Name: RNAi gatilho para o interior Anopheles gambiae As pupas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a entregar gatilhos de RNAi em pupas de Anopheles gambiae para estudos de biologia de vetores. Este método permite o silenciamento gênico durante estágios pré-adultos, abrindo novas possibilidades para pesquisas funcionais em mosquitos vetores da malária.

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Gostaríamos de agradecer à Dra. Flaminia Catteruccia e seu grupo de pesquisa (Harvard School of Public Health, Boston, MA) por fornecer ao nosso laboratório a colônia G3 usada nesta pesquisa e pelo DNA modelo LacZ. Agradecemos a Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) por sua ajuda na manutenção do insetário. O Departamento de Biologia do Boston College financiou generosamente a pesquisa associada ao desenvolvimento dessa técnica.

1. Síntese e Preparação ARNcd <ol><li> Identificar uma região knockdown 200-800 pb (para gerar o ARNcd correspondente) dentro do gene de interesse que é previsto para ter não identificáveis ​​efeitos fora do alvo (por exemplo, nenhuma homologia de sequência de ≥18 pb dentro de um outro gene) e um controlo negativo (por exemplo, , uma sequência heteróloga que não está presente dentro do genoma de insectos alvo, tal como o gene lacZ de Escherichia coli (GenBank gene ID: 945006). em alternativa, utilizar um controlo positivo (por exemplo, o que origina um fenótipo facilmente observado, tais como 21,22 SRPN2 , Gene GenBank ID:. 1270169) a sequência do SRPN2 segmentação ARNcd é definido em Michel et al (2005) 21.. Nota: E-ARNi é um recurso bioinformática-fonte aberto que é útil para a identificação de tais regiões e para o processo de concepção de iniciadores oligonucleotídicos 23. </li><li> execute standard amplificação de PCR (ou seja, realizada com Taq DNA polimerase, utilizando 30-35 ciclos) utilizando um ADN genómico ou de ADNc molde para obter a síntese de molde ARNcd flanqueado por uma sequência de promotor de T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) e prosseguir com a preparação e ARNdc limpar-se utilizando um kit comercial de transcrição in vitro de acordo com as instruções do fabricante. Use SRPN2 PCR condições de amplificação e informações iniciador, tal como apresentado em An et al. (2011) 22. </li><li> Quantificar os rendimentos de ARN amplicon purificado por espectroscopia de absorção de ultravioletas a comprimento de onda de 260 nm e ajustar-se a concentração desejada (por exemplo, 3 mg / mL) em água isenta de RNase. <ol><li> Para solucionar problemas de baixas concentrações de RNA, reduzir o volume de líquido por fiação amostras numa centrífuga de vácuo à temperatura ambiente ou por liofilização de amostras e reconstituindo em menores volumes de água. O tempo necessário para a liofilização da amostra irá variar dependendoem volumes de amostras iniciais e as concentrações de ARNdc. </li></ol></li><li> Verificar a qualidade ea duração do ARNcd num gel de agarose a 2% preparada com 1 x TBE ou TAE tampão e coradas com brometo de etídio (EtBr), juntamente com o ADN molde utilizado para a reacção de transcrição. O ARNcd migrarão mais lentamente do que o ADN molde. Qualidade e comprimento pode ser avaliada por assegurando que não há produtos não específicos de ARNdc e por com um marcador de ADN padrão comparando produtos, respectivamente. Nota: EtBr é um mutagênico potente e deve ser tratado em conformidade. Nota: Para uma concentração de ARNcd de 3 mg / mL, 0,5 mL da amostra é mais do que suficiente para a visualização do gel de agarose manchado-EtBr. </li><li> ARNcd armazenar a -20 ° C até ser necessário. Múltiplos ciclos de congelamento / descongelamento podem causar degradação, de modo alíquotas deve ser preparado para grandes volumes de ARNcd. </li></ol> 2. Prepare verde rápido Dye Tubes (FGD) <ol><li> Diluir rápida corante verde FCFa partir de solução-mãe (≥85% de teor de corante) a 0,1% (v / v) (solução de trabalho), em água isenta de RNase. </li><li> Pipetar 1 mL de corante no fundo de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Colocar os tubos em um bloco de calor a 65 ° C durante aproximadamente 3 horas para evaporar, em seguida Colocar os tubos líquidos à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos, para arrefecer antes de usar. Este corante sólido seco irá reconstituir a ressuspensão em solução ARNcd. </li></ol> 3. Agulhas Pull injeção <ol><li> Puxar agulhas de vidro de borosilicato, utilizando um extrator de agulhas aquecido a uma diâmetro da ponta de 10-30 mm. Pull configurações correspondem a: ajuste aquecedor não. 1 = 100, o ajuste aquecedor não. 2 = 70. </li><li> Para evitar danos ao fina ponta da agulha, colocar todas as agulhas puxado horizontalmente numa placa de Petri sobre uma tira de moldagem de massa de vidraceiro. Nota: Informações adicionais para agulha capilar métodos puxando pode ser encontrada em mais detalhe na