Name: Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda imagem ex vivo ao vivo de metástase pulmonar usando microscopia confocal de disco rotativo em camundongos. Esta técnica permite visualizar interações célula-tumor e estroma por pelo menos quatro horas.

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Agradecemos a Nguyen H. Nguyen por sua ajuda técnica e a Audrey O'Neill pelo suporte com o microscópio confocal de disco giratório Zeiss Cell Observer. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Departamento de Defesa (W81XWH-11-01-0139) e pelo Programa Nacional de Prêmio de Pós-Doutorado do Instituto Weizmann de Ciência para o Avanço das Mulheres na Ciência (para VP).

Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia por parte do Care local Institucional Animal e Comitê de Uso (IACUC). 1. Geração de metástases pulmonares por ex vivo Imagens ao vivo (Transgenic ou veia caudal Injection) NOTA: As metástases pulmonares pode ser gerado através da utilização de modelos de ratinho geneticamente modificadas ou por injecção intravenosa (iv) a injecção de células cancerosas. <ol><li> Gerar metástases pulmonares para a imagem latente do cruzamento de um modelo de rato tumor geneticamente modificado em um rato repórter transgênicos, por exemplo, atravessar o modelo do rato do cancro da mama, rato antígeno do vírus do tumor mamário terminal longa do meio repeat-polioma T (MMTV-PyMT) 11 em ACTB-ECFP modelo do rato 12. NOTA: O modelo ACTB-ECFP expressa reforçada ciano proteína fluorescente (ECFP) sob a β-actno promotor de modo a que todas as células fluoresce na, canal PCP azul. No entanto, as células cancerosas são, de longe, o mais proeminente e aparecem como uma massa de células eCFP-positiva sob o microscópio. O modelo de rato de MMTV-PyMT desenvolve uma doença progressiva, em que o crescimento do tumor mamário está associada com a difusão de células de cancro para a periferia, especialmente para os pulmões. Em ratinhos MMTV-PyMT no FVB / N fundo, micrometástases pode ser observada cerca de 10-11 semanas de idade. Geralmente, estes progressos para macrometástases em cerca de 14 semanas de idade de 13 anos. OU </li><li> Gerar metástases experimentais utilizando células primárias ou linhas de células singeneicas. Utilização em células de tumor primário in vitro manipulado ou linhas de células (por ex., Transdução), seguido por injecção IV 14. <ol><li> Resumidamente, neste protocolo, injetar uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing (+) linha de células MMTV-PyMT em ratos fluorescentes Repórter (ACTB-ECFP) ou ratinhos de tipo selvagem. Depois,visualizar essas células referidas como células VO-PyMT 15 usando o verde, canal de GFP. NOTA: A linha celular VO-PyMT original foi derivada no Vanderbilt Ortopedia em Nashville, TN. VO significa Vanderbilt Ortopedia. </li><li> A seguir à injecção de 10 6 células (em 200 uL), observar o extravasamento de células de cancro imediatamente e até algumas horas após a injecção; observar micrometástases entre 1-3 semanas após a injecção e detectar macrometástases 3 semanas após a injecção 15. NOTA: menor número de células pode ser injectado para prolongar o tempo de injecção para o crescimento metastático. </li></ol></li></ol> 2. Rotulagem de componentes de interesse na metastático Microenvironment (Transgenic e / ou injetáveis) NOTA: A rotulagem pode ser conseguida por murganhos transgénicos e / ou por vários injectáveis. Certifique-se usar diferentes cores fluorescentes para a rotulagem dos vários tipos de células. <ol><li> Os componentes Label do microambiente metastático utilizando camundongos transgênicos. Cruzar o modelo de tumor de rato anteriormente mencionado (por exemplo., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) em um modelo de rato transgénico, em que as células estromais de interesse são marcados por uma proteína fluorescente que não é ECFP, por exemplo., C-fms-EGFP 4,16. NOTA: Além de visualização de células cancerosas no canal PCP, este permite a visualização de células mielóides no canal de GFP 4. E / OU </li><li> Rotular vários componentes do microambiente metastático em ratinhos usando injectáveis ​​repórter fluorescente ou transgénicos (não fluorescentes) ratinhos de tipo selvagem. NOTA: Vários compostos