RNAi gatilho para o interior

O objetivo geral deste método é a entrega de agentes desencadeadores de interferência de RNA em Anopheles gambiae para iniciar a silenciamento gênico que começa durante o estágio pupal do desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia de vetores e revelar genes que desempenham um papel durante os estágios de desenvolvimento pré-adulto ou inicial do adulto. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece aos pesquisadores a oportunidade de realizar estudos funcionais genômicos rápidos, iniciando o silenciamento gênico durante o intervalo de desenvolvimento, o estágio pupal, quando protocolos de injeção de interferência de RNA não haviam sido implementados anteriormente.

A demonstração visual deste método é essencial porque os passos da injeção podem ser difíceis de dominar devido à precisão necessária e à natureza delicada das pupas durante esta fase de desenvolvimento. Após selecionar o gene de interesse, identifique uma região de 200 a 800 pares de bases que seja predita para não ter efeitos fora do alvo e realize a amplificação-pcr padrão para obter o molde para síntese de rna de dupla fita flanqueado por uma sequência de promotor T7. Em seguida, sintetize o rna de dupla fita e purifique os produtos utilizando um kit comercial in vitro.

Ajuste a concentração final de RNA para três microgramas por microlitro. Em seguida, utilize um gel padrão de agarose a 2% para comparar meio microlitro do RNA de fita dupla com o DNA molde e marcadores padrão. Após a eletroforese, verifique a qualidade e o comprimento da banda de RNA de fita dupla.

Não deve haver produtos não específicos visíveis. O RNA de fita dupla migrará mais lentamente do que o DNA molde. Para armazenamento, prepare alíquotas de RNA de fita dupla e mantenha-as a menos 20 graus Celsius.

Inicie preparando o corante Fast Green FCF. Primeiro, dilua o corante a 0,1% volume por volume em água livre de RNase. Em seguida, transfira volumes de um microlitro da preparação para tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Aqueça os tubos carregados a 65 graus Celsius por cerca de três horas para evaporar a água. Em seguida, resfrie os tubos por pelo menos 30 minutos antes de usar os sólidos do corante. Depois, prepare agulhas de injeção de vidro puxado a partir de tubos de vidro borossilicato.

Configure o puxador de agulhas para um diâmetro da ponta entre 10 e 30 mícrons. Para um puxador de capilares NARISHIGE, ajuste o primeiro aquecedor para 100 e o segundo aquecedor para 70. Em seguida, fixe a agulha capilar e prossiga com a puxação.

Agora, prepare a estação de injeção. Selecione uma plataforma que possa ser facilmente manobrada sob o microscópio. Sobre a plataforma, fixe com fita uma folha grossa de papel filtro.

Em seguida, sobre o papel-filtro grosso, fixe um papel-filtro fino com fita adesiva. Depois, nos tubos sólidos de corante, adicione 10 microlitros de cada RNA de fita dupla a ser injetado e re-suspenda o corante. Armazene esses tubos no gelo.

Agora, colete as pupas a serem injetadas. Encha uma placa de Petri de 60 milímetros com 10 mililitros de água deionizada e transfira cerca de 50 pupas de cor clara para a placa, utilizando uma pipeta plástica de transferência. Utilize apenas pupas levemente pigmentadas, pois aquelas que já atingiram níveis médios a escuros de tanização sofrerão danos ao cutículo e terão baixas taxas de sobrevivência.

O primeiro passo para a microinjeção é abrir a agulha. Sob o microscópio, quebre a ponta mais distal da agulha utilizando pinças finas. Em seguida, preencha a agulha com óleo mineral usando uma agulha de calibre 30 e uma seringa.

Uma vez preenchida, expulse o excesso de óleo usando o microinjetor. Configure o microinjetor para puxar volumes de 69 nanolitros. Em seguida, preencha a agulha pela frente com o RNA de injeção preparado.

Teste a dispensação de RNA de fita dupla quanto a problemas. A obstrução na ponta e agulhas inadequadamente fixadas são as principais causas de problemas. Uma vez que o injetor esteja preparado, escolha uma a três pupas e transfira-as para a fase de papel filtro.

Usando um pincel, posicione a pupa de modo que a cutícula dorsal fique acessível. Ao pressionar o papel, a água em excesso nas pupas será absorvida. Enquanto mantém a pupa imóvel com um pincel úmido, use um movimento de anterior para posterior para inserir a agulha na sua cutícula dorsal entre o abdômen e o tórax, em um ângulo aproximado de 30 graus.

