Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

O objetivo geral desta técnica é ser capaz de quantificar diferentes metaloproteínas em padrões complexos com base no uso de padrões de metaloproteínas conhecidos. Este método pode responder a perguntas-chave sobre o papel dos metais na biologia. Por exemplo, como o status metálico de uma proteína muda na doença?

Uma das principais vantagens dessa técnica é que ela permite medir o status metálico de uma proteína em seu estado nativo. Demonstrando a técnica estará Amber Lothian, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, amostras homogeneizadas de tecido ou cultura de células, por downs manuais ou sonicação por cinco minutos usando solução salina tamponada com Tris.

Clarificar homogeneizados por centrifugação a 16 000 vezes G, durante cinco minutos. Depois de coletar o sobrenadante resultante, normalizar a quantidade total de proteína determinando as concentrações de proteína conforme descrito no protocolo de texto. Aqueça e ajuste o maspectrômetro de plasma indutivamente acoplado, usando os protocolos do fabricante.

Dilua os padrões de metaloproteína para aproveitar a queda na faixa de zero a 500 microgramas por litro, usando um por cento de ácido nítrico. Para atingir padrões dentro dessa faixa, não use diluições superiores a um e 20. Configure a ordem das injeções analisando primeiro os sete níveis de calibração.

Concentrações variando de zero a 500 microgramas por litro, seguidas pelos padrões de metaloproteínas. Os sete níveis de calibração são zero, um, cinco, dez, 50, 100 e 500 microgramas por litro. Em seguida, selecione os elementos de interesse.

Aqui, use ferro, cobre, zinco, cobalto e iodo. Como são os elementos aos quais os padrões de proteína estão vinculados. Selecione os elementos no método de aquisição abrindo a guia seletor de elementos e adicionando os elementos e suas respectivas massas isotópicas que devem ser analisadas.

Em seguida, realize a análise amostral com o instrumento. O software do instrumento cria automaticamente as curvas de calibração para cada um dos elementos que estão sendo analisados. Use as curvas de calibração para determinar a concentração de metal nas amostras desconhecidas.

A partir dos resultados da análise em massa, gere os padrões de metaloproteína que incluem os três oligoelementos mais abundantes nos tecidos de mamíferos usando uma mistura de cobre, zinco superóxido dismutase e ferritina. Purgue a cromatografia rápida hyperformance, ou bombas de HPLC, com tampão de nitrato de amônio 200 milimolares por cinco minutos a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. Uma vez purgado o sistema, ajuste a vazão no ponto zero de um mililitros por minuto.

E conecte a coluna de exclusão do lado. Conecte a extremidade oposta da coluna ao detector UV, ajuste a absorbância da medida em 280 nanômetros, usando tubulação de pico. Aumente gradualmente a vazão da coluna em incrementos de zero vírgula um mililitros por minuto, até atingir uma vazão final de zero vírgula quatro mililitros por minuto.

Enquanto isso estiver ocorrendo, verifique se há vazamentos nas conexões da tubulação com a coluna. Monitore a pressão deste sistema para garantir que ele não exceda os requisitos da coluna, observando o traço de pressão no cromatograma no software. Deixe a coluna se equilibrar na vazão necessária em cinco a 10 volumes de coluna.

Depois de equilibrado, conecte os instrumentos para permitir que a análise da amostra ocorra. Configurar o método HPLC para bombear o tampão A sobre a coluna a quatro mililitros por minuto, durante 15 minutos. Coloque o ICPMS no modo de espera antes de alterar a configuração de hardware.

Uma vez no modo de espera, desligue a comunicação do amostrador automático e altere a introdução da amostra para outra. Use a tubulação PEEK para conectar o fluxo de saída do detector UV diretamente ao nebulizador no ICPMS. Ligue o ICPMS e deixe o instrumento aquecer por 10 a 20 minutos.

Depois que o plasma acender, conecte o cabo remoto do ICPMS à parte traseira do amostrador automático de HPLC. Faça isso assim que o plasma se inflamar. Caso contrário, o sistema HPLC será desligado automaticamente, pois o ICPMS não está ativado.