podem ser injectados para marcar vários componentes do microambiente metastático, por exemplo, um anticorpo conjugado AF647-Gr-1 é aqui utilizada para rotular neutrófilos e alguns monócitos e 13 diferentes dextranos de peso molecular são usadospara rotular capilares pulmonares. Para a preparação desses injetáveis ​​consulte a etapa 4. </li></ol> 3. Preparação de Materiais Antes Dissecação <ol><li> 2% de agarose <ol><li> Pesar 0,2 g de agarose e adicionar 10 ml de 1 x PBS. Aquece-se a solução para dissolver a agarose. Agarose irá solidificar à TA, assim mantê-lo em um banho de água a 37 ° C até ser utilizado para a inflação. </li></ol></li><li> CO 2 e controlador de temperatura <ol><li> Verifique DDH 2 O na câmara de umidificação. Reabastecer quando necessário. Inserir a placa de configuração no suporte da placa de estágio de temperatura (câmara climática). Ligue o controlador de CO 2 e definir de CO 2 a 5%. Certifique-se a taxa de fluxo de ar é fixada em 0,4 Nl / min. </li><li> Abra o ar e o CO 2 válvulas. Ligue o controlador de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da câmara climática e a tampa são definidas a 37 ° C. </li><li> Liberar a pressão do ar no CO 2 metros. Entrada de CO 2 a aumentar, equilibration pode levar até 30 min. </li></ol></li><li> disco giratório microscópio confocal NOTA: Os detalhes do microscópio set-up foram previamente descritos 4,17. <ol><li> Ligue os lasers (o laser de argônio para 488 nm de excitação e de estado sólido 405 nm, 561 nm e 640 nm lasers). Ligue o microscópio, a câmera, a unidade de controle disco giratório, o AOTF, a unidade de controle do laser e o controlador da câmara. </li><li> Abra o obturador microscópio, ligue o computador a executar o microscópio e abrir o software. </li></ol></li><li> Preparação das ferramentas e plataforma de dissecção. <ol><li> Ligue o esterilizador talão quente e deixá-la atingir 250 ° C. Limpos 2 pares de tesouras cirúrgicas e pinças com água e sabão. Esterilizar as ferramentas durante pelo menos 30 seg. Deixe as ferramentas refrescar. Utilize uma tampa de poliestireno como plataforma de dissecção. Cubra-o com um pedaço de imersão laboratório. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de injecções NOTA: Dependendo da meia-vida ea resposta preferida, injetar fluorescente etiquetado anticorpos e / ou moléculas fluorescentes ou imediatamente antes do sacrifício animal ou um par de horas a dias antes. <ol><li> Para neutrófilos imagem Gr1-positivos e monócitos, preparar uma seringa com 7 ul de anticorpo conjugado com AF647-Gr-1 da (1 mg / ml) em 100 ul de PBS estéril sob o capô. Coloque um G ½ agulha 27 na seringa. </li><li> Para capilares pulmonares imagem, preparar uma segunda e terceira seringa com 100 ul de quer 70 kD rodamina conjugada com dextrano (4 mg / ml) ou dextrano 10 kD AF647-conjugado (4 mg / ml). Coloque um G ½ agulha 27 nas seringas. </li><li> Injectar a AF647 conjugado com solução de anticorpo iv 5 horas antes da excisão &#39;pulmões. </li><li> Injectar uma ou ambas as soluções de dextrano iv imediatamente anteriores à excisão &#39;pulmões. </li></ol> 5. Preparação de Pulmões por ex vivo Imagens ao vivo NOTA: Tente trabalhar como estéril e cuidadosa quanto possível para evitar a desnecessária desafios de células imunes dentro dos pulmões. <ol><li> Injectar o rato por via intraperitoneal (ip) com uma sobredosagem letal de um anestésico permitida pelo protocolo animais aprovados pelo IACUC, por exemplo., 1 ml de Avertin 2,5%. Aguarde até que o mouse para parar de respirar e ser completamente não-responsivos a estímulos nocivos (pata traseira pitada). NOTA: deslocamento cervical e os eutanásia dióxido de carbono deve ser evitado, pois pode afectar negativamente a viabilidade das células do pulmão. </li><li> Imobilizar o rato em uma placa de dissecção e esterilizar o mouse com 70% de etanol. </li><li> Use tesouras cirúrgicas primeiro fazer uma incisão epigástrica transversal através da pele, seguido por uma incisão semelhante através do peritoneu. Segure a placa de dissecção na posição vertical e cortou a aorta descendente, de modo que as piscinas de sangue para baixo no abdômen e não na cavidade torácica. </li><li> Sbeliscar uma pequena abertura no diafragma para libertar vácuo. Corte ao