Em seguida, injete um a dois pulsos de RNA de fita dupla no hemolinfa. A dispersão do corante por todo o corpo deve ser visível se a injeção for bem-sucedida. Durante a injeção na pupa, é fundamental que a agulha perfure apenas a cutícula dorsal.

Se a punção com a agulha atravessar a cutícula ventral, será evidente o acúmulo de líquido marcado com corante na parte externa da pupa, ou o corante será transferido para o papel de filtro. Nesses casos, a pupa deve ser descartada. Se o corante não se distribuir por todo o hemolinfa, a ponta provavelmente está obstruída.

Mova levemente a ponta e determine se houve liberação de RNA e corante. Se não houver indicação de liberação do corante, descarte a pupa. Em seguida, avalie a ponta da agulha e realize outra injeção em uma nova pupa.

Após injetar com sucesso uma pupa, use o pincel úmido para liberá-la suavemente da agulha e mova-a para o recipiente com água, onde completará o desenvolvimento. Coloque o recipiente com as pupas injetadas em uma gaiola ou recipiente para mosquitos sob condições normais de criação. Como fonte alimentar para os adultos, forneça uma solução de glicose a 10% peso por volume absorvida em uma bola de algodão.

Após os adultos emergirem, compare-os com os controles. Por exemplo, insetos com SRPN2 de fita dupla devem ser avaliados diariamente quanto à formação de pseudotumores. Para isso, resfrie os adultos por dois a três minutos a menos 20 graus Celsius e transfira-os para uma placa fria a dois graus Celsius para observação.

Após observar os adultos, devolva-os à área de criação no insetário. Uma vez dominada a técnica, as pupas injetadas emergiram com uma frequência de cerca de 70%. Em um subconjunto das pupas injetadas, ocorreu emergência parcial do casulo pupal, resultando em mosquitos inviáveis. Não houve atraso nas taxas de emergência entre mosquitos injetados e não injetados, e os efeitos da injeção não variaram conforme o sexo.

Dez dias após a emergência, não houve alteração significativa na sobrevivência dos mosquitos injetados em comparação com os controles não injetados. O inibidor de serina protease, SRPN2, foi utilizado como controle positivo, e o LacZ de dupla fita foi usado como controle negativo para as injeções de RNA de dupla fita. A partir de três dias após a emergência, pseudotumores nos adultos injetados com SRPN2 de dupla fita eram evidentes por meio de microscopia de luz.

Após oito dias, os pseudotumores eram muito proeminentes. Em mosquitos na fase adulta, pseudotumores melanóticos eram observáveis através da cutícula da maioria dos animais injetados com SRPN2 de fita dupla, enquanto nenhum pseudotumor era observável nos controles. Cinco dias após a injeção, os níveis da proteína SRPN2 eram significativamente mais baixos em mosquitos injetados com SRPN2 de fita dupla, em comparação com os controles injetados com LacZ de fita dupla e os controles não injetados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a entrega de um agente desencadeador de interferência de RNA em pupas de Anopheles gambiae, utilizando este protocolo de injeção recentemente desenvolvido. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido ao movimento imprevisível da pupa. No entanto, praticar o posicionamento e a estabilização corretos da pupa aumenta significativamente a taxa de injeções bem-sucedidas, bem como a qualidade da injeção.

Uma vez dominada a técnica, essas injeções requerem aproximadamente 30 segundos por pupa. Com o desenvolvimento desta técnica, abrimos caminho para pesquisadores na área de biologia de vetores explorarem e avaliarem a função gênica durante as fases de desenvolvimento pré-adultas e iniciais do estágio adulto no vetor da malária Anopheles gambiae. Após este procedimento, outros métodos, como análise por Western blot ou PCR quantitativa, podem ser realizados para determinar o grau de silenciamento do gene-alvo ao nível da expressão proteica ou de transcritos, respectivamente.

Em última análise, esta técnica pode ajudar a identificar genes que são essenciais para a transmissão do parasita por mosquitos, e essa abordagem nos ajudará a identificar novos alvos e fornecer novas perspectivas sobre como podemos criar estratégias mais eficazes de controle de vetores.