Altere o método ICPMS para coletar dados para LC ICPMS alterando primeiro o método de aquisição de espectro para aquisição de resolução de tempo. Em seguida, selecione os elementos a serem analisados. Ferro, cobre, zinco, cobalto, iodo, bem como quaisquer outros elementos de interesse, e definir tempos de integração.

Depois que os elementos de interesse forem escolhidos, ajuste o tempo de aquisição para corresponder ao tempo de execução da cromatografia. Ajuste manualmente o ICPMS para sensibilidade e taxas de fluxo de gás hélio da célula de colisão com um tampão de cromatografia fluindo com césio e antimônio incluídos no tampão. Uma vez que as contagens de íons metálicos tenham se estabilizado e os valores relativos de desvio padrão estejam abaixo de cinco por cento, o sistema está pronto para uso.

Faça listas de execuções de amostra nos programas de software HPLC e ICPMS. A lista de ensaios de amostra contém a ordem em que cada uma das amostras deve ser injetada. Bem como o nome pelo qual os dados serão salvos.

Verifique se o número total de amostras na lista corresponde entre os dois programas. Inicie o lote de amostras para o ICPMS antes da HPLC, pois a injeção da amostra pela HPLC acionará o ICPMS para iniciar a coleta de dados. Se isso não for feito na ordem correta, resultará em dados ausentes.

Gere pontos de curva de calibração injetando volumes variados do padrão misto de superóxido dismutase e ferritina. Os volumes de injeção variam de um microlitro a 30 microlitros. Por fim, analise cada uma das amostras desconhecidas, como tecido, plasma ou cultura de células, antes de analisar os dados conforme descrito no protocolo de texto.

A ilusão de ferritina em uma faixa de 2000 a 60.000 picogramas de ferro injetado na coluna é mostrada. A análise de regressão foi realizada usando a área de pico. Os perfis de ilusão para cobre, zinco, superóxido dismutase são mostrados para cobre e zinco.

As análises de regressão geradas usando áreas de pico também são mostradas. Os resultados da análise de regressão são usados para converter os dados brutos em contagens por segundo em picogramas por segundo. Para que a quantidade de metal associada à proteína possa ser determinada quantitativamente.

Esta técnica pode ser usada para identificar metaloproteínas em amostras biológicas complexas. Aqui, o cérebro humano separado pelo SEC ICPMS é mostrado. Cada um dos quais representa um metal diferente de interesse.

Ou seja, cobre, zinco ou ferro. Aqui são mostrados os traços obtidos quando o plasma humano é submetido a esta técnica. A complexidade e abundância da amostra afetarão o número de picos vistos.

Como esperado, o plasma é dominado por algumas metaloproteínas, incluindo ceruloplasmina e transferrina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar um instrumento para medir o estado nativo das metaloproteínas em amostras complexas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser aplicada com sucesso em três a quatro horas.

Isso permite que 20 a 36 amostras sejam analisadas em um único dia. Ao tentar este procedimento, é importante usar os padrões de metaloproteína apropriados, como SOD de cobre e zinco, se você estiver interessado em cobre e zinco. Bem como os padrões internos no buffer, como o césio, que permite corrigir qualquer desvio no instrumento ao longo do tempo.

Seguindo este procedimento, você também pode implementar outras formas de espectrometria de massa para responder a perguntas importantes. Por exemplo, quais são as metaloproteínas presentes na minha amostra? Isso pode ser feito por viagens padrão na digestão e sequenciamento de peptídeos de proteína de espectrometria de massa.

Ou, analisando as proteínas intactas, em seu estado nativo. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para que pesquisadores da área de proteômica entendam o papel das metaloproteínas em doenças, como a doença de Alzheimer. Não se esqueça de trabalhar com ácido nítrico concentrado e amostras clínicas.

Equipamento de proteção individual apropriado deve ser usado.