Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

O objetivo geral deste procedimento é realizar observações quantificáveis da ocorrência temporal e espacial da fusão de vesículas exocíticas neuronais e do ramificamento de axônios. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como quando e onde a fusão de vesículas insere material de membrana na membrana plasmática em expansão durante o desenvolvimento neuronal. A principal vantagem desta técnica é que ela combina o uso de imagem em células vivas para obter alta resolução espacial e temporal em células individuais, com abordagens bioquímicas para obter informações baseadas em populações.

Após cultivar e simular neurônios corticais com Netrina-1 ou um controle de acordo com o texto do protocolo. Aspire o PBS do primeiro poço de uma condição e substitua por 250 microlitros de tampão de homogenização. Incube em gelo por cinco minutos e, em seguida, usando um espátula celular, homogenize as células em gelo.

Aspire o PBS do próximo poço da mesma condição e adicione a mistura recentemente homogeneizada ao poço, o que aumentará as concentrações de proteína. Em seguida, transfira a solução homogeneizada para um tubo microcêntrifugo pré-resfriado de 1,6 mililitro sobre gelo e adicione Triton X-100 20% para atingir uma concentração final de 1%. Então, com uma pipeta de 1.000 microlitros, triture a mistura dez vezes, minimizando ao máximo a formação de bolhas. Incube os tubos em gelo por dois minutos para solubilizar as proteínas.

Em seguida, centrifugue a 6.010 RCF a 4 graus Celsius por 10 minutos para obter o pellet do material não solubilizado. Transfira o sobrenadante líquido para um novo tubo de 1,6 mililitro previamente resfriado, sobre gelo. A seguir, utilize o ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteína.

Em seguida, utilize o tampão de homogeneização com 1% de Triton X-100 e tampão amostral 5X suplementado com BME para diluir as amostras até uma concentração final de 3-5 miligramas por mililitro. Divida igualmente cada amostra experimental em dois tubos. Incube então uma amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos e a outra a 100 graus Celsius por 30 minutos.

Inverta os tubos intermitentemente para manter as amostras em solução. Em seguida, realize a eletroforese SDS-PAGE e o Western blotting de acordo com o protocolo descrito no texto. Após configurar o microscópio TIRF e a amostra e encontrar um plano focal neuronal de acordo com o protocolo descrito no texto.

Inicie o software do laser e conecte-se ao software de controle do laser. Configure a iluminação para campo amplo e selecione o objetivo. Em seguida, defina o índice de refração da amostra e ajuste a intensidade do laser desmarcando TTL para o laser de 491.

A otimização dos parâmetros de imagem é importante durante a aquisição de imagens de vesículas exocíticas com membrana intacta, a fim de evitar desvios de foco e fototoxicidade, ao mesmo tempo em que se produzem imagens com alta relação sinal-ruído, suficiente para análise. Ajuste o controle deslizante para 100 e, em seguida, reduza-o para um valor entre 20 e 40. Depois, verifique novamente o TTL.

Em seguida, foque novamente a amostra com iluminação em luz transmitida. Depois, no software de imagem, selecione a iluminação com laser de 491 e abra o obturador. Coloque o condensador de cabeça para baixo sobre a bancada óptica para não arranhar a lente.

Ajuste finamente o ponto focal do laser no teto e, com o condensador removido, centralize o ponto no centro do diafragma de campo fechado. Em seguida, recoloque o condensador e, no software TIRF, defina a profundidade de penetração para 110 nanômetros. Depois, mude do modo de iluminação de campo amplo para o modo de iluminação TIRF para a aquisição de imagens.

Agora, utilizando epifluorescência de campo amplo, localize células que expressam VAMP2 fluorescente através das oculares. Em seguida, para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade, ajuste os parâmetros de imagem para maximizar a relação sinal-ruído e a faixa dinâmica, usando o tempo de exposição e a intensidade do laser mínimos possíveis. Configure o foco automático contínuo por célula.

Em seguida, adquira um conjunto de imagens em lapso de tempo com aquisição a cada 0,5 segundos durante cinco minutos. Para a condição estimulada com Netrin-1 em capela de fluxo laminar, adicione Netrin-1 até uma concentração final de 500 nanogramas por mililitro a uma placa de células e retorne a placa ao incubador por uma hora antes da aquisição de imagens. Para quantificar a frequência de eventos exocíticos normalizados por área celular e tempo.

No ImageJ, abra pilhas de imagens arrastando o arquivo para a janela ou selecionando Arquivo, Abrir, nome do arquivo. Para remover sinais fluorescentes estáveis que não representam eventos de fusão de vesículas, utilize Imagem, Pilha, Projeção Z, tipo de projeção Intensidade Média. Para criar uma projeção Z média de toda a pilha.

Subtraia a imagem média resultante de cada imagem na sequência temporal usando Processar, Calculadora de Imagem, Imagem 1 sua pilha, Operação Subtrair imagem dois. Resultando em uma nova Projeção Z. Isso destacará os eventos exocíticos.