Malaria Research and Reference Reagent Resource Center MManual de R4 24. </li></ol> 4. Prepare Station Injection <ol><li> Recolha materiais necessários: agulhas microcapilares vidro puxado para ponta fina, microinjetor, papel de filtro fino e papel de filtro grosso, placas de Petri, pipetas de transferência, pincel e dissecando microscópio de luz. </li><li> Prepare o microinjetor conforme as instruções no manual microinjetor, e ajustar o volume de injeção de volume desejado por pulso (por exemplo, máximo de 69 nl por pulso). </li><li> Em uma plataforma que é fácil de manobrar sob um microscópio (por exemplo, o lado liso de um suporte de tubos de isopor), empilhar as duas folhas de papel de filtro com o papel de filtro fino no topo, e prenda com fita em torno das bordas. </li><li> Ressuspender 10 ml de cada solução de dsRNA em tubos de corante de cor separados, e colocar no gelo. </li></ol> 5. Recolher Pupae para Injecção <ol><li> Encha uma pequena 60 milímetros x 15 mm placa de Petri com 10 ml de água deionizada, e recolher ~ 50 pupas pálido (During a 24 h depois da primeira formação da pupa) a partir de uma bandeja insectary usando uma pipeta de transferência de plástico descartável. </li><li> Remova qualquer pupas que têm médio e escuro bronzeamento cutícula. Nota: Uma vez que a cutícula começa a curtir, torna-se mais difícil de penetrar a cutícula, e os resultados de injeção em muito maior letalidade. </li></ol> 6. Injeção de dsRNA <ol><li> Sob o microscópio de dissecação, parta a ponta distal da agulha de injecção com um par de fórceps finos. </li><li> Prepara-se o enchimento por agulha de injecção a agulha com óleo mineral (usando uma seringa com uma agulha de calibre 30 de 3 polegadas), e expelir o excesso de óleo com o microinjector. </li><li> Frente preencher agulha de injecção com uma quantidade máxima de dsRNA, e ejectar um impulso ao microscópio para assegurar a distribuição de líquido. No caso em que o líquido não é absorvido e / ou expelido, verificar a ponta distal da agulha para qualquer bloqueio e assegurar que a agulha está firmemente fixada na microinjector. </li><li> Escolha 1-3 pupas, e colocá-los no papel de filtro. </li><li> Usando o pincel, posicionar o pupas no papel de filtro com dorsal cutícula acessível, e usar o pincel para empurrar em papel de filtro e absorver qualquer excesso de água. </li><li> Estabilizar a pupa com a ponta do pincel, e inserir a agulha na cutícula dorsal entre o tórax e do abdómen, num ângulo de aproximadamente 30 ° em relação à superfície dorsal da pupa. A injecção deve ser dirigida para a extremidade posterior da pupa e agulha deve ser movido numa direcção anterior para posterior. </li><li> Injectar dois pulsos (69 nl por pulso) de solução de 3 mg / mL dsRNA na hemolinfa, e verificar se há a distribuição de cor ao longo do corpo. Se nenhuma cor é identificada, mudar a posição da agulha de injeção ligeiramente para limpar a ponta da obstrução e repetir a entrega líquido. </li><li> Use o pincel molhado para mover suavemente pupa da agulha na água para a cultura. Tele pupa deve ficar para o pincel em cima do contato luz. </li></ol> 7. Condições pós-injeção <ol><li> Coloque uma placa de Petri com pupas injectado numa gaiola de mosquitos com um fluxo de ar adequado (por exemplo, gaiola de malha ou recipiente com tampa de malha). condições de criação pupa deve permanecer consistentemente em 27 ± 3 ° C de temperatura, 75 ± 5% de umidade e estar sob uma luz: ciclo escuro de 16: 8 hr. </li><li> Prepara-se uma a 10% (w / v) de solução de glucose, e colocar uma bola de algodão saturado com solução na gaiola de mosquitos malha para a alimentação de adultos. </li></ol> 8. Avaliar Knockdown <ol><li> No ponto de tempo desejado (s), em avaliar os fenótipos experimentais insectos injectados com ARNcd, em comparação com os controlos. <ol><li> Avaliar dsSRPN2 e dsLacZ insectos diariamente por refrigeração para baixo adultos durante cerca de 2-3 min a -20 ° C, transferindo-os para uma placa fria a 2 ° C e a identificação de qualquer formação de pseudo-tumoral por utilização de um microscópio de dissecação em 15Xampliação com iluminação de campo claro. Após a avaliação, o retorno adultos às condições insetário (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% de umidade). Nota: Os dsRNAs experimentais e de controlo utilizados neste protocolo são dsSRPN2 e dsLacZ, respectivamente. Há muitas opções adequadas para os controlos; no entanto, sugere-se que um controlo positivo para o qual fenótipo e / ou expressão é facilmente visualizado (por exemplo, por meio de dissecção microscopia) e / ou quantificada [por exemplo, quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), Western blot] deve ser utilizada quando aprender esta técnica. SRPN2 proteína e quantificação transcrição através de Western blot e qRT-PCR, respectivamente, são descritos em Michel et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

