sensíveis ao tempo do procedimento e ao controle de temperatura.
