Name: Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Aprenda a observar a exocitose mediada por SNARE na ramificação de axônios dependente de netrina usando neurônios corticais. Este método combina imagens de células vivas com ensaios bioquímicos para análise abrangente.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde: SR1-GM108970 (SLG) e F31-NS087837 (CW).

Declaração de ética em pesquisa: Todos os experimentos envolvendo animais aqui detalhados estão sujeitos às regras e regulamentos da Comissão UNC on Animal Care e normas do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. 1. Preparação e chapeamento de Dissociated neurônios corticais <ol><li> Eutanásia fêmeas cronometrados-grávida de inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical. Remover cérebros inteiros dos crânios dos embrionárias dias 15,5 (E15.5) ratos e microdissect córtices de cada hemisfério. Para obter instruções detalhadas sobre o microdissection do córtex embrionário do rato consulte Viesselmann et al 8. </li><li> Coloque há mais de 4 córtices em 1 ml de meio de dissecação em um estéril 1,6 ml microtubo. Adicionar 120 ul de tripsina 10x e inverter o tubo 3 - 5 vezes para misturar. </li><li> Usando um hemocitómetro, contagem de células para semear placas de cultura de células. Nota: 1 hemisfério cortical fornece aproxoximately três milhões de células. <ol><li> Para o ensaio de bioquímica complexo SNARE resistentes-SDS, placa de seis milhões de células por placa de 35 mm e utilizar dois pratos por condição. Nota: Este é simplificada usando placas de 6 poços ao comparar várias condições. </li><li> Para os ensaios de ramificação, neurónios placa em ácido nítrico lavada lamelas circulares numa densidade de 250.000 células por prato de 35 mm, para DIC imagiologia de axónio ramificação em placas a uma densidade de 150.000. Estas densidades evitar a superlotação e simplificar a análise. </li></ol></li><li> Para a microscopia TIRF de células vivas, ressuspender dois milhões de neurônios por transfecção em nucleofection solução à temperatura ambiente. <ol><li> Adicionar 100 ul de suspensão de células para microtubo contendo 10 ug de VAMP2-pHlourin plasmídeo de expressão e electroporar com um Nucleofector de acordo com o protocolo do fabricante 9. </li><li> Após transfections imediatamente adicionar 500 mL de mídia tripsina extinguir, anular a suspensão de células em cuvete e placa em um densidade de 400.000 células por 35 milímetros de vidro PDL revestido prato fundo. </li></ol></li><li> Placa de todos os neurónios corticais em 2 ml de meio isento de soro. </li></ol> 2. ensaio de formação de complexo SNARE Nota: complexos SNARE resistentes-SDS foram processados ​​e analisados ​​como descrito originalmente 10, com as modificações a seguir indicados. Para anticorpos alternativos validados para os usados ​​aqui, consulte a secção de materiais. <ol><li> Estimular neurônios corticais E15.5 2 dias in vitro (DIV) com 250 ml de controle ng / netrin-1 ou placebo para 1 hora antes da lise. </li><li> Antes de processamento de amostras, centrífuga fresco a 4 ° C, e ajustar a temperatura do banho de água a 37 ° C, e o bloco de aquecimento a 100 ° C. </li><li> Remover pratos de células de incubadora e colocar no gelo. <ol><li> Aspirar meios de células, substitua com -2 mL de gelo frio de fosfato salina tamponada (PBS) suavemente 2 vezes durante 1-2 minutos por lavagem. </li><li> Para este ensaio, utilizar 2 poços por condsição. </li><li> Aspirar PBS a partir do primeiro poço de uma condição e substituir com 250 ul de tampão de homogeneização. Deixar em gelo durante 5 min, e, em seguida, utilizando um tirante de células, homogeneizar as células em gelo. </li><li> Aspirar o PBS do poço seguinte da mesma condição e adicionar a mistura homogeneizada recentemente para o poço. Isto irá aumentar a concentração de proteína. Repita o procedimento para todas as condições. </li><li> Após a conclusão, pipeta solução para um pré-arrefecida de 1,6 ml microtubo homogeneizado em gelo e adiciona-se 20% Triton X-100 para se atingir