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Os métodos actuais para induzir RNAi não transgénicos em mosquitos envolver a injecção directa de ARNcd no hemocelo 12,13 adulto ou a alimentação das larvas de ARNi nanopartículas revestidas de gatilho ou 14-17-microalgas baseado ARNcd 18 moléculas. Segmentação do mosquito adulto, embora extremamente valioso, pode excluir um grande número de genes que funcionam durante períodos de desenvolvimento anteriores. Knockdown iniciado pela alimentação das larvas podem produzir fenótipos inconsistentes durante a fase adulta, devido, em parte, ao potencial de persistência proteína variável através da fase de pupa. Portanto, a introdução de um método adicional que é voltado especificamente para iniciar RNAi durante o desenvolvimento da pupa irá fornecer um meio para avaliar mais detalhadamente as funções dos genes durante estágios de desenvolvimento pré-adultos, bem como capacidades melhoradas para avaliar a função do gene durante os estágios adultos. Tal como com a abordagem de gene knockdown com base em injecção de ARNcd ou expressão, a persistência do gene knockdownnão pode ser prevista. Portanto, os níveis de transcritos ou proteínas devem ser avaliadas para o gene de interesse durante períodos de desenvolvimento de interesse. Embora observamos uma continuação da diminuição dos níveis de proteína no dia 5 pós-injeção para SRPN2 em animais SRPN2 dsRNA-injetados, fatores como a rotatividade de proteína e meia-vida pode ser diferente para diferentes alvos. É crítico para garantir, assim, que o ARNcd para ser utilizado para injecção é bem concentrada e parece intacto num gel de agarose. Recomendamos experimentadores reavaliar esses fatores se os resultados knockdown não são suficientes, e respectivas concentrações de dsRNA pode precisar de ser testado empiricamente para genes alvos específicos. Descreve-se um método para a iniciação da interferência de ARN durante a fase de pupa de An. desenvolvimento gambiae. Este método baseia-se na introdução através de micro-injecção de ARNcd directamente no hemocelo de pupas precoce e permite a avaliação da qualidade da injecção pelautilização de ARNcd marcado com corante. A habilidade de visualizar a qualidade injecção constitui uma melhoria importante para garantir uma knockdown bem sucedida e constitui um aspecto do silenciamento de genes com base em injecção que não tenha sido considerada em protocolos baseados em ARNcd mais previamente relatados centrados na fase adulta. Ao direccionar a pupa no início deste período de desenvolvimento, genes que podem desempenhar um papel no desenvolvimento durante este intervalo crítico, ou durante as fases iniciais da vida adulta pode ser avaliada funcionalmente. Além disso, este método pode permitir a entrega dsRNA para as células, e o estabelecimento de interferência de RNA em células que são acessíveis durante a metamorfose, mas menos acessível em mosquitos adultos completamente formados. Uma análise recente por microarranjo Harker et al. (2012) identificaram 560 An. transcrições gambiae que foram up-regulamentados ou para baixo-regulados por pelo menos 4 vezes durante diferentes estágios de desenvolvimento, desde o embrião a adulto. Dos 560 transcrições identificado, um conjunto de 309 foi up-regulada durante o desenvolvimento da pupa 27. Estas descobertas sugerem que há muitas exigências para expressão diferencial de genes ao longo do desenvolvimento do mosquito, incluindo aqueles que ocorrem durante a fase de pupa, um intervalo durante o qual o organismo sofre metamorfose. Em muitas espécies de insectos, incluindo uma. gambiae, os genes envolvidos em processos de desenvolvimento, tais como (ou seja, cuticular da pupa e proteínas de ligação a quitina) 27-31 e resposta imunitária (isto é, proteínas de receptores Toll-like) 27,32-34 são altamente expresso durante a fase de pupa. Uma vez que um adulto completamente formado emergiu, não é continuada a expressão do gene em resposta a alterações fisiológicas e ambientais 35. Nomeadamente, durante o desenvolvimento precoce de adultos, há um aumento na expressão de genes de desenvolvimento (isto é, adulto cuticular e proteínas sarcoplasmáticas) 36, bem como outros genes chave (ou seja </em&gt;, Proteína específica de esperma e citocromo P450 enzimas do metabolismo) 27,36. O controlo positivo utilizado no desenvolvimento deste protocolo, SRPN2, é um AN. gambiae inibidor de protease de serina (serpina). SRPN2 desempenha um papel importante na regulação negativa da melanização de insectos, um amplo espectro de resposta imune inata em insectos 21,22. Knockdown de SRPN2 em mosquitos adultos resulta na formação de pseudo-tumor de 21,22, um fenótipo que é facilmente observada por utilização de microscopia de luz. Tendo em conta que este fenótipo distinto pode ser facilmente marcado em insetos vivos, usamos SRPN2 para injectáveis ​​estágio RNAi pupa iniciais. Além disso, SRPN2 é expresso em todas as fases de desenvolvimento 37, proporcionando desse modo um bom alvo para a fase de pupa ARNi injecção e avaliação da função no início adulto. Nós demonstramos que o método que desenvolvemos é capaz de induzir adulto semelhante pseud melanótico<html> a formação de O-tumor como uma consequência de injecções de dsRNA executadas durante a fase de pupa de desenvolvimento. No desenvolvimento deste protocolo, temos observado que a injeção durante o desenvolvimento da pupa precoce (isto é, a primeira 24 horas após a muda larva-pupa) é fundamental para a obtenção de emergência de adultos ideal. No caso de má emergência é obtido após a injecção, recomendamos a encenação larvas com maior precisão, para obter pupas com menos extensa endurecimento cutícula e assegurar a injeção fase de pupa início é alcançado. Além disso, minimizar os danos aos resultados da cutícula das taxas de emergência óptimas e aumentando a ampliação durante a injeção pode ajudar a garantir que apenas a região pretendida do animal é perfurado. Se a agulha deve perfurar através da cutícula ventral, o agrupamento de líquido marcado com corante será evidente no exterior da pupa, ou vai saturar o papel de filtro. É altamente recomendável para descartar qualquer pupas que têm mais de uma punção cutícula. jove_content &quot;&gt; Com as extensas experiências de muitos laboratórios com o desempenho de injeções de mosquitos adultos, as abordagens microinjeção previamente identificados pode ser adaptada com modificações de protocolo simples para uso em experimentos RNAi pupa. No geral, o objetivo deste método é o de fornecer aos pesquisadores a capacidade de ampliar o prazo durante o qual reverter análises genéticas pode ser realizada, permitindo uma pesquisa mais adicional que irá apoiar o desenvolvimento de estratégias de controle de vetores novos. Curiosamente, as experiências em outras espécies, como Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda, revelam que o gene efeitos silenciadores tendem a ser muito maior quando iniciado durante a pré-adulto estágios 38,39. durante todas as fases de desenvolvimento, gene RNAi mediada knockdown está sujeita a considerações sobre a rapidez ea persistência de silenciamento de genes, e a estabilidade das proteínas codificadas por genes-alvo. o alvo ideal RNAi genes tendem a ser aqueles que codificam uma protein ou de ARN que tem uma meia-vida curta e elevada taxa de rotação 11,40. Enquanto estratégias transgénicos ARNi também podem ser empregues para tratar as considerações sobre a rapidez e a persistência de ARNi durante as fases de pré-adulto, técnicas transgénicas têm muitos inconvenientes (por exemplo, o tempo necessário para a geração de linhas transgénicas, experimentais prazos de acasalamentos de mosquitos para gerar insectos com expressão dsRNA regulamentado, e manutenção de populações transgénicas). Por outro lado, o nosso protocolo proporciona um método mais fácil e mais rápido para iniciar silenciamento de genes durante o desenvolvimento da pupa e em tipos de células que se originam e são acessíveis durante a metamorfose, mas são menos acessíveis em adultos. A utilização de suspensões de dsRNA marcadas com corante permite a fácil avaliação do sucesso de injecção e a dispersão do material introduzido dentro de pupas. Os nossos dados sobre o início da formação de tumor em adultos pupa-injectado, em comparação com animais injectados como adultos, é consistente com o initiation de knockdown RNAi-mediada durante a fase de pupa. Usando nossa linha G3 mosquito e sob nossas condições insetário, observa-se o adulto melanotic formação de pseudo-tumor tão cedo quanto 10 dias após a injecção de adultos injetados três a cinco dias pós-emergência. Ao realizar a injeção início de pupa estágio, observamos a formação melanotic pseudo-tumor visível tão cedo quanto cinco dias após a injecção (ou seja, três a quatro dias após a emergência). Estes dados implicam que este método permite início de silenciamento de genes durante um período de desenvolvimento anteriormente sob estudado (ou seja, o desenvolvimento de pupa). O nosso método de marcação corante pode também ser útil para o desenvolvimento de novos protocolos de injecção larvais, devido à natureza translúcida da cutícula durante todas as fases larvares. Enquanto o controlo utilizadas neste estudo requer a progressão para a fase adulta para exibir um fenótipo de knockdown, futuras experiências para avaliar os fenótipos específicos da fase de pupa após a injecção de pupas cedo irá fornecerinformações valiosas sobre a expansão deste método em períodos de desenvolvimento adicionais, tais como o desenvolvimento de pupa tardia. Em resumo, este método fornece um protocolo de RNAi valiosa para a iniciação fase de pupa de silenciamento de genes RNAi-mediada e amplia as ferramentas de genômica funcional disponível para uso dentro da comunidade de investigação inseto vetor.