Agora, visualizemente, conte os eventos de fusão exocítica, que podem ser identificados como pontos de sinais fluorescentes com limite de difração que se difundem rapidamente conforme o VAMP2 fluoren se difunde na membrana plasmática. Destaque a primeira imagem com Imagem, Ajustar, Limiar e ajuste o controle deslizante até que toda a célula seja destacada pelo limiar. Em seguida, em Analisar, escolha Definir Medidas e marque área e exibir rótulo.

Com a ferramenta de rastreamento por ponteira, defina a área celular com limiar e pressione M para medir. Transfira os dados coletados para uma planilha de acordo com o protocolo descrito no texto. Após dois dias in vitro, coloque o recipiente de imagem com fundo de vidro contendo neurônios não transfectados em uma câmara ambiental umidificada previamente aquecida.

Utilize um microscópio equipado com uma objetiva planapocromática six DX 1,4 NA DIC e um condensador de alta abertura numérica para obter a melhor qualidade de imagem e resolução. Em seguida, com iluminação de luz transmitida, ajuste o plano de foco para localizar neurônios através das oculares. Para a imagem de ramificação axonal em contraste de interferência diferencial (DIC), a configuração adequada da iluminação será fundamental para a otimização da imagem e essencial para gerar resultados analisáveis.

Em seguida, com os neurônios de interesse dentro do campo de visão, utilize a função de aquisição multizona no software de imagem para localizar e salvar as posições XYZ de pelo menos seis células. Agora, adicione uma concentração final de 250 nanogramas por mililitro de Netrin-1 ou outro fator de interesse para estimular as células e pressione iniciar a aquisição multizona. Adquira sequencialmente imagens em cada posição a cada 20 segundos durante 24 horas.

Interrompendo a aquisição e refocalizando conforme necessário. No software de imagem, revise as imagens selecionando Aplicativos, Revisar Dados Multidimensionais e abra o arquivo desejado. Identifique ramos axonais estáveis que se formaram durante a sessão de imagem.

Utilize a ferramenta de região de traçado para medir um ramo axonal estável, desde a base do axônio até a sua extremidade. Após tratar os neurônios com netrina e toxina botulínica, fixar e realizar imunomarcação, e imunomarcar para beta-3 tubulina e actina de acordo com o protocolo descrito no texto. Utilize um microscópio invertido para obter imagens de fluorescência em campo amplo.

Abra uma pilha de imagens no ImageJ e, para analisar manualmente a ramificação, use a ferramenta linha, linha segmentada e siga o axônio, definido como o neurito mais longo que se estende do corpo celular. Com Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI, salve o rastreamento do axônio como uma região de interesse. Em seguida, siga e salve cada ramificação do axônio, definida como um neurito com comprimento maior ou igual a 20 micrômetros.

Inclua apenas ramos primários na análise. É mostrado aqui um blot ocidental após a conclusão do ensaio de complexo SNARE resistente a SDS. Revelado para SNAP25, Syntaxin 1A e VAMP2.

Proteínas SNARE em complexo, com monômeros identificáveis mostrados aqui. Um exemplo de um evento exocítico mediado por fluoróforo de VAMP2 ocorrendo ao longo do tempo em um neurônio cortical é mostrado aqui. Os insets ampliados indicam o soma, um ramo axonal e um cone de crescimento axonal, demonstrando a utilidade espacial deste ensaio.

Os círculos indicam eventos únicos de fusão exocítica, que podem ser observados por microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF). Esta imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) em lapso de tempo mostra, em tempo real, a formação de um ramo axonal estimulada por Netrina. Esses locais indicam a protrusão inicial a partir de um sítio de ramificação.

Estas representam ramificações estáveis totalmente formadas com pelo menos 20 micrômetros, medidos do axônio principal até a ponta da ramificação. Neste experimento, neurônios corticais em 3 DIV foram tratados com Netrina-1, que estimula a ramificação, ou com toxina botulínica tipo A, que cliva a SNAP25, um componente do complexo SNARE e bloqueia a exocitose. Os resultados demonstram que a exocitose mediada pelo complexo SNARE é necessária para a ramificação dependente de Netrina.

Uma vez dominada, a microscopia DIC pode ser concluída em uma única sessão de imagem noturna. A microscopia TIRF de eventos exocitóticos individuais pode ser realizada em 4 a 5 horas. O protocolo bioquímico de formação do complexo SNARE pode ser executado em duas horas.

Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar de manter um ritmo adequado e não se apressar em nenhuma etapa específica. Cada procedimento exige atenção e paciência para obter os melhores resultados. Após seguir este procedimento, outros métodos, como a cotransfeção de componentes de vesículas marcados com cargas candidatas marcadas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.

Como é, por exemplo, o conteúdo das vesículas exocíticas? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de neurociência explorassem a neuritogênese, o ramificamento axonal e outras etapas da morfogênese em qualquer cultura neuronal dissociada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como observar e quantificar a natureza espacial e temporal dos eventos de fusão de vesículas exocíticas neuronais correspondentes às alterações na morfogênese neuronal.

Não se esqueça de que trabalhar com toxina botulínica ou lasers de alta potência pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de roupas de segurança adequadas e a utilização do mecanismo de bloqueio de segurança do microscópio devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.