uma concentração final de 1% Triton X-100. Triturar misturar 10 vezes com 1000 mL pipeta, minimizando bolhas. </li></ol></li><li> Incubar os tubos em gelo durante 2 min para solubilizar as proteínas. Após a incubação, centrifuga-se durante 10 min a 6010 RCF a 4 ° C para sedimentar o material não solubilizado. Mover sobrenadante do lisado para um novo tubo de 1.6 ml arrefecida em gelo. </li><li> Realizar a análise de concentração de proteína utilizando o ensaio Bradford 11 e diluir as amostras a uma finaL concentração de proteína de 3-5 mg / mL com o restante tampão de homogeneização suplementado com 1% de Triton X-100 e de 5x tampão de amostra suplementado com B-Mercaptethanol (BME). </li><li> Divida cada amostra experimental uniformemente em 2 tubos. Incubar uma amostra a 37 ° C durante 30 min (complexos SNARE), e o outro a 100 ° C durante 30 min (monómeros SNARE). Inverta tubos intermitentemente para manter as amostras em solução. </li><li> Congele as amostras à temperatura de -20 ° C até estar pronto para separar por meio de SDS-PAGE. Antes da execução de amostras por meio de electroforese, utilizando técnicas convencionais, referver anteriormente amostras fervidas durante 5 min a 100 ° C, mas descongelar 37 ° C As amostras à TA. </li><li> duplicatas corrida de amostras (30 - 40 mg de proteína por amostra) em ambos a 8% e um gel de 15%; a 8% proporciona separação ideal do complexo, enquanto que a 15% é utilizada para quantificar os monómeros de proteína SNARE (~ 25 kDa de SNAP-25, VAMP2 ~ 18kDa, sintaxina-1 ~ 35 kDa). Manter a fonte de alimentação de 70 V até que a linha de corante é através da Stacrei gel e aumento da tensão de 90V. Executar géis até que o corante foge. </li><li> Para preservar monómeros, transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 um em gelo utilizando tampão de transferência de frio com 20% de metanol (MeOH) adicionado, a 70 V durante 45 min. </li><li> membrana seco em um prato coberto para 2 horas de O / N à temperatura ambiente (O / N fornece os melhores resultados). </li><li> Bloco SNARE membranas complexas em 10% Albumina de Soro Bovino (BSA) durante 1 h à TA. </li><li> Preparar anticorpos primários (reconhecendo componentes específicos complexo SNARE) a uma diluição de 1: 1000 e sonda de O / N a 4 ° C num agitador rotativo. <ol><li> Lavar blots em solução salina tamponada TRIS mais 0,1% de Tween-20 (TBS-T) 3 vezes durante 5 minutos cada. </li></ol></li><li> Preparar soluções de anticorpos secundários fluorescentes a uma diluição de 1: 20000 em 1% de BSA em TBS-T e a sonda durante 1 h, à RT coberto. 2.12.1 Passo Repita depois de 1 hora. </li><li> borrões de imagem em uma máquina de digitalização fluorescente equipado com conjunto de software e quantificar tanto a co proteína SNAREmplex (bandas imunorreactivas acima de 40 kDa) e as bandas imunorreactivas monómero (bandas a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa para SNAP-25, VAMP2 e sintaxina-1, respectivamente), utilizando as instruções do fabricante para o desenho ROIs rectangular. </li></ol> 3. Imagem exocíticas Eventos via microscopia TIRF Nota: Este protocolo requer equipamento microscopia especializada, incluindo uma câmara de ambiente para manter a temperatura, humidade e de CO2, um microscópio TIRF invertido equipado com uma iluminação de epifluorescência, um / elevada abertura numérica (NA) objectivo TIRF alta ampliação, uma fase automatizado XYZ, e uma sensível Charge Coupled Device (CCD) detector. Este protocolo utiliza um microscópio invertido totalmente automatizado equipado com uma objectiva de um sólido estado de laser 491 nm 100x 1.49NA TIRF e um Electrão Multiplicando CCD (CCD-EM). Todo o equipamento é controlado pelo software de imagem e controle laser. Antes do início do protocolo de alimentação de imagem no ambionmental câmara, palco, lâmpada, computador e câmera. <ol><li> Escolha um objetivo dentro de software de imagem. Uma vez que o objetivo está no lugar, aperte o aquecedor objetivo em volta da gola. </li><li> Confirmar que o objectivo é baixado completamente