longo da nervura 10 e 12 para excisar o diafragma e tenha acesso visual para os pulmões. </li><li> Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele até à traqueia através da caixa torácica, mas deixar a caixa torácica intacta. Separar a pele da caixa torácica. Expor a traqueia através da remoção do tecido conjuntivo circundante, tomando cuidado para não danificar o próprio (Figura 1A) traqueia. </li><li> Cortar uma pequena abertura aproximadamente 1 mm de diâmetro na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos, tão perto quanto possível da laringe (Figura 1B). Tenha cuidado para não cortar completamente através da traquéia. </li><li> Dê uma agulha G 20 e gentilmente inserir a agulha 4-5 mm na traqueia, sem qualquer força contrária (Figura 1D). A extremidade da agulha deverá ser visível através da traqueia (Figura 1C). Use uma pinça para estabilizar a agulha na traqueia. Alternativamente, um fio de sutura pode ser amarrado Around a traqueia para manter a agulha no lugar. NOTA: Através da inserção muito profunda, a carena pode ser traumatizada ou apenas um lado dos pulmões pode ser insuflado. </li><li> Encher uma seringa com 400 ul de 37 ° C de agarose de ponto de fusão de baixa temperatura a 2% (feita directamente a partir de um banho de temperatura constante). Verifique se a placa de dissecção está de pé e, lentamente, incutir a agarose quente através da agulha para os pulmões, usar ~ 400 ul para inflar os pulmões. NOTA: Assista os pulmões inflar dentro da caixa torácica. Não excesso de inflar o pulmão como ele irá se romper. </li><li> Uma vez que os pulmões são inflados, enchendo ~ ⅔ da caixa torácica, retire a seringa e manter a agulha no interior da traqueia para evitar qualquer agarose vazem. </li><li> Pour aproximadamente 50 ml de PBS 20 ° C ao longo dos pulmões inflados para permitir que a agarose dentro dos pulmões para definir e solidificar. retirar a agulha devagar e fechar a traqueia com uma pinça para evitar qualquer não-solidificou agarose vazem. &lt;/ Li&gt; <li> Expor os pulmões através da realização de uma esternotomia e subsequentemente excisar os pulmões. Para a excisão dos pulmões, segurar a traqueia, enquanto cortando a traqueia completamente. Puxe cuidadosamente a traqueia para cima, cortar o tecido conjuntivo e do esôfago enquanto puxa os pulmões para fora da cavidade torácica, até os pulmões é separado do rato (Figura 1E). </li><li> Mergulhe os pulmões em warm RPMI-1640 para lavar excessiva de sangue e delicadamente separar os lóbulos usando tesouras e pinças para cortar brônquio principal dos lobos na hilo (Figura 1F). </li><li> Colocar os lóbulos, com a superfície plana virada para baixo para maximizar a superfície de imagem, em um poço de uma placa de imagem de 24 poços (Figura 1G). Adicionar 100 ul de 37 ° C, meio RPMI-1640 por cima dos lóbulos. Coloque várias 15 mm tampa desliza microscópio circular em cima dos lóbulos para evitar que ele flutua. </li><li> Despeje quente PBS nos poços ao redor para evitar a mídia RPMI-1640 de evaporating. Inserir a placa de 24 poços na câmara climatizada equilibrada e manter os lobos pulmonares a 37 ° C com ar e 5% de CO 2. Inserir a câmara climatizada na fase do microscópio confocal. NOTA: Outras misturas de gases (por exemplo, 5% de O2, 5% de CO 2 em N 2 para examinar o comportamento das células sob condições de hipoxia / oxigénio inferior) também poderia ser considerado. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53741/53741fig1.jpg" /> Figura 1. Protocolo para a preparação dos pulmões para geração de imagens ao vivo. (A) A exposição da traquéia após a preparação do mouse. (B) pinas pequena feita na traqueia exposta paralela aos anéis cartilagíneos. (C) 20 G agulha inserida 4-5 mm na traqueia. (D) A instilação de 400 ul de 2% de baixo ponto de fusão à temperatura de agarose para os pulmões. (E) Inflpulmões ated separado do mouse. (F) Lobes separados após a inflação. (G) lóbulos colocado em um poço de uma placa de imagem de 24 poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53741/53741fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 6. Aquisição e Análise de Imagens NOTA: As imagens podem ser adquiridas com uma variedade de fiação de disco microscópios confocal apoiados por vários programas de software. Neste protocolo, quer μManager com um giro de disco microscópio confocal feito por encomenda ou Zen com um disco giratório microscópio confocal comercialmente disponível é utilizada para a aquisição de imagem, enquanto Imaris é usado para edição de filmes e análise. <ol><li> Adquirir imagens usando μManager. Um detalhado passo a passo protocolo para a aquisição de imagens usando software μManager é descrito anteriormente 18. OU </li><li> adquirir imagensusando a imagem de software de análise, tais como Zen (ver figura S1). <ol><li> Clique na guia &#39;Localizar&#39;, e escolha objetiva (10x ou 20x) no &quot;Caminho de Luz&quot; ferramenta (Figura S1A, caixa vermelha). Posteriormente, clique em &#39;Eyes - DAPI&#39; olhar para o canal PCP através da ocular (Figura S1A, caixa azul). Localize a amostra manualmente usando o microscópio. Clique em &#39;All Off&#39;after o tecido é o centro do campo de visão. </li><li> Clique na guia &quot;Aquisição&quot; para definir todos os parâmetros para aquisição de imagem. </li><li> Na ferramenta &quot;canais&quot;, clique no botão &#39;+&#39; (Figura S1B, caixa vermelha). Um menu pop-up aparece e procurar o corante (s) presente na amostra no &#39;Dye banco de dados&#39; (Figura S1B). Selecione o corante e clique em &quot;Adicionar&quot;. NOTA: O programa irá definir todos os filtros de ser otimizado. Um corante pode ser suprimidoselecionando-o seguido, clicando no botão da lixeira (Figura S1B, caixa amarela). </li><li> No menu &quot;Modo de Aquisição&quot;, set &#39;Binning&#39; para 5x5. Clique duas vezes no ECFP no menu de canais para a seleccionar. Diminuir a potência do laser para 20% assim que a amostra não será branqueada ao configurar os parâmetros para aquisição de imagem. </li><li> Marque a caixa &quot;Azulejo &#39;na seção&#39; Experiment Manager &#39;e a ferramenta de telhas aparece no grupo de ferramentas&quot; Multidimensional Aquisição &quot;(Figura S1C). Clique no botão &#39;Configuração Avançada&#39; para ver a imagem ao vivo da câmera. Clique no botão &quot;Adicionar&quot; na seção &quot;Posições&quot; para adicionar 4 a 6 posições para o experimento. Para excluir uma posição, selecione a posição e clique no botão de lixeira. </li><li> No grupo de ferramenta &quot;Aquisição Parâmetro &#39;, abra a ferramenta&#39; estratégia de foco &#39;, e selecione&#39; Absolute fixa Z-position &#39;na lista suspensa. </li><li> Marque a caixa Z-Stack na seção &#39;Experiment Manager&#39; ea ferramenta Z-Stack aparece no grupo de ferramentas a «Aquisição Multidimensional &#39;(Figura S1D). Clique duas vezes em uma das posições na secção &quot;Posições&quot; e pressione &#39;Live&#39;. definir manualmente primeiro e definir última posição do campo de imagem. Defina o intervalo para 4 mm. NOTA: O programa irá determinar o número de fatias para a gama escolhida e do intervalo. Idealmente, 5-7 fatias são convenientes para permitir a visualização suficiente e aquisição de imagem rápida. </li><li> Marque a caixa &quot;Série Time &#39;na seção&#39; Experiment Manager &#39;. Set desejado &#39;Duração&#39; e os tempos de &quot;intervalo&quot; na ferramenta &#39;Time Series &quot;, que apareceu no grupo de ferramentas&#39; Multidimensional Aquisição&quot; (Figura S1E). </li><li> No &#39;AcquisiModo ção &#39;de menu, defina &quot;Binning&#39; para 2x2. Dê um clique duplo em um fluoróforo no menu de canais para selecioná-lo e aumentar a potência do laser a 100%. Pressione &#39;Live&#39; e ajuste o &#39;Tempo de Exposição &quot;. Repita esse procedimento para cada fluoróforo. </li><li> Marque a caixa &quot;Ativar Auto Save&quot;. Selecione uma pasta e digite o nome do arquivo. Todas as imagens adquiridas serão salvas automaticamente nesta pasta. </li><li> Clique em &#39;Start Experiment&#39; na seção &#39;Experiment Manager&#39; para começar a aquisição de imagem. </li></ol></li><li> Após a aquisição da imagem, compilar os dados brutos em software Imaris. Converter imagens para .IMS arquivos e ajustes podem ser feitos. Um detalhado passo a passo protocolo para a conversão de arquivos, fazendo ajustes e filmes salvar usando Imaris é descrito anteriormente 18. </li><li> Ao salvar o filme, defina o &quot;Frame Rate&quot; 5 quadros por segundo (fps). </li></ol>

