Name: Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a quantificar metaloproteínas em amostras biológicas complexas usando cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a ICP-MS. Este método permite analisar o estado metálico de proteínas em seu estado nativo, revelando insights sobre processos biológicos e doenças.

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Nós gostaríamos de agradecer o apoio do Programa do Governo de Victoria Apoio Operacional Infra-estrutura, o regime de Projetos Linkage Australian Research Council (com a Agilent Technologies), o Centro Australiano de Investigação Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho, o banco de cérebros vitoriana, Cooperativa para a Saúde Mental eo Neuroproteomics instalação.

1. Preparação de buffers e Amostras <ol><li> Preparar 500 ml de tampão, 200 mM de nitrato de amónio de pH 7,6-7,8 (pH ajustado com hidróxido de amónio (NH4OH)) com césio (Cs) e antinomy (SB) adicionado a uma concentração final de 10 ppb. Use de césio e antinomy como padrões internos para acompanhar qualquer variação na resposta de ICP-MS. tampão de filtro, antes da utilização através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Prepare a amostra dependendo do tipo de amostra: líquido, tecido ou cultura celular. <ol><li> Para as amostras que requerem homogeneização (por exemplo, tecido ou células), assegurar que eles não contêm detergente. Use tampões Tris para preparação de amostras. Como alternativa, use tampões de fosfato, mas eles podem afetar negativamente a metalloproteome com o tempo ou com ciclos de descongelamento congelamento 12. </li><li> Homogeneizar de tecido ou cultura de células de amostras de Dounce ou manual de ultra-sons durante 5 min, utilizando solução salina tamponada com Tris (Tris 50 mM, pH 8,0, cloreto de sódio 150 mM(NaCl) + ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) os inibidores da protease livre). </li><li> Esclarecer homogenatos por centrifugação a 16000 xg durante 5 min. Recolhe-se o sobrenadante resultante. Manter as amostras a 4 ° C. Nota: Todas as amostras devem ser centrifugadas antes de carregar para a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) frascos para prevenir as partículas de bloqueio da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). </li></ol></li><li> Normalizar a quantidade total de proteína aplicada na coluna entre as amostras. Determinar as concentrações de proteína a 280 nm utilizando um espectrofotómetro de UV micro volume de 13. Carga entre 20 e 150 ug de proteína. Use típicos volumes de injecção que variam 2-80 ul, dependendo da concentração da amostra. <ol><li> Limpe o braço de amostra do espectrofotômetro volume de UV micro com água destilada antes do carregamento da amostra. O braço de amostra é o local onde as amostras de proteína são carregados. </li><li> Em branco, o instrumento contra 2 l de thtampão de amostra e. Em seguida, carga de 2 ul de cada amostra para o braço e medir a absorvância a 280 nm. </li><li> Determinar as concentrações. Para as amostras de proteína bruta, usar um coeficiente de extinção de 1 Abs = 1 mg / ml. Para determinar a concentração de proteína nas amostras, usar a lei de Beer-Lambert, A = ε xlxc, em que A é a absorvância, ε é o coeficiente de extinção, L é o comprimento do caminho em centímetros e C é a concentração. </li></ol></li></ol> 2. Análise massa de metaloproteína padrões, usando plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa <ol><li> Warm-up e ajustar o instrumento utilizando os protocolos do fabricante. </li><li> Uma vez que instrumento é aquecido e ajustado, execute a granel ICP-MS. Nota: As soluções de reserva de metaloproteínas purificados geralmente necessitam de ser diluídas antes da medição. A concentração de metal do padrão pode ser estimada a partir da proteína conhecida: stochiometries metal ea Concentra proteína estimadação. Esta informação pode ser usada para determinar a diluição que irá ser adequado para cair dentro da gama da curva padrão gerada. <ol><li> Diluir padrões metaloproteínas, tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e a vitamina B 12, para garantir que eles caem dentro da gama de 0-500 ug / L, utilizando 1% de ácido nítrico. Para alcançar padrões dentro deste intervalo, não use diluições superiores a 1 em 20. Realizar diluições em série em água para diluir os estoques antes deste se necessário. </li><li> Configurar a ordem das injeções. Em primeiro lugar, analisar os sete níveis de calibração, as concentrações que variam 0-500 ug / L, seguido pelas normas metaloproteínas. Os sete níveis de calibração são 0, 1, 5, 10, 50, 100 e 500 ug / L. </li><li> Selecione elementos de interesse. Aqui, use Fe, Cu, Zn, Co e eu, como eles são os elementos que os padrões de proteínas são obrigados a. Selecione os elementos do método de aquisição ao abrir o separador de seletor de elemento e adicionando o eleme<html> NTS e respectivas massas de isótopos que estão a ser analisados. </li><li> Executar a análise da amostra com o instrumento e o software do instrumento cria automaticamente as curvas de calibração para cada um dos elementos a ser analisada. As curvas de calibração são criadas pelo software traçando a contagens / seg do metal detectado contra a quantidade de metal que o padrão se destina a conter, em ug / L. Use as curvas de calibração para determinar a concentração de metais nas amostras desconhecidas. Nota: A utilização da curva de calibração, o software determina a concentração de metais em cada um dos padrões metaloproteínas. </li><li> A partir dos resultados da análise de massa, gerar padrões de metaloproteínas que incluem os três elementos vestigiais mais abundantes em tecidos de mamífero, utilizando uma mistura de Cu, Zn superóxido dismutase (SOD), diluído a 200 ug / L de cobre e de zinco e ferritina (FTN) a uma definitiva concentração de 2000 ug / L de ferro. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Configuração do Sistema HPLC e por exclusão de tamanho cromatografia em coluna de Equilíbrio Nota: Esta secção deve ser realizada em paralelo com o anterior, uma vez que ambos necessário cerca de 1-1,5 horas a completar. <ol><li> Bombas de HPLC de purga com tampão feito no passo 1.1 e purgar as bombas para 5 min a uma velocidade de fluxo de 5 ml / min. </li><li> Uma vez que o sistema é purgado, ajustar a taxa de fluxo a 0,1 ml / min e ligar a coluna de exclusão de tamanho (4,6 x 300 mm, 3 um, 150 A). Nota: Uma conexão molhada entre a tubagem e a coluna evita quaisquer bolhas de ar ficar aprisionado durante a conexão da coluna. </li><li> Ligar a extremidade oposta da coluna para o detector de UV regulado para medir a absorvância a 280 nm, utilizando tubagem de PEEK. </li><li> Aumentar gradualmente a taxa de fluxo da coluna em incrementos de 0,05-0,1 ml / min, até uma taxa de fluxo final de 0,4 mL / min é atingido. Enquanto isso está ocorrendo, verifique as conexões de tubos para a coluna se há algum vazamento. Monitorar a pressãodo sistema para garantir que ele não excede os requisitos de coluna, observando o traçado da pressão no cromatograma no software. </li><li> Deixar a coluna para equilibrar a taxa de fluxo necessária ao longo de 5 - 10 volumes de coluna. Depois que é equilibrada, ligar os instrumentos para permitir a análise da amostra para ocorrer. </li><li> Defina-se o método de HPLC para bombear tampão A através da coluna a 0,4 mL / min durante 15 min. </li></ol> 4. Configurando e executando Tamanho Exclusão - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa Nota: os procedimentos operacionais podem variar entre os instrumentos e modelos. Fale com o especialista técnico instrumento para saber mais sobre como configurar o ICP-MS a ser utilizado. <ol><li> Coloque o ICP - MS em modo de espera antes de alterar a configuração de hardware. <ol><li> Uma vez no modo de espera, desligue a comunicação para o amostrador automático e alterar a introdução de exemplo para &quot;outro&quot;. Nota: Dependendo do software e difícilWare configuração de selecção &quot;HPLC&quot;, tal como uma fonte de introdução de amostras pode ser utilizado. Fale com o especialista técnico instrumento para saber se essa opção está disponível. </li></ol></li><li> Use tubagem de PEEK (ID 0.13 mm) para ligar o escoamento para fora a partir do detector de UV directamente para o nebulizador no ICP-MS. </li><li> Poder fazer backup do ICP - MS e permitir que o instrumento aquecer durante 10 - 20 min. </li><li> Após o plasma se inflamar, conectar o cabo afastado do ICP - MS para a parte de trás do amostrador automático de HPLC. Faça isso uma vez que o plasma tem inflamado; caso contrário, o sistema de HPLC irá desligar automaticamente uma vez que o ICP - MS não está ligado. </li><li> Alterar o método de ICP-MS para coletar dados para LC-ICP-MS. <ol><li> Alterar o método de aquisição de espectro a aquisição em tempo resolve (TRA). </li><li> Selecionar os elementos a serem analisados, Fe, Cu, Zn, Co, I, bem como quaisquer outros elementos de interesse, e tempos de integração (tipicamente entre 0,05-0,3 seg). Depois de os elementos de interesse umre escolhida, ajustar o tempo de aquisição para coincidir com o tempo de execução para a cromatografia (por exemplo, 900 segundos para um 15 min cromatografia run). </li><li> Sintonizar manualmente o ICP - MS para hélio celular sensibilidade e colisão (Ele) caudais de gás com o buffer de cromatografia de fluxo usando Cs e Sb incluídos no buffer. As taxas de fluxo de He ~ são tipicamente de 1 ml / min menos do que as utilizadas para a análise de grandes quantidades. Uma vez que as contagens de iões metálicos se estabilizaram e desvio padrão relativo (RSD) valores são inferiores a 5%, o sistema está pronto para uso. </li></ol></li><li> Faça amostra listas são executados em ambos os programas de software ICP-MS HPLC e. A lista de exemplos de execução contém a ordem em que cada uma das amostras deve ser injectada, bem como o nome pelo qual os dados serão guardados. Verifique se o número total de amostras no jogo lista entre os dois programas. </li><li> Inicie o lote de amostra para o ICP-MS antes da HPLC, tal como a injecção da amostra por HPLC irá desencadear a ICP - MS para iniciar a recolhadados. Se isso não for feito na ordem correta que irá resultar em dados perdidos. </li><li> Gerar pontos da curva de calibração através da injecção de diferentes volumes da SOD e RNT padrão misturado a partir de 200? G / L para 6,000 g / L injectados na coluna para o Cu e Zn e 2000 ug / L até 60.000 g / L para o Fe. Os volumes de injecção variam entre 1 e 30 ul. Nota: Estes intervalos de concentração abranger as concentrações de Fe, Cu e Zn, tipicamente observadas em homogenatos de complexos. Para as amostras que contêm apenas proteínas purificadas a faixa máxima da curva deve ser ajustado em conformidade. À medida que a quantidade de metal associada com a proteína pode necessitar de uma gama maior ou mais pequena, uma vez que há menos contaminação na amostra a partir de outros factores. </li><li> Analisar cada uma das culturas de tecidos amostras desconhecidas, plasma ou células. </li></ol> 5. Análise de Dados, manipulação e visualização <ol><li> Armazenar os dados no valor separados por vírgulas (CSV) formato de arquivo e carregá-into programas de processamento, conforme necessário. </li><li> A fim de controlar para o instrumento deriva, dividir as contagens por segundo para cada elemento pelas contagens por segundo para qualquer Cs ou Sb. </li><li> Gerar curvas de calibração para cada um dos elementos. <ol><li> Determinar a área sob o pico de metal que corresponde à metaloproteína que ele é obrigado a para cada uma das injecções através da realização de integração de picos no software de análise de dados preferida. </li><li> Traça-se a área sob o pico do metal contra a quantidade total do metal que foi injectada na coluna em cada série, de 200 - 6000 ug / L de Cu e Zn e 2000 - 60000 g / L de Fe. Realizar a análise de regressão linear de acordo com o protocolo de software. </li><li> Usar os resultados de inclinação a partir da análise de regressão linear, tal como um factor para converter contagens por segundo para pg / seg. Dividir cada uma das contagens por segundo pontos de dados em todo o cromatograma por o gradiente de um valor de linha. </li></ol></li><li> Representar graficamente os dados empg / seg contra o tempo cromatograma. Determinar a área sob os picos de interesse. A área sob o pico representa a quantidade total de metal que a proteína é ligada a, na pág. </li><li> Gerar uma calibração com base no peso molecular das metaloproteínas conhecidos e o momento em que eles eluem. Use isto para estimar o tamanho dos picos de proteína em amostras complexas. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Garantir o estado nativo da proteína significa atenção especial aos padrões usados ​​e armazenamento da amostra são necessários. Nem todas as técnicas de cromatograf ia ou técnicas de preparação da amostra podem ser empregues. É importante que os tampões utilizados durante toda a preparação da amostra e são desprovidos de cromatografia de quelantes metálicos e utilização tampões que imitam o pH e concentração de sal fisiológico. Outras condições a evitar incluem aquecimento da amostra ou adição de desnaturantes de proteínas (por exemplo, ureia). É crítico para minimizar o número de ciclos de descongelamento congelamento. A capacidade do tampão escolhido para se ligar metais divalentes é também importante e é um motivo que Tris ou tampões de amónio nitrato são escolhidos entre tampões à base de fosfato. A resolução e baixa capacidade de pico da cromatograf ia de exclusão por tamanho em relação a outras formas de cromatograf ia é uma grande limitação desta técnica. No entanto, a natureza gentil de exclusão de tamanho chromatograPHY é importante para manter o estado nativo da proteína e, assim, conservar as ligações de metal-proteína relativamente fracas. O requisito para manter o estado nativo de proteínas exige uma especial atenção para o tratamento das amostras, incluindo a limitação do número de ciclos de descongelamento congelamento, evitando quelantes de metais (por exemplo, EDTA) ou os seus sais caotrópicos e detergentes. Esta baixa resolução desta técnica impactos a capacidade de quantificar a quantidade de metal associada a uma proteína específica se for numa amostra complexa como os picos observados irá conter mais do que uma proteína. Portanto, a quantidade de metal determinada usando o pico de integração seria uma indicação da quantidade total de metal associado com todas as proteínas eluindo neste ponto de tempo e não apenas uma proteína específica. A fim de superar esta limitação a proteína de interesse teria que ser ainda purificado sob condições nativas. Isto permitiria a quantificação deo metal associados com esta proteína a ser comunicados com um grau mais elevado de certezas. Outra limitação potencial desta técnica seria a perda de proteína devido a ligação não reversíveis para a coluna. A fim de determinar se isto está a acontecer uma experiência de recuperação deve ser levada a cabo por meio de que a quantidade de proteína eluindo da coluna é analisado para determinar se esta corresponde à quantidade injectada. O mesmo pode ser feito por medição do teor de metal do material de eluição e do material de partida por grandes quantidades de ICP-MS. Coluna de recuperação pode diferir dependendo das condições usadas, mas demonstrou-se que a recuperação completa de proteínas a partir de uma coluna de exclusão por tamanho é possível 9. Assim, é importante verificar se há ou não qualquer perda nas condições de operação que está sendo usado. As modificações introduzidas no protocolo pode ser relacionada com as normas metaloproteínas que são utilizados, bem como os elementos analisados. O tipo de padrão metaloproteína nósed irá variar de acordo com os elementos que são de interesse. Para elementos, tais como Cu, Fe e Zn proteínas, SOD e ferritina são empregados. Qualquer outro metaloproteína que têm stoichometries conhecidos também pode ser utilizado e alguns exemplos foram mostrados aqui. Uma das principais complicações que podem surgir de usar esta técnica é a acumulação de cristais de sal na tocha do ICP-MS. Para evitar a acumulação de cristais de sal, o maçarico é lavada com água destilada a cada 500 - 1000 ml de tampão que foi passado através do sistema, ou quando é determinado por inspecção visual que a tocha seja lavada. Outro problema que pode surgir é um declínio mais rápido na limpeza das amostras e extração cones. Estes precisam ser limpos regularmente seguindo os protocolos do fabricante. A preparação da amostra inicial é a etapa mais crítica no protocolo. Se houver qualquer alteração na proteína - complexo de metal do informação gerado não será válida. Esta é uma das principais limitações da técnica; Além disso, o uso de baixa resolução, coluna de exclusão de tamanho produz uma vista detalhada limitada da verdadeira complexidade de metaloproteínas em biologia. A técnica aqui descrita permite a expansão do conhecimento do metalloproteome de um organismo. análise de massa só dá uma indicação bruta de mudanças para a quantidade de metal dentro de uma amostra. Além das considerações gerais que precisam de ser tomadas em consideração, esta técnica fornece uma ferramenta que pode ser usada para quantificar a quantidade de metal associados a proteínas, bem como para identificar metaloproteínas que diferem pela comparação dos traços obtidos. A utilização desta técnica pode ser empregue para identificar diferenças entre os estados de doença. As metaloproteínas identificados, em seguida, pode ser investigado para ajudar a determinar o papel que desempenham nos processos de doença. A aplicação de hífen ICP-MS tem um crescimentofuturo para determinar o papel dos fármacos que possuem um heteroátomo, tal como a platina, o iodo ou o cobre como o ICP-MS pode ser utilizada para identificar as proteínas que se ligam a droga.