antes de fixar a incubadora estágio no slot palco. Despeje água destilada para as entradas de estágio incubadora uniformemente para evitar derramamento. </li><li> Ligue o sistema de incubação. Abrir a válvula ao tanque de CO 2 e confirmar a pressão é apropriado para o sistema de acordo com as instruções do fabricante. Permitir câmara de algum tempo para atingir os 5% de CO 2 e 37 ° C. Antes de adicionar o prato de imagem, colocar um recipiente vazio na incubadora para evitar a condensação de água no objectivo. </li><li> Ligar a fonte de laser. </li><li> Abrir incubadora palco e adicionar óleo de imersão para a lente. Coloque amostra na incubadora e estabilizar com os braços de estabilidade ou um peso prato. Elevar o objectivo, até o óleo entra em contacto com a parte inferior da amostra. switch com iluminação de luz transmitida e encontrar plano focal neuronal através das oculares. </li><li> Inicie o software de laser e se conectar ao software de controle de laser. iluminação para widefield e selecione o objetivo a ser utilizado set (100X 1,49 NA TIRF é recomendado). Conjunto de índices de refracção da amostra (células de ~ 1,38). Ajustar a intensidade do laser, desmarcando &quot;TTL&quot; para o laser 491 nm. Ajuste o controle deslizante para 100, em seguida, trazê-lo de volta para baixo para um valor entre 20 - 40%. Verifique novamente &quot;TTL&quot;. </li><li> Concentre-se em amostra novamente em iluminação de luz transmitida. Ir para o software de imagem e selecione iluminação do laser 491 nm e obturador aberto. Um ajuste fino do ponto focal do laser no teto e centrar o ponto até ao centro do diafragma campo fechado com o condensador removido. Coloque condensador de cabeça para baixo no banco óptico, de modo a não lente zero. </li><li> Substitua condensador e ir para o software TIRF e definir profundidade de penetração (PD) a 110 nm. Mudar de iluminação widefield para illum TIRFmodo de inação para a imagem latente. </li><li> Encontrar VAMP2-phluorin células que expressam através das oculares usando epifluorescência widefield com fonte de luz de epifluorescência. <ol><li> Ajustar os parâmetros de imagem (tempo de exposição, o ganho e de potência de laser) para maximizar a razão sinal-ruído e gama dinâmica usando o tempo de exposição mínimo e intensidade do laser para reduzir a fotodegradação e fototoxicidade (por exemplo: exposição entre 50 - 100 ms, com uma 15 - 30 ganhar a 30% de potência máxima laser). </li><li> Definir o foco automático contínuo por célula. Adquirir uma imagem timelapse conjunto com aquisição ocorrendo a cada 0.5 s por 5 min. Para a condição estimulada netrina-1, adicionar 500 ng netrina-1 / ml a placa de células numa câmara de fluxo laminar e devolver o prato para a incubadora durante 1 h antes da imagiologia. </li></ol></li><li> Para quantificar a frequência de eventos exocíticas normalizados por área celular e tempo, pilhas de imagens abertas em ImageJ arrastando o arquivo para a janela ou ir em File&gt; Open&gt; File (Figura0; 2A Inserção 1). <ol><li> Para remover sinais fluorescentes estáveis ​​que não representam eventos de fusão de vesícula, criar uma projeção média z de toda a pilha usando Imagem&gt; Pilha&gt; Z-Project&gt; tipo de projeção: Intensidade Média. Subtrair esta imagem média de cada imagem na timelapse usando o Process&gt; Calculadora Imagem&gt; Image1: sua operação de pilha: Subtrair Image2 recém-criado projeção média z. Isto enfatiza eventos exocíticos (Figura 2A Inset 2-3). </li><li> Contagem de eventos de fusão exocíticas por olho. Eventos exocitico são definidas como o surgimento de um sinal de fluorescência limitado por difração, que se difunde rapidamente quanto VAMP2-phluorin difunde no interior da membrana plasmática (Figura 2A Inserção 6). </li><li> Use o comando Limiar para realçar a primeira imagem usando Image&gt; Adjust&gt; Threshold&gt; ajuste deslizante até que toda a célula é limiar de destaque (Figura 2A Inset 7-8). </li><li> sob AnaLyze, escolha SetMeasurements e área e rótulo de exibição verificar. Seleccione a área