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<li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ex+vivo+lung+perfusion+as+a+platform+for+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research.</a> World J Exp Med. 4 (2), (2014).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).</li>
<li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28 (2), (2000).</li>
<li>Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+cells+and+immune+modulation+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer.</a> Immunotherapy. 4 (3), (2012).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).</li>
<li>Kreisel, D., Nava, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC, UCSF.

Este manuscrito descreve um método detalhado para ex vivo imagens ao vivo da metástase pulmonar em modelos de ratos com metástases. Este protocolo de imagem fornece uma visualização direta das interações tumor de células-estroma dinâmicas e espaciais dentro do microambiente do pulmão. É um método relativamente fácil e rápido que permite imagens de confiança de metástases do pulmão durante pelo menos 4 h. Filmes adquiridos a partir destas experiências pode ser utilizada para controlar processos dinâmicos como a ...

O aspecto mais mortal do câncer é a metástase, que é responsável por mais de 90% da morbidade e mortalidade relacionadas ao câncer1. A metástase é um processo de várias etapas e, devido à sua complexidade, os mecanismos celulares e moleculares exatos que governam a disseminação e o crescimento metastático ainda são indefinidos. Para metastatizar, as células tumorais no tumor primário devem se desprender de suas células vizinhas e da membrana basal, atravessar a matriz extracelular, intravasar, viajar através de vasos sanguíneos ou linfáticos, extravasar no local secundário e, finalmente, sobreviver e estabelecer tumores secundários. Além das propriedades das células tumorais, a contribuição do microambiente, que inclui o estroma adjacente junto com as contrapartes normais das células cancerígenas, é crucial para a semeadura e estabelecimento de lesões metastáticas2.
Os métodos tradicionais para estudar a semeadura e o crescimento metastáticos examinam os estados estáticos, pois os tecidos são excisados e seccionados para histologia. Esses dados geram apenas um instantâneo desse processo altamente dinâmico. Embora algumas informações úteis possam ser obtidas com esses estudos, o complicado processo pelo qual as células tumorais e estromais interagem durante a formação metastática não pode ser avaliado adequadamente por esses métodos. Além disso, não é possível obter informações sobre os padrões de migração de células tumorais ou estromais, que são importantes para estabelecer uma colônia no local distante. Para estudar efetivamente o processo metastático, é essencial visualizar várias interações entre as células cancerígenas e seu microambiente de maneira contínua e em tempo real. 
O pulmão é um local comum para metástases de tumores sólidos como câncer de mama, colorretal, pâncreas, melanoma e sarcoma3. A imagem intravital foi usada anteriormente para estudar a interação célula-célula em vários modelos primários de tumores e metastáticos4,5. Métodos de imagem pulmonar em camundongos, incluindo imagens intravitais, imagens de seção pulmonar e um ensaio de metástase pulmonar ex vivo, foram publicados6–9. A imagem intravital dos pulmões de camundongos utiliza uma janela de sucção torácica para estabilizar os pulmões6. Este método é usado para imagens de lapso de tempo da microcirculação pulmonar e espaços alveolares. A localização anatômica dos pulmões representa um desafio para a imagem intravital. Para acessar os pulmões, a cavidade torácica deve ser aberta, o que leva à perda de pressão negativa e ao colapso dos pulmões. Este método permite apenas a visualização de uma pequena parte dos pulmões e é tecnicamente exigente; uma complicação desnecessária em estudos que examinam processos independentes do fluxo sanguíneo. Além disso, esse método também requer o movimento de bloqueio causado pela respiração. Isso é feito por meio da coleta de imagens entre as respirações ou durante as análises pós-aquisição de imagens10. A imagem alternativa de corte pulmonar ex vivo fornece estabilidade e profundidade, além de preparar o parênquima pulmonar para imunomarcação7. No entanto, o longo processo de seccionamento leva a um grande atraso entre o momento do sacrifício do animal e o início da sessão de imagem. Além disso, o processo de secção de um pulmão de camundongo causa uma quantidade considerável de morte celular8, interferindo assim na qualidade e quantidade de amostras de imagem e talvez alterando desnecessariamente as interações tumor-estroma. A fim de tecnicamente fazer a ponte entre os métodos de imagem intravital e imagem de seção pulmonar, explorando as vantagens das duas técnicas, foi desenvolvido um método relativamente rápido e fácil para imagens pulmonares ex vivo. Este método foi obtido por imagem de lobos pulmonares inteiros não seccionados. Usando este método, a motilidade das células cancerígenas, bem como as interações entre as células cancerígenas e as células estromais em seu microambiente, podem ser visualizadas em tempo real por várias horas.

<table><tbody><tr><td>Camundongos MMTV-PyMT/FVB</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td>Camundongos fêmeas</td></tr><tr><td>Camundongos ACTB-ECFP/FVB Laboratório</td><td></td><td>UCSF Werb</td><td>Camundongos fêmeas Camundongos</td></tr><tr><td>c-fms-EGFP/FVB Laboratório</td><td></td><td></td> UCSF Werb <td>Camundongos fêmeas</td></tr><tr><td>Camundongos FVB Laboratório</td><td>Jackson</td><td>1800</td><td>Camundongos fêmeas</td></tr><tr><td>Células GFP+ VO-PyMT Laboratório</td><td></td><td></td><td></td>UCSF Werb</tr><tr><td>70.000 kDa Dextran,</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td> conjugado com rodamina <td>Diluir para&nbsp; 4mg/ml em 1 x PBS e armazenar a -20&nbsp; &nbsp;C. Use 0,4 mg por animal.&nbsp;</td></tr><tr><td>10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td>Diluir para&nbsp; 4mg/ml em 1 x PBS e armazenar a -20&nbsp; &nbsp;C. Use 0,4 mg por animal.&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato Gr-1 Alexa Fluor 647</td><td>UCSF Núcleo</td><td></td> de anticorpo monoclonal <td>Estoque 1mg / ml. Use 7 ug por animal.</td></tr><tr><td>Anestesia anestésica</td><td></td><td></td><td>aprovada pela IACUC, usada para anestesia e/ou eutanesia</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Instalação</td><td></td><td></td>de cultura de células UCSF</tr><tr><td>PBS, USP estéril&nbsp;</td><td>Amresco INC</td><td>K813-500ML</td><td>Grau ultra puro para injeção intravenosa</td></tr><tr><td>Plataforma</td><td></td><td></td> de isopor <td>Será usado como placa de dissecação</td></tr><tr><td>Tesoura fina afiada&nbsp;</td><td>Pinça Fine Science</td><td>Tools 14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Roboz</td><td>Surgical Store</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas quentes</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>18000-45</td><td>Ligue 30min antes de usar</td></tr><tr><td>Air</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxigênio</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dióxido de Carbono</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL sem agulha&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 agulha&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>305109</td><td>para injeção intravenosa</td></tr><tr><td>20 G x 1 agulha, bisel curto&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixa temperatura de fusão&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>Para fazer 10 ml de solução, pesar 0,2 g de agarose, adicionar a 10 ml 1 x PBS e aquecer para dissolver. A agarose solidificará à temperatura ambiente, portanto, mantenha em uma temperatura de 37 &graus; C banho-maria até ser usado para inflação.</td></tr><tr><td>Meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Placa de imagem de 24 poços&nbsp;</td><td>E & K scientific</td><td>EK-42892</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de cobertura de vidro, 15 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-144</td><td></td></tr><tr><td>Controlador digital de CO2 e temperatura</td><td>Okolab</td><td>DGTCO2BX</td><td>http://www.oko-lab.com</td></tr><tr><td>Câmara climática</td><td>Okolab</td><td></td><td>http://www.oko-lab.com</td></tr><tr><td>Cell Observer microscópio confocal de disco giratório</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td> <td>invertidoCarl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Câmera ICCD</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Cabeçote de varredura confocal de disco giratório</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mManager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Software de código aberto</td></tr></tbody></table>

ex vivo de imagens ao vivo de pulmão metástase e seu microambiente

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

A metástase é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionada ao câncer. A metástase é um processo de várias etapas e, devido à sua complexidade, os processos celulares e moleculares exatos que governam disseminação metastática e crescimento são ainda imperceptíveis. imagens ao vivo permite a visualização das interações dinâmicas e espaciais das células e seu microambiente. Os tumores sólidos geralmente metástases para os pulmões. No entanto, a localização anatômica dos pulmões representa um desafio para imagiologia intravital. Este protocolo fornece um método relativamente simples e rápido para ex vivo imagens ao vivo das interações dinâmicas entre as células tumorais e sua estroma circundante dentro de metástase pulmonar. Usando este método, a motilidade de células cancerosas, bem como as interacções entre as células cancerosas e as células do estroma no seu microambiente podem ser visualizados em tempo real, durante várias horas. Ao utilizar ratinhos transgénicos repórter fluorescentes, uma linha de células fluorescentes, injectável marcado fluorescentementemoléculas e / ou anticorpos, vários componentes do microambiente do pulmão pode ser visualizado, tais como os vasos sanguíneos e células do sistema imunológico. Para imagem os diferentes tipos de células, foi utilizado um disco giratório microscópio confocal que permite imagens contínuo a longo prazo com rápida, de quatro cores de aquisição de imagem. filmes de lapso de tempo compilados a partir de imagens recolhidas ao longo de várias posições e planos focais mostram interações entre metastático ao vivo e células do sistema imunológico durante pelo menos 4 horas. Esta técnica pode ser também utilizada para testar a quimioterapia ou terapia-alvo. Além disso, este método pode ser adaptado para o estudo de outras patologias relacionadas com o pulmonares que podem afectar o microambiente do pulmão.

Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, vários sistemas modelo rato e injectáveis, o microambiente metastático pode ser visualizado e rastreada ao longo do tempo. Usando um MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; modelo de ratinho transgénico triplo EGFP c-fms, diferentes componentes celulares são marcado de forma fluorescente (Figura 2A, um filme). A estrutura típica do parênquima pulmonar pode ser visualizado no canal PCP uma vez que todas as células expressam ECFP sob o pr...

Descreve-se um método relativamente simples para a imagiologia ex vivo, ao vivo das interacções de células de estroma tumoral dentro de metástase pulmonar, utilizando repórteres fluorescentes, em ratinhos. Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, esta técnica permite a visualização de células vivas durante pelo menos 4 horas e pode ser adaptado para estudar outras condições inflamatórias do pulmão.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar as interações dinâmicas do estroma das células tumorais nas metástases pulmonares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase do câncer, como como a metástase é estabelecida.e quais tipos de células dentro do microambiente estão envolvidos neste processo? A principal vantagem que esta técnica oferece é que este é um método rápido e fácil para imagens pulmonares ex vivo que permite a visualização de células vivas por pelo menos quatro horas. Essa técnica pode ter aprofundado nossa compreensão dos mecanismos de ação de várias terapias direcionadas para o tratamento de metástases pulmonares. Tivemos uma ideia para esse método pela primeira vez quando estávamos examinando metástases por imagem de seção pulmonar e estávamos lutando com uma morte celular extensa como resultado desse procedimento. Para preparar os pulmões para imagens ao vivo ex vivo, comece imobilizando o camundongo em uma tampa de espuma de poliestireno coberta com um pedaço de imersão e esterilize o animal com etanol 70%. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão epigástrica transversal através da pele, seguida por uma inc

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O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Um método é apresentado para medir a velocidade do fluxo sanguíneo microcirculatório em metástases de câncer de pulmão da superfície pleural em ratos de forma automatizada, usando microscopia intravital pulmonar de tórax fechado. Este modelo tem potencial para ser usado como uma ferramenta amplamente difundida para realizar pesquisas fisiológicas sobre metástases pulmonares em roedores.

Automated Medição da microcirculação sanguínea velocidade na Pulmonar Metástases of Rats

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aprenda imagem ex vivo ao vivo de metástase pulmonar usando microscopia confocal de disco rotativo em camundongos. Esta técnica permite visualizar interações célula-tumor e estroma por pelo menos quatro horas.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

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