A malária é uma doença infecciosa transmitida por mosquitos que afeta muitos milhões de pessoas a cada ano. A Organização Mundial de Saúde (OMS) relata que em 2013 havia cerca de 584.000 mortes por malária, 78 por cento dos quais ocorreram em crianças com idade inferior a cinco anos 1. Os patógenos que causam a malária humana são parasitas apicomplexa dentro do Plasmodium género e são transmitidos entre seus hospedeiros humanos por mosquitos Anopheles fêmea. A transmissão ocorre quando o mosquito tem uma refeição de sangue de um indivíduo que está infectado e, em seguida depósitos parasitas infecciosos em um indivíduo não infectado em uma refeição de sangue subseqüente. Dentro do género Anopheles, Anopheles gambiae é a espécie com maior capacidade vetorial e é o vetor da malária mais proeminente na África sub-saariana 1-3. Atualmente, o controle de vetores de mosquito por implantação de inseticidas continua a bÊ O principal método utilizado para reduzir o fardo da malária humana. Embora o uso de insecticidas desde os anos 1960 demonstrou ser extremamente bem sucedida, o surgimento de resistência a insecticidas tem impulsionado uma necessidade para o desenvolvimento de novos insecticidas e estratégias de controlo alternativa vector 4-7. Em 2010, um total de 49 de 63 países que notificaram a OMS indicou a ocorrência de resistência a inseticidas em vetores da malária 1. Além disso, a ferramenta IR Mapper, que utiliza a literatura peer-reviewed para avaliar dados de resistência em regiões Afrotropicais, relata que entre 2001 e 2012 houve 46% e 27% de aumento na resistência aos piretróides e diclorodifeniltricloroetano (DDT), respectivamente 7. Interferência de RNA (RNAi) foi identificado na década de 1990, como uma técnica que pode ser empregue para inactivar genes na planta petúnia 8,9 e em que o fungo Neurospora crassa 9,10. Pouco depois,em 1998, ARNi foi documentada pela primeira vez em Caenorhabditis elegans como um meio de reduzir a expressão de genes num modelo animal pela introdução de anti-sentido ou ARN de cadeia dupla (ARNcd), através de injecção ou por métodos de alimentação 9,11. Desde a sua descoberta, RNAi revolucionou a busca da genómica funcional, permitindo que os pesquisadores utilizem genética reversa para investigar rapidamente os papéis funcionais de genes de interesse através de um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional altamente seletivo. Em alguns organismos, tais como Drosophila melanogaster, o uso de organismos transgénicos que expressam as construções de ARN interferentes tem sido largamente usado com sucesso para silenciamento de genes (KD). Embora o uso de transgenes em An. gambiae para RNAi tem sido utilizada e pode ser útil para telas de grande escala, a geração de linhagens de mosquitos transgênicos é ao mesmo tempo de trabalho e tempo intensivo, geralmente tendo dois a três meses para ir a partir da identificação de um gene de interesse para os geraçãna de um estoque transgénico apropriado 12. Actualmente, o principal método de KD gene num. gambiae é por injecção na hemolinfa, durante a fase adulta, de ARNdc específico para um dado gene 12,13. Esse processo geralmente leva cerca de um mês para ir desde a identificação de um gene de interesse para avaliação da KD gene, provando ser muito mais rápida do que os métodos transgênicos 12. Métodos para larval estágio RNAi foram estabelecidos recentemente em um. baseada em microalgas gambiae e Aedes aegypti por meio de nanopartículas alimentação 14-17 ou por entrega oral de dsRNA moléculas 18, oferecendo oportunidades para realizar análise genômica funcional durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Na injecção directa, a alimentação, e métodos de entrega de nanopartículas, o dsRNA é retomado por autonomamente na célula alvo e clivado pela enzima Dicer em 21-25 nucleótidos de comprimento &quot;curto ARN interferentes&quot; (ARNsi) 19,20. Estes são, em seguida, siRNAs IncorporATED para o silenciamento complexo (RISC) induzido por ARN, a partir da qual um fio vai ser descartado, permitindo que o complexo ligado RISC-RNA para se ligar e clivar o ARNm alvo e, assim, reduzir o seu nível e inibir a sua tradução 19,20. Muitas características intrínsecas da biologia básica mosquito modular a capacidade vetorial, incluindo preferências de acolhimento (por exemplo, olfato, gustação), acasalamento, reprodução e imunidade. Dada a importância destes processos biológicos, é provável que a sua modulação em um nível genético ou farmacológica vai oferecer novas oportunidades para o controle de vetores, incluindo a evasão de resistência a inseticidas, e fornecer novas ferramentas para abordagens mais amplamente integrados para controle de vetores. O uso de genômica funcional para avaliar os papéis de genes subjacentes a estas características biológicas intrínsecas vai permitir a identificação de novos alvos e fornecer novos insights sobre como podemos efetivamente criar novos strateg controle, mais eficazs. Nós descrevemos o desenvolvimento ea utilização de um método de injeção rápida para iniciar RNAi durante a fase de pupa de An. gambiae. Observamos que a injeção fase de pupa de um gatilho RNAi permite a observação de fenótipos resultantes em adultos em fase inicial, ou seja, mais cedo após a emergência do que seria observado caso gene knockdown foram iniciadas em adultos pós-emergência. Este métodos permite gene knockdown começando durante o intervalo de desenvolvimento de pupa e estendendo-se em estágios adultos, tais tipos de células que silenciamento de genes iniciado durante o desenvolvimento das pupas podem persistir e afetar início de adultos hemolinfa acessível, bem como tipos de células que são mais hemolinfa acessível durante a metamorfose do que no adulto, tais como neurónios sensoriais encontrados em apêndices adultos após a emergência.

<table><tbody><tr><td>Kit MEGAscript RNAi</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Injetor Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Pedal Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta de vidro</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>Pode substituir por um corante alimentar não tóxico.</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico</td><td>Thermo Scientific</td><td>1371150</td><td>&frac14; polegadas cortadas da ponta para criar uma abertura mais ampla.</td></tr><tr><td>O que homem " fino" papel de filtro&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>Este é um Grau 1 de 9 cm de diâmetro, mas pode ser alterado dependendo do tamanho da almofada de injeção.</td></tr><tr><td>Western blot " de espessura" papel de filtro</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>Este é o papel de filtro geralmente usado para Western blots.</td></tr><tr><td>Placas de Petri (60 mm x 15 mm)</td><td>Pincel Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>(tamanho 0)</td><td>Michael' O</td><td></td><td>tamanho e a marca do pincel Art 10474940 podem variar de acordo com a disponibilidade e a preferência do usuário.</td></tr><tr><td>Microscópio óptico de dissecação</td><td>&nbsp;----&nbsp;</td><td>-----</td><td>Isso pode variar de acordo com a disponibilidade e a preferência do usuário.</td></tr></tbody></table>

rnai gatilho para o interior<em&gt; anopheles gambiae</em&gt; as pupas

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

A interferência de RNA (RNAi), um fenômeno que ocorre naturalmente em organismos eucarióticos, é uma ferramenta extremamente valiosa que pode ser utilizada em laboratório para estudos genômicos funcionais. A capacidade de derrubar genes individuais seletivamente por meio dessa técnica de genética reversa permitiu que muitos pesquisadores descobrissem rapidamente os papéis biológicos de vários genes em muitos organismos, por meio da avaliação de fenótipos de perda de função. No principal vetor humano da malária, Anopheles gambiae, o método predominante usado para reduzir a função dos genes-alvo envolve a injeção de fita dupla (dsRNA) na hemocele do mosquito adulto. Embora esse método tenha sido bem-sucedido, o knockdown de genes em adultos exclui a avaliação funcional de genes que são expressos e potencialmente desempenham papéis durante os estágios pré-adultos, bem como genes que são expressos em um número limitado de células em mosquitos adultos. Descrevemos um método para a injeção de dsRNA do Inibidor de Serina Protease 2 (SRPN2) durante o estágio inicial de pupa e validamos o knockdown da proteína SRPN2 observando a diminuição dos níveis de proteína-alvo e a formação de pseudo-tumores melanóticos em mosquitos adultos knockdown de SRPN2. Este fenótipo evidente foi descrito anteriormente para o knockdown do estágio adulto da função SRPN2, e recapitulamos esse fenótipo adulto pelo knockdown de SRPN2 iniciado durante o desenvolvimento da pupa. Quando usada em conjunto com uma solução de dsRNA marcada com corante, essa técnica permite fácil visualização por microscopia de luz simples da qualidade da injeção e distribuição de dsRNA na hemocele.

Injeção de pupa para os rendimentos KD gene óptimos resultados quando a injecção é realizada durante a fase de pupa precoce, quando os níveis de bronzeamento cutícula são baixos (Figura 1A, à esquerda, e 1B). Aumento de bronzeamento e endurecimento de cutícula, geralmente após 24 horas, resulta no aumento da morte de pupa após a injecção (Figura 1A, central e direito). A taxa de desenvolvimento de pupa pode variar dependendo das condições insetário e densidade de animais 24,25; Portanto, é melhor para avaliar visualmente a pigmentação. Durante o processo de injecção, a agulha capilar é inserido na cutícula dorsal com um ângulo de aproximadamente 30 ° na direcção anterior para posterior (Figura 2A). Uma vez que a agulha é inserida e o ARNcd + 0,01% (w / v) de FGD é distribuído, a distribuição de corante é evidente através da hemolinfa (Figure 2B). Avaliação de emergência dos adultos para pupas injectados com 0,01% (w / v) de DGC revelou uma taxa média de 70% de emergência, em comparação com 96,7% de emergência de controlos não injectados (Figura 3A). É de notar que foi observada a emergência parcial a partir do caso de pupa para um grande número de mosquitos não sobreviventes (Figura 3B). Animais injectados não apresentam atrasos no tempo de emergência (Figura 4A) ou impacto tendenciosa em ambos os sexos (Figura 4B). Avaliação adicional de sobrevivência de pacientes adultos realizadas até ao dia 10 pós-emergência revela nenhum impacto evidente no pós-emergência sobrevivência de pacientes adultos (Figura 4C). Validação de qualidade KD foi avaliada pelo fenótipo pseudo-tumoral melanótico (aglomerado de tecido pigmentadas) associado com SRPN2 21,22 knockdown como um controlo positivo para o knockdown e<html> ausência de fenótipos associados com injecção dsLacZ como um controlo negativo. mosquitos adultos que surgiram foram marcados no dia 8 após a injecção (dia 6-7 pós-emergência). Pseudo-melanotic tumores (Figura 5A e 5B) foram observadas através da cutícula de 93,5% do dsSRPN2 vs. 0% dos mosquitos adultos dsLacZ (Figura 6A). Clusters de tecido escuro melanizados foram identificados após a dissecação de manchas pigmentadas (Figura 5C). Pseudo-tumores eram visíveis sobre a cutícula adulto tão cedo como o dia 3 pós-emergência e também estavam presentes em um subconjunto de dsSRPN2 hemolinfa e tecidos do intestino (dados não mostrados). Em 5 de pós-injecção (fase adulta), diminuiu de forma significativa em níveis SRPN2 dsSRPN2, mas não foi observada dsLacZ ou isolados de proteína não-injectado hemolinfa (Figura 6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: preparo do Desenvolvimento para a injeção de pupa dsRNA injeção de pupa precoce de dsRNA resulta em sobrevivência e progressão ideal para a fase adulta.. Os baixos níveis de pigmentação cutícula (A, à esquerda, e B) pode ser observada na primeira 0-24 h pupation seguinte. Tanning da cutícula anterior injeção de pupa (A, central e direito) resultados de moderada a sobrevida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Figura 2:. Posição de injecção e a distribuição de injecção de ARNcd de agulha (A) Capilar marcadas com corante de ARNcd marcado com corante na cutícula dorsal em um ângulo de aproximadamente 30 °, na direcção anterior para posterior. (B) O corante é distribuída visivelmente na hemolinfa de pupas. O volume da injecção de ARNcd de 138 nl, marcado com 0,01% FGD (w / v). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Figura 3:. Pós-injecção adulto emergência (a) 70% de pupas injectados com 0,01% FGD (w / v) surgiram com sucesso (n = 60), em comparação com 96,7% dos controlos não injectados (n = 60). Foram realizadas três réplicas biológicas. Observou-se (B) a emergência parcial a partir do caso de pupa para um grande número de mosquitos não sobreviventes. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Figura 4: velocidade de emergência, a avaliação sexo e adulto sobrevivência (A) foram observados tempos de despertar comparáveis ​​após a injecção de pupa com 0,01% FGD (24 HR = 80% e 48 HR = 20%), em comparação com pupas não injectada (24. HR = 83% e 48 HR = 17%). (B </strong&gt;) aproximadamente igual masculino e feminino adulto emergência foi observada para 0,01% FGD pupas injectado (feminino = 48% e masculino = 52%) e pupas não injectada (feminino = 52% e masculino = 48%). Análise (C) Survival revela que a injeção com 0,01% FGD não afeta a sobrevivência de adultos, avaliada até ao dia 10 pós-emergência. Os resultados representam dados de três experiências independentes com 0,01% FGD injectados (n = 60) e não injectada (n = 60) pupas (números iguais de machos e fêmeas). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Figura 5: Pseudo-tumor fenótipo controlo positivo reflete knockdown sucesso Pseudo-tumores foram observados no (A) abdominal e (B) cutícula torácica de dsSRPN2 -injected, mas não dsLacZ mosquitos adultos -injected no dia 8 após a injecção..(C) Maior ampliação (400X) de imagem (a) da cutícula e dissecção de manchas pigmentadas (b) revela aglomerados de células melanizadas escura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Figura 6: A quantificação da formação de pseudo-tumor e diminuiu os níveis de proteína SRPN2 (A) injecções fase de pupa resultar na formação de pseudo-tumor em 93,5% dos adultos dsSRPN2 (n = 21), comparativamente com 0% dos controles dsLacZ (n = 19). . Os resultados obtidos dia 8 após a injecção. (B) Western blot (esquerda) mostra diminuiu SRPN2 níveis em dsSRPN2, mas não dsLacZ ou isolados não injectados proteína hemolinfa (dia 5 pós-injecção). Resultados obtidos em três experiências independentes. Anti-SRPN2 21 e anti-26 SRPN3 diluições de anticorpos utilizados foram 1: 1.000 e 1: 2.000, respectivamente. Cabra anti-rabbit IgG-HRP (Produto sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) foi utilizado a 1: 5000. Todos os níveis de proteína foram quantificados (direita) pela intensidade da banda (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalizado para SRPN3 e comparados estatisticamente pelo teste t não pareado. P &lt;0,05: *, P ≥0.05: ns (não significativo). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM).

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

O objetivo geral deste método é a entrega de agentes desencadeadores de interferência de RNA em Anopheles gambiae para iniciar a silenciamento gênico que começa durante o estágio pupal do desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia de vetores e revelar genes que desempenham um papel durante os estágios de desenvolvimento pré-adulto ou inicial do adulto. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece aos pesquisadores a oportunidade de realizar estudos funcionais genômicos rápidos, iniciando o silenciamento gênico durante o intervalo de desenvolvimento, o estágio pupal, quando protocolos de injeção de interferência de RNA não haviam sido implementados anteriormente.A demonstração visual deste método é essencial porque os passos da injeção podem ser difíceis de dominar devido à precisão necessária e à natureza delicada das pupas durante esta fase de desenvolvimento. Após selecionar o gene de interesse, identifique uma região de 200 a 800 pares de bases que seja predita para não ter efeitos fora do alvo e realize a amplificação-pcr padrão para obter o molde para síntese de rna de dupla fita flanqueado por uma sequência de promotor T7. Em seguida, sintetize o rna de dupla fita e purifique os produtos utilizando um kit comercial in vitro.Ajuste a concentração final de RNA para três microgramas por microlitro. Em seguida, utilize um gel padrão de agarose a 2% para comparar meio microlitro do RNA de fita dupla com o DNA molde e marcadores padrão. Após a eletroforese, verifique a qualidade e o comprimento da banda de RNA de fita dupla.Não deve haver produtos não específicos visíveis. O RNA de fita dupla migrará mais lentamente do que o DNA molde. Para armazenamento, prepare alíquotas de RNA de fita dupla e mantenha-as a menos 20 graus Celsius.Inicie preparando o corante Fast Green FCF. Primeiro, dilua o corante a 0,1% volume por volume em água livre de RNase. Em seguida, transfira volumes de um microlitro da preparação para tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro.Aqueça os tubos carregados a 65 graus Celsius por cerca de três horas para evaporar a água. Em seguida, resfrie os tubos por pelo menos 30 minutos antes de usar os sólidos do corante. Depois, prepare agulhas de injeção de vidro puxado a partir de tubos de vidro borossilicato.Configure o puxador de agulhas para um diâmetro da ponta entre 10 e 30 mícrons. Para um puxador de capilares NARISHIGE, ajuste o primeiro aquecedor para 100 e o segundo aquecedor para 70. Em seguida, fixe a agulha capilar e prossiga com a puxação.Agora, prepare a estação de injeção. Selecione uma plataforma que possa ser facilmente manobrada sob o microscópio. Sobre a plataforma, fixe com fita uma folha grossa de papel filtro.Em seguida, sobre o papel-filtro grosso, fixe um papel-filtro fino com fita adesiva. Depois, nos tubos sólidos de corante, adicione 10 microlitros de cada RNA de fita dupla a ser injetado e re-suspenda o corante. Armazene esses tubos no gelo.Agora, colete as pupas a serem injetadas. Encha uma placa de Petri de 60 milímetros com 10 mililitros de água deionizada e transfira cerca de 50 pupas de cor clara para a placa, utilizando uma pipeta plástica de transferência. Utilize apenas pupas levemente pigmentadas, pois aquelas que já atingiram níveis médios a escuros de tanização sofrerão danos ao cutículo e terão baixas taxas de sobrevivência.O primeiro passo para a microinjeção é abrir a agulha. Sob o microscópio, quebre a ponta mais distal da agulha utilizando pinças finas. Em seguida, preencha a agulha com óleo mineral usando uma agulha de calibre 30 e uma seringa.Uma vez preenchida, expulse o excesso de óleo usando o microinjetor. Configure o microinjetor para puxar volumes de 69 nanolitros. Em seguida, preencha a agulha pela frente com o RNA de injeção preparado.Teste a dispensação de RNA de fita dupla quanto a problemas. A obstrução na ponta e agulhas inadequadamente fixadas são as principais causas de problemas. Uma vez que o injetor esteja preparado, escolha uma a três pupas e transfira-as para a fase de papel filtro.Usando um pincel, posicione a pupa de modo que a cutícula dorsal fique acessível. Ao pressionar o papel, a água em excesso nas pupas será absorvida. Enquanto mantém a pupa imóvel com um pincel úmido, use um movimento de anterior para posterior para inserir a agulha na sua cutícula dorsal entre o abdômen e o tórax, em um ângulo aproximado de 30 graus.Em seguida, injete um a dois pulsos de RNA de fita dupla no hemolinfa. A dispersão do corante por todo o corpo deve ser visível se a injeção for bem-sucedida. Durante a injeção na pupa, é fundamental que a agulha perfure apenas a cutícula dorsal.Se a punção com a agulha atravessar a cutícula ventral, será evidente o acúmulo de líquido marcado com corante na parte externa da pupa, ou o corante será transferido para o papel de filtro. Nesses casos, a pupa deve ser descartada. Se o corante não se distribuir por todo o hemolinfa, a ponta provavelmente está obstruída.Mova levemente a ponta e determine se houve liberação de RNA e corante. Se não houver indicação de liberação do corante, descarte a pupa. Em seguida, avalie a ponta da agulha e realize outra injeção em uma nova pupa.Após injetar com sucesso uma pupa, use o pincel úmido para liberá-la suavemente da agulha e mova-a para o recipiente com água, onde completará o desenvolvimento. Coloque o recipiente com as pupas injetadas em uma gaiola ou recipiente para mosquitos sob condições normais de criação. Como fonte alimentar para os adultos, forneça uma solução de glicose a 10% peso por volume absorvida em uma bola de algodão.Após os adultos emergirem, compare-os com os controles. Por exemplo, insetos com SRPN2 de fita dupla devem ser avaliados diariamente quanto à formação de pseudotumores. Para isso, resfrie os adultos por dois a três minutos a menos 20 graus Celsius e transfira-os para uma placa fria a dois graus Celsius para observação.Após observar os adultos, devolva-os à área de criação no insetário. Uma vez dominada a técnica, as pupas injetadas emergiram com uma frequência de cerca de 70%. Em um subconjunto das pupas injetadas, ocorreu emergência parcial do casulo pupal, resultando em mosquitos inviáveis. Não houve atraso nas taxas de emergência entre mosquitos injetados e não injetados, e os efeitos da injeção não variaram conforme o sexo.Dez dias após a emergência, não houve alteração significativa na sobrevivência dos mosquitos injetados em comparação com os controles não injetados. O inibidor de serina protease, SRPN2, foi utilizado como controle positivo, e o LacZ de dupla fita foi usado como controle negativo para as injeções de RNA de dupla fita. A partir de três dias após a emergência, pseudotumores nos adultos injetados com SRPN2 de dupla fita eram evidentes por meio de microscopia de luz.Após oito dias, os pseudotumores eram muito proeminentes. Em mosquitos na fase adulta, pseudotumores melanóticos eram observáveis através da cutícula da maioria dos animais injetados com SRPN2 de fita dupla, enquanto nenhum pseudotumor era observável nos controles. Cinco dias após a injeção, os níveis da proteína SRPN2 eram significativamente mais baixos em mosquitos injetados com SRPN2 de fita dupla, em comparação com os controles injetados com LacZ de fita dupla e os controles não injetados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a entrega de um agente desencadeador de interferência de RNA em pupas de Anopheles gambiae, utilizando este protocolo de injeção recentemente desenvolvido. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido ao movimento imprevisível da pupa. No entanto, praticar o posicionamento e a estabilização corretos da pupa aumenta significativamente a taxa de injeções bem-sucedidas, bem como a qualidade da injeção.Uma vez dominada a técnica, essas injeções requerem aproximadamente 30 segundos por pupa. Com o desenvolvimento desta técnica, abrimos caminho para pesquisadores na área de biologia de vetores explorarem e avaliarem a função gênica durante as fases de desenvolvimento pré-adultas e iniciais do estágio adulto no vetor da malária Anopheles gambiae. Após este procedimento, outros métodos, como análise por Western blot ou PCR quantitativa, podem ser realizados para determinar o grau de silenciamento do gene-alvo ao nível da expressão proteica ou de transcritos, respectivamente.Em última análise, esta técnica pode ajudar a identificar genes que são essenciais para a transmissão do parasita por mosquitos, e essa abordagem nos ajudará a identificar novos alvos e fornecer novas perspectivas sobre como podemos criar estratégias mais eficazes de controle de vetores.

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Neste vídeo, demonstramos a integração de transgenes específicos do local mediada por phiC31 no embrião de Anopheles por meio de microinjeção. Este método ajuda a introduzir os genes desejados em um sistema hospedeiro para pesquisa e aplicações industriais.

phiC31-Integração de transgene dirigida ao local mediada por integrase: uma técnica de microinjeção para integração de transgene específico do local em um vetor de Anopheles

Neste vídeo, demonstramos a entrega da construção do gene drive no embrião do mosquito Anopheles gambiae por meio da técnica de microinjeção de embriões. Este procedimento permite a integração da construção de DNA entregue, por meio de recombinação homóloga, nas células germinativas para gerar uma população de mosquitos transformada.

Microinjeção de embrião de mosquito: uma técnica para entregar DNA exógeno na gema embrionária de Anopheles gambiae para gerar mutações germinativas

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

O protocolo descreve como alcançar modificações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos anofelinos da malária usando o sistema φC31 . As modificações descritas incluem tanto a integração quanto a troca de fitas transgênicas no genoma das linhas de acoplamento de rolamento attP.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Técnicas de microinjeção são essenciais para introduzir genes exógenos nos genomas dos mosquitos. Este protocolo explica um método usado pelo laboratório James para microinjetar construções de DNA em embriões Anopheles gambiae para gerar mosquitos transformados.

Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae

A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

Aprenda a entregar gatilhos de RNAi em pupas de Anopheles gambiae para estudos de biologia de vetores. Este método permite o silenciamento gênico durante estágios pré-adultos, abrindo novas possibilidades para pesquisas funcionais em mosquitos vetores da malária.

RNAi gatilho para o interior

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