metais essenciais desempenham um papel fundamental em funções biológicas normais, incluindo as vias de segundo mensageiro, vias do metabolismo e das funções de organelos. 30% de todas as proteínas são pensados ​​para ser metaloproteínas 1 e 50% de todas as enzimas 2. Metaloenzimas usar esses traços de metais como cofatores para catalisar reações químicas, estabilizar a estrutura da proteína, e para as funções reguladoras, como mensageiros secundários. Alguns dos oligoelementos mais estudadas no que diz respeito a neurodegeneração são de cobre, ferro e zinco 3. Eles são pensados ​​para ser envolvida em muitas vias de doença onde por dyshomeostasis pode ter efeitos adversos. Por exemplo, o estado de metal de superóxido dismutase (SOD) directamente impactos o tempo de vida e do fenótipo dos modelos de ratinhos transgénicos de tipo familiar de esclerose lateral amiotrófica (ALS) 4. Na doença de Alzheimer, metalloproteomics técnicas têm sido utilizadas para descobrir uma diminuição no estado de metal de transferrina em pLasma 5. Estes estudos destacam os importantes metaloproteínas papel pode desempenhar na doença. O estudo de metaloproteínas directamente a partir de tecidos biológicos é um campo em desenvolvimento. Embora alguns metaloenzimas foram identificados, a maioria ainda permanecem descaracterizados ou desconhecida 6. Um dos grandes desafios na metaloproteínas de medição é o requisito para manter o estado nativo da proteína 7. Classical bottom-up técnicas proteômicas contar com a digestão das proteínas em peptídeos. Este processo interrompe a interacção não-covalente de metais e suas proteínas. Assim, nenhuma informação sobre o estado de metal de uma proteína é obtida. Uma maneira de superar esse problema é usando cromatografia de exclusão de tamanho emparelhado com plasma indutivamente acoplado - 8,9 espectrometria de massa (SEC-ICP-MS). Isto gera informação sobre o tamanho aproximado da proteína, assim como quaisquer metais que são Associated com ele 10. Além disso, de exclusão por tamanho é uma técnica cromatográfica suave que pode preservar o estado nativo de um complexo enzimático ou proteína-proteína. Uma vantagem do uso de plasma acoplado indutivamente - espectrometria de massa (ICP-MS) é a natureza quantitativa da tecnologia. Utilizando um conjunto de padrões de metaloproteínas é possível fornecer de metaloproteínas quantificação absoluta de amostras biológicas 9,11. Isto é conseguido através da geração de uma curva padrão através da injecção de metaloproteínas conhecidos ao longo de um intervalo de concentrações de metal. Este protocolo mostra um exemplo de como isto pode ser conseguido por uma variedade de padrões de metaloproteínas. Neste trabalho pretendemos criar curvas padrão para metais que são amplamente investigadas em áreas biológicas, incluindo ferro (Fe), cobre (Cu), zinco (Zn), iodo (I), e cobalto (Co).

<table><tbody><tr><td>Agilent 1290 Infinity Bomba Binária</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1200 Series Autosampler Termostato</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Compartimento de Coluna Termostatado</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Detector de Comprimento de Onda Variável</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Base de metal traço de hidróxido de amônio &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Nitrato de amônio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>256064</td><td>Faça uma solução fresca de 200mM no dia do experimento</td></tr><tr><td>&nbsp; Antinomia</td><td>Analítica de escolha&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ceruloplasmina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Césio&nbsp;</td><td>Analítica de escolha&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Inibidores de protease completos e livres de EDTA&nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Conalbumina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Concanavalina A de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; , Zn Superóxido dismutase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ferritina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td> Padrões de calibração multielementar ICP-MS&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Composto até as concentrações necessárias em ácido nítrico a 1%</td></tr><tr><td> Espectrofotômetro UV de microvolume&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 65% de ácido nítrico&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>diluído a 1% para uso</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubulação Peek&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Coluna de exclusão de tamanho BioSEC-3 PLC. coluna, 4,6 x 300 mm, 3 &mu; m, 150 & &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cloreto de Sódio&nbsp;</td><td>Fornecimento Químico</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cloridrato de Tris&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals inc.&nbsp;</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tireoglobulina</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vitamina B12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

normas para análise quantitativa metalloproteomic usando tamanho exclusão icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Os metais são essenciais para a função das proteínas como cofatores para catalisar reações químicas. A interrupção da homeostase dos metais está implicada em várias doenças, incluindo a doença de Alzheimer e Parkinson, mas o papel exato que esses metais desempenham ainda não foi totalmente elucidado. A identificação de metaloproteínas encontra muitos desafios e dificuldades. Aqui relatamos uma abordagem que permite quantificar metaloproteínas em amostras complexas. Isso é obtido usando cromatografia de exclusão de tamanho acoplada com espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (SEC-ICP-MS). Usando seis metaloproteínas conhecidas, a coluna de exclusão de tamanho pode ser calibrada e os respectivos oligoelementos (ferro, cobre, zinco, cobalto, iodo) podem ser usados para quantificação. Traços SEC-ICP-MS do cérebro e plasma humanos são apresentados. O uso desses padrões de metaloproteínas fornece os meios para comparar quantitativamente as abundâncias de metaloproteínas entre amostras biológicas. Esta técnica está pronta para ajudar a esclarecer o papel das metaloproteínas em doenças neurodegenerativas, bem como outras doenças em que desequilíbrios em oligoelementos estão implicados.

O uso de padrões de metaloproteínas permite a calibração da coluna de exclusão de tamanho. A Figura 1A mostra o perfil de eluição para os padrões tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e a vitamina B 12, com base no metal que está ligado a (Fe, co, Cu, Zn e I). a Figura 1B mostra a curva de calibração para a coluna de exclusão por tamanhos com base no peso molecular de padrões de proteína e o seu tempo de eluição, apresentada sob a forma de volume de eluição (Ve), dividido pelo volume vazio do coluna (Vo). As proteínas utilizadas para gerar esta curva padrão são concanavalina A, conalbumina, ceruloplasmina, a ferritina, a SOD e a tireoglobulina. A Figura 2A mostra a eluição da ferritina ao longo de um intervalo de 2.000 - 60.000 pg de Fe injectado na coluna e a figura 2D representa a análise de regressão efectuada utilizando párea de EAK. As Figuras 2B e 2C são os perfis de eluição de Cu / Zn SOD para o Cu e Zn e 2E e 2F são as análises de regressão gerado usando as áreas dos picos. Os resultados da análise de regressão são utilizadas para converter os dados em bruto em contagens / seg para pg / seg de modo que a quantidade de metal associada com a proteína pode ser determinada quantitativamente. A conversão é feito dividindo as contagens / seg por o declive da regressão linear (por exemplo, 334,6 (contagens / s) x (seg / pg) de cobre). Como foi dito, esta técnica pode ser usada para identificar metaloproteínas em amostras biológicas complexas. O cérebro humano e de plasma foram submetidas a esta técnica e as Figuras 3 e 4, respectivamente, mostram os resultados obtidos. O cérebro humano separados por SEC-ICP-MS é mostrado nas Figuras 3A-3C, cada um dos quais representa um metal diferente do<html> interesse (Cu, Zn ou Fe). Figuras 4A-4C mostram os traços obtidos quando o plasma humano é submetido a esta técnica. A complexidade e abundância da amostra terá impacto sobre o número de picos que são vistos. Como plasma esperado é dominado por algumas metaloproteínas incluindo ceruloplasmina e transferrina. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figura 1. A calibração de cromatografia de exclusão de tamanho - Plasma Indutivamente Acoplado - Espectrometria de Massa Usando conhecido perfil Metaloproteínas (A) A eluição para os padrões de metaloproteínas em função dos respectivos metais.. (B) curva de calibração de peso molecular para proteínas padrão tiroglobulina (I), ferritina (II), ceruloplasmina (III), conalbumina (IV), Cu / Zn SOD (v) e concanavalina A (VI).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figura 2. Uso de ferritina e Cu / Zn SOD como metaloproteína Normas para determinar a quantidade de Cu, Fe ou Zn Associated com Metaloproteínas em uma amostra biológica Complex (A) perfil de eluição para ferritina em toda a gama de injeção de 2.000 -. 60.000 mg / L de ferro. (B) e (C) para o perfil de eluição de Cu / Zn SOD através da injecção gama de 200 - 6000 ug / L de cobre e zinco, respectivamente. (D), (E) e (F) mostram os resultados da análise de regressão de metais de ferro, cobre e zinco, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3. Cu, Fe e Zn Metalloproteome de Cérebro humano. (A) traço de cobre (B) traço de ferro (C) Zinc vestígios. Eluição dos padrões de proteína para cada metal é mostrado pelo traço preto com seu peso molecular indicado no gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figura 4. Cu, Fe e Zn Metalloproteome para o plasma humano. (A) traço de cobre (B) traço de ferro (C) Zinc vestígios. A eluição dos padrões de proteína para cada metal é mostrado pelo traço negro com o seu peso molecular emdicated sob o gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A cromatografia de exclusão de tamanho hifenizada com plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (ICP-MS) é uma ferramenta poderosa para medir mudanças na abundância de metaloproteínas diretamente de amostras biológicas. Aqui descrevemos um conjunto de padrões de metaloproteínas usados para estimar a massa molecular e a quantidade de metal associada a proteínas desconhecidas.

Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

O objetivo geral desta técnica é quantificar diferentes metaloproteínas em padrões complexos com base no uso de padrões conhecidos de metaloproteínas. Este método pode responder perguntas fundamentais sobre o papel dos metais na biologia. Por exemplo, como o estado metálico de uma proteína muda na doença?Uma vantagem fundamental desta técnica é que ela permite medir o estado metálico de uma proteína em seu estado nativo. Demonstrará a técnica Amber Lothian, aluna de doutorado do meu laboratório. Para começar, homogeneíze tecidos ou amostras de cultura celular manualmente ou por sonicação durante cinco minutos usando solução salina tamponada com Tris.Clarifique os homogenatos por centrifugação a 16.000 × g durante cinco minutos. Após coletar o sobrenadante resultante, normalize a quantidade total de proteína determinando as concentrações de proteína conforme descrito no protocolo do texto. Aqueça e ajuste o espectrômetro de plasma acoplado indutivamente, utilizando os protocolos do fabricante.Dilua os padrões de metaloproteínas para ficar na faixa de zero a 500 microgramas por litro, utilizando ácido nítrico a 1%. Para obter padrões dentro dessa faixa, não use diluições superiores a 1 para 20. Configure a ordem das injeções analisando primeiro os sete níveis de calibração.Concentrações variando de zero a 500 microgramas por litro, seguidas pelos padrões de metaloproteínas. Os sete níveis de calibração são zero, um, cinco, dez, 50, 100 e 500 microgramas por litro. Em seguida, selecione os elementos de interesse.Aqui, utilize ferro, cobre, zinco, cobalto e iodo, pois são os elementos aos quais os padrões proteicos estão ligados. Selecione os elementos no método de aquisição abrindo a guia do seletor de elementos e adicionando os elementos e suas respectivas massas isotópicas que serão analisadas.Em seguida, realize a análise das amostras com o instrumento. O software do instrumento cria automaticamente as curvas de calibração para cada um dos elementos analisados. Utilize as curvas de calibração para determinar a concentração de metal nas amostras desconhecidas.A partir dos resultados da análise em massa, gere os padrões de metaloproteínas que incluam os três elementos-traço mais abundantes em tecidos de mamíferos, utilizando uma mistura de cobre, superóxido dismutase de zinco e ferritina. Purgue as bombas de cromatografia rápida de alto desempenho, ou HPLC, com tampão de nitrato de amônio 200 milimolar durante cinco minutos a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. Após a purgação do sistema, ajuste a taxa de fluxo para zero vírgula um mililitro por minuto.E conecte a coluna de exclusão lateral. Conecte a extremidade oposta da coluna ao detector de UV, ajustando a medida de absorbância em 280 nanômetros, utilizando tubo capilar. Aumente gradualmente a taxa de fluxo da coluna em incrementos de zero vírgula um mililitros por minuto, até atingir uma taxa de fluxo final de zero vírgula quatro mililitros por minuto.Enquanto isso ocorre, verifique as conexões dos tubos à coluna quanto a possíveis vazamentos. Monitore a pressão deste sistema para garantir que ela não exceda os requisitos da coluna, observando o traçado da pressão no cromatograma no software. Deixe a coluna equilibrar na taxa de fluxo necessária por cinco a 10 volumes de coluna.Após a equilibração, conecte os instrumentos para permitir a realização da análise da amostra. Configure o método de CLAE para bombear o tampão A pela coluna a zero vírgula quatro mililitros por minuto, durante 15 minutos. Coloque o ICPMS em modo de espera antes de alterar a configuração do equipamento.Uma vez no modo de espera, desligue a comunicação para o amostrador automático e altere a introdução da amostra para outro. Use tubo de PEEK para conectar o efluente do detector UV diretamente ao nebulizador do ICPMS. Ligue o ICPMS e deixe o instrumento aquecer por 10 a 20 minutos.Após a ignição do plasma, conecte o cabo remoto do ICPMS à parte traseira do amostrador automático da CLAE. Faça isso somente após a ignição do plasma. Caso contrário, o sistema de CLAE desligará automaticamente, já que o ICPMS não estará ligado.Altere o método de ICPMS para coletar dados para LC ICPMS, primeiro mudando o método de aquisição de espectro para aquisição no tempo resolvido. Em seguida, selecione os elementos a serem analisados. Ferro, cobre, zinco, cobalto, iodo, bem como quaisquer outros elementos de interesse, e defina os tempos de integração.Após a seleção dos elementos de interesse, ajuste o tempo de aquisição para corresponder ao tempo de corrida da cromatografia. Sintonize manualmente o ICPMS quanto à sensibilidade e às taxas de fluxo de gás hélio na célula de colisão, utilizando um tampão de cromatografia que contenha césio e antimônio. Uma vez que as contagens de íons metálicos estejam estáveis e os valores de desvio padrão relativo estejam abaixo de cinco por cento, o sistema estará pronto para uso.Crie listas de execução de amostras nos programas de software da CLAE e da ICPMS. A lista de execução de amostras contém a ordem na qual cada uma das amostras será injetada, bem como o nome pelo qual os dados serão salvos.Verifique se o número total de amostras na lista corresponde entre os dois programas. Inicie o lote de amostras para o ICPMS antes da CLAE, pois a injeção da amostra pela CLAE acionará o ICPMS para começar a coletar dados. Se isso não for feito na ordem correta, resultará em dados ausentes.Gere pontos para a curva de calibração injetando volumes variados do padrão misto de superóxido dismutase e ferritina. Os volumes de injeção variam de um microlitro a 30 microlitros. Por fim, analise cada uma das amostras desconhecidas, como tecido, plasma ou cultura celular, antes de analisar os dados conforme descrito no protocolo textual.É mostrada a ilusão da ferritina em uma faixa de 2000 a 60.000 picogramas de ferro injetados na coluna. A análise de regressão foi realizada utilizando a área do pico. Os perfis de ilusão para cobre, zinco e superóxido dismutase são mostrados tanto para cobre quanto para zinco.As análises de regressão geradas utilizando as áreas dos picos também são apresentadas. Os resultados da análise de regressão são usados para converter os dados brutos em contagens por segundo para picogramas por segundo, de modo que a quantidade de metal associada à proteína possa ser determinada quantitativamente.Essa técnica pode ser usada para identificar metaloproteínas em amostras biológicas complexas. Aqui, é mostrado o cérebro humano separado por SEC ICPMS. Cada um representa um metal diferente de interesse.Ou seja, cobre, zinco ou ferro. Aqui são mostrados os traços obtidos quando o plasma humano é submetido a esta técnica. A complexidade e a abundância da amostra influenciarão o número de picos observados.Como esperado, o plasma é dominado por algumas metaloproteínas, incluindo ceruloplasmina e transferrina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como configurar um instrumento para medir o estado nativo de metaloproteínas em amostras complexas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser aplicada com sucesso em três a quatro horas.Isso permite analisar de 20 a 36 amostras em um único dia. Ao tentar este procedimento, é importante usar os padrões apropriados de metaloproteínas, como a SOD de cobre e zinco se você estiver interessado em cobre e zinco. Assim como os padrões internos no tampão, como o césio, que permitem corrigir qualquer deriva do instrumento ao longo do tempo.Após este procedimento, você também pode implementar outras formas de espectrometria de massas para responder perguntas importantes. Por exemplo, quais são as metaloproteínas presentes na minha amostra? Isso pode ser feito por meio de digestão padrão e sequenciamento de peptídeos proteicos por espectrometria de massas.Ou, analisando as proteínas intactas, em seu estado nativo. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de proteômica compreenderem o papel das metaloproteínas em doenças, como a doença de Alzheimer. Não se esqueça de trabalhar com ácido nítrico concentrado e amostras clínicas.Equipamento de proteção pessoal apropriado deve ser utilizado.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Um protocolo detalhado é descrito para a separação, identificação e caracterização de proteoforms em amostras de proteínas usando a zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS). O protocolo pode ser usado para a caracterização de alta resolução do proteoforms em amostras da proteína simples e a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Este protocolo descreve o uso da cromatografia de permuta iónica alta especificidade com multi-ângulo de dispersão de luz para uma exata determinação da massa molar de proteínas, complexos de proteínas e peptídeos em uma amostra heterogênea. Este método é valioso para a avaliação da qualidade, bem como quanto a caracterização dos oligômeros nativos, variantes de carga e misturado-proteína amostras.

Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.

Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Este método de especiação de redox de ferro é baseado na espectrometria de massa de plasma capilar indutivamente acoplada com empilhamento de amostras combinado com análise curta em uma corrida. O método analisa rapidamente e fornece baixos limites de quantificação para espécies de redox de ferro em uma variedade diversificada de tecidos e amostras biofluidas.

Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))

Aqui apresentamos um protocolo para caracterizar a completa corona biomolecular, proteínas e metabólitos, adquiridas por nanomateriais de biofluidos usando uma eletroforese capilar – abordagem de espectrometria de massa.

Abordagens de espectrometria de massa de eletroforese capilar para caracterização da proteína e corona metabólica adquirida por nanomateriais

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica

Aprenda a quantificar metaloproteínas em amostras biológicas complexas usando cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a ICP-MS. Este método permite analisar o estado metálico de proteínas em seu estado nativo, revelando insights sobre processos biológicos e doenças.

Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

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