celular thresholded usando a ferramenta varinha traçado e pressione &#39;m&#39; para medir (Figura 2A Inset 7-8). </li><li> Transferência ambos os eventos de fusão exocíticas contar, as medições de área celular e o tempo decorrido de imagem para uma planilha para calcular o número de exocítico eventos / mm 2 / hora (Figura 2A Inset 9). </li></ol></li></ol> 4. interferência diferencial Contrast (DIC) Timelapse Microscopia de Axon Ramificação Nota: Um protocolo completa e de demonstração para uma abordagem geral à imagem DIC está disponível 12. Embora este protocolo utiliza DIC, podem ser utilizados outros métodos de microscopia de luz transmitida para os mesmos fins (por exemplo: contraste de fase). <ol><li> Às 2 DIV, prato de imagem inferior lugar de vidro contendo neurônios untransfected na pré-aquecido câmara ambiental para manter um env úmidoironment com 5% de CO 2 e 37 ° C. Utilizar um microscópio equipado com um 60X Plan-Apochromat, 1,4 NA DIC lente objetiva e de alta condensador NA para a melhor qualidade de imagem e resolução. </li><li> Ajuste o plano focal para encontrar neurônios através das oculares utilizando iluminação de luz transmitida. </li><li> Usando a função de multi aquisição da área de software de imagem, encontrar e salvar os locais XYZ de pelo menos 6 células. Posicione o palco para que os neurônios de ajuste interesse dentro do campo de visão para melhores resultados. <ol><li> Estimular com 250 ng / ml netrin-1 e pressione &#39;start vários aquisição área&#39;. adquirir sequencialmente imagens em cada posição a cada 20 segundos, durante 24 horas, parando aquisição e reorientação, se necessário. </li></ol></li><li> Rever imagens no software de imagem usando Aplicativos&gt; Comente Dimensional de Dados&gt; nome do arquivo aberto multi. Identificar ramificações de axónios estáveis ​​(20 mm de comprimento) que se formam durante a sessão de imagens. Use a ferramenta da linha de empate para medir um branc stableaxonh partir da base no axónio até a ponta para assegurar a qualificação comprimento de 20 um é satisfeita. <ol><li> Em uma planilha, gravar o número do quadro após a estimulação netrin quando saliências membrana iniciar em áreas onde ramos mais tarde formam, bem como o número do quadro após a estimulação netrin quando ramos nascentes chegar a 20 mm de comprimento. </li><li> Multiplique o número de quadros entre protrusão e formação de ramo por 20 segundos para calcular o tempo de formação por agência. </li></ol></li></ol> 5. Manipulações Toxinas e imunofluorescência celular fixo <ol><li> No DIV 2, tratar os neurónios em condições experimentais com 250 ng / ml a netrina-1 e / ou 10 nM de toxina botulínica A (BoNT), que cliva a proteína SNARE SNAP25 e inibe eficazmente a SNARE exocitose mediada 13, mais 250 ng / mL netrin- 1. Deixar um conjunto de neurónios não tratados como condição de controle. CUIDADO: BoNTA requer a utilização de protecção ocular e protecção respiratória quando a preparação e utilizaçãosoluções. Manter todos os materiais contaminados como material de risco biológico e autoclave o mais rapidamente possível. </li><li> No DIV 3 (24 horas após o tratamento) meios aspirado, e substituir imediatamente com, pelo menos, 1 ml de solução PHEM (ver Tabela 1 para detalhes) aquecido a 37 ° C. Incubar durante 20 min no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x com PBS (para o futuro selo uso com parafilme e armazenar a 4 ° C). </li><li> lamelas em lugar escuro, coloração câmara humidificada e permeabilizar as membranas das células durante 10 minutos em recentemente diluído 0,2% Triton X-100 em PBS (feito a partir de 10% da TritonX-100). </li><li> Remoção da solução de permeabilização e lavar com 50 ul de 1x com PBS. Bloco durante 30 min em ~ 50 mL de 10% de albumina de soro bovino em PBS (BSA-PBS) ou 10% de Soro asno fervido em PBS à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe com 1x PBS novamente. Incubar lamelas em 50 ul de anticorpo primário (1: 1000 βIII tubulina, para confirmar a identidade neuronal) em 1% de BSA-PBS, durante 1 h à TA, no escuro. </li><li> Realizar 3x lavagens de 5 min em PBS. Incubar lamelas em 50 ul de anticorpo secundário espectralmente distinto para tubulina (1: 400), e faloidina fluorescente (varia de acordo com excitação: 488 faloidina a 1: 400, 647 faloidina a 1: 100) em 1% de BSA-PBS, durante 1 hora . </li><li> Lavar 3x 5 minutos em 1x PBS e montar lamelas em lâminas em meios de montagem. </li><li> Vacuum o excesso de meio de montagem a partir das bordas da lamela e vedação com unhas polonês claro. </li><li> Coletar imagens de epifluorescência widefield em um microscópio invertido com uma objetiva de 40X 1.4NA, capacidades de epifluorescência e EM-CCD. <ol><li> analisar manualmente ramificação usando ImageJ. Pilhas de imagens abertas em ImageJ por arrastar o arquivo para a janela ou ir em File&gt; Open&gt; File (Figura 4A inserção 1). </li><li> Usando linha&gt; A linha segmentada, traçar o axónio, definida como a neurite mais longa se estende a partir do soma (Figura 4A inserir 2-3). </li><li>Usando Analisar&gt; Ferramentas&gt; ROI Manager, salvar o axônio de rastreamento como uma região de interesse. Rastrear e salvar cada ramo do axônio, definida como uma neurite ≥20 mm de comprimento. Incluem ramos primários única (excrescências brotando directamente a partir do axónio) na análise (Figura 4A inserir 3-4). </li><li> Prima &#39;m&#39; para medir as regiões salvas de interesse, e transferir comprimentos de pixels para uma planilha para calcular o comprimento em mm. </li><li> Dividir o número de ramificações de axónios ≥20 ^ m em comprimento, por o comprimento do axónio em uM dividido por 100 para obter o número de ramificações de axónios por 100 uM de comprimento. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A ramificação do axônio é um processo fundamental do neurodesenvolvimento e sustenta a vasta neuroconectividade do sistema nervoso dos mamíferos. Compreender os mecanismos envolvidos na expansão localizada da membrana plasmática é parte integrante de nossa compreensão do neurodesenvolvimento normal e patológico. O uso de uma abordagem multifacetada que incorpora metodologias de nível populacional e de célula única aumenta a reprodutibilidade e aumenta a resolução espacial e temporal sem comprometer a análise em nível pop...

Estimativas recentes sugerem que o cérebro humano contém 1011 neurônios com 1014 conexões sinápticas1, destacando a importância da ramificação do axônio in vivo. Pistas de orientação de axônios extracelulares, como netrin-1, guiam os axônios para parceiros sinápticos apropriados e estimulam a ramificação axonal, aumentando assim a capacidade sináptica2-5. A arborização axonal dependente de netrina-1 envolve expansão substancial da membrana plasmática6, que hipotetizamos requer a entrega de componentes adicionais da membrana via fusão de vesículas exocíticas dependentes do complexo SNARE7. 
Investigar o papel da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina-1 é complicado por vários fatores. Primeiro, a heterogeneidade dos neurônios corticais aumenta o tamanho da amostra necessária para identificar efeitos significativos, complicando técnicas de célula única, como imagens. Em segundo lugar, embora as técnicas bioquímicas permitam a observação de mudanças que ocorrem no nível da população, elas carecem da resolução temporal e espacial necessária para localizar a expansão da membrana plasmática para o axônio no período de tempo de ramificação do axônio. Por fim, embora os ramos axonais se formem ao longo das horas, as alterações celulares que contribuem para a extensão axonal podem começar em minutos e ocorrer na ordem de segundos, estendendo assim o escopo temporal para consideração experimental. 
Delineamos uma abordagem multitécnica que aborda essas diversas escalas temporais e espaciais de exocitose e ramificação de axônios e, assim, aprimora nossa compreensão dos mecanismos celulares fundamentais. A utilização dessas abordagens fornece evidências que apóiam um papel crítico para a exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio.

<table><tbody><tr><td>Placas tratadas com cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de vidro</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; deve ser tratado com ácido nítrico por 24 horas, enxaguado em água DI 2x e seco antes do uso. Deve ser revestido com 1 mg/ml de poli-d-lisina e enxaguado antes da plaqueagem das células.</td></tr><tr><td>Solução de nucleofecção Amaxa</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/transfecção</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/electroporator</td><td>Lonza</td><td></td><td>program O-005</td></tr><tr><td>35 mm Placas de imagem de células vivas com fundo de vidro</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>devem ser revestidas com 1 mg/ml de poli-d-lisina e enxaguadas antes do plaqueamento das células</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus IX81-ZDC2</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de xenônio Lambda LS</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Environmental Stage top incubadora</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF objetivo</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor Sistema de Imagem Infravermelha</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Usado para digitalização de borrões</td></tr><tr><td>Estúdio de imagem pacote de software</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Usado para digitalização no sistema infravermelho Odyssey; Image studio lite usado para análise off-line de manchas</td></tr><tr><td>Metamorph for Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>versão 7.7.6.0</td><td>Software usado para todas as imagens e análise do software de controle DIC timelapse</td></tr><tr><td>CELL TIRF</td><td>Software Olympus</td><td></td><td>usado para controlar lasers para imagens TIRF</td></tr><tr><td>Fiji (Imagem J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Versão 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Apochromat objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Solução base para meios de têmpera sem soro e com tripsina</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Meio sem soro e meio de têmpera de tripsina</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Meio sem soro</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>Solução a 10% em 1x PBS para bloqueio de lamínulas; solução a 5% em TBS-T para bloqueio de membranas de nitrocelulose.</td></tr><tr><td>10x&nbsp; tripsina</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine</td> serum <td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propyl Gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Grau fotométrico de glicerol</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (grau não óptico)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>Dissolvido em água estéril a 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Toxina botulínica A Lista BoNTA</td><td>Laboratórios Biológicos</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti humano VAMP2</td><td>Sinalização celular</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti rato Sintaxina1A</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Cabra policlonal anti humano SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti humano &beta; III-tubulina&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488 faloidina, ou Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-corante anticorpos secundários</td><td>LI-COR</td><td>P / N 925-32212, P / N 925-68023, P / N 926-68022</td><td>800 burro anti-rato, 680 burro anti coelho, 680 burro anti cabra</td></tr><tr><td>0,2 &# 956; membrana de nitrocelulose de tamanho de poro m</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% Bis-Acrilimida</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Alternative Validated Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sistemas sinápticos monoclonais de camundongo Synaptobrevin 2 (VAMP2)</td> <td>104-211</td><td></td>Sistemas <td>sinápticos</td></tr><tr><td>monoclonais de camundongo SNAP25</td><td></td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando metodologias combinadas para definir o papel do plasma membrane entrega durante axon ramificação e neuronal morfogênese

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Durante o desenvolvimento neural, os axônios em crescimento se estendem a vários parceiros sinápticos, elaborando ramos axonais. A ramificação do axônio é promovida por pistas de orientação extracelular como a netrina-1 e resulta em aumentos dramáticos na área de superfície da membrana plasmática axonal. A ramificação do axônio dependente de netrina-1 provavelmente envolve o controle temporal e espacial da expansão da membrana plasmática, cujos componentes são fornecidos pela fusão de vesículas exocíticas. Esses eventos de fusão são precedidos pela formação de complexos SNARE, compreendendo um v-SNARE, como VAMP2 (proteína de membrana associada à vesícula 2) e t-SNAREs de membrana plasmática, sintaxina-1 e SNAP25 (proteína 25 associada a sinaptossomos). Aqui está detalhada uma abordagem multifacetada usada para examinar o papel da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio. A força da abordagem combinada é a aquisição de dados em uma variedade de resoluções espaciais e temporais, abrangendo desde a dinâmica de eventos de fusão de vesícula única em neurônios individuais até a formação do complexo SNARE e ramificação de axônios em populações de neurônios cultivados. Este protocolo aproveita as abordagens bioquímicas estabelecidas para testar os níveis de complexos SNARE endógenos e a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de neurônios corticais que expressam VAMP2 marcados com uma GFP sensível ao pH (VAMP2-pHlourin) para identificar alterações dependentes de netrina-1 na atividade exocítica em neurônios individuais. Para elucidar o tempo de ramificação dependente de netrin-1, utiliza-se microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) de lapso de tempo de neurônios individuais ao longo da ordem de horas. A imunofluorescência de células fixas emparelhada com neurotoxinas botulínicas que clivam a maquinaria SNARE e bloqueiam a exocitose demonstra que a ramificação do axônio dependente de netrina-1 requer atividade exocítica mediada por SNARE.

Utilizando técnicas bioquímicas in vitro para ensaiar a quantidade de complexos SNARE-resistentes SDS em uma população de neurónios. A Figura 1 mostra a western blot resultante, após a conclusão do ensaio de complexo SNARE resistente SDS sondadas para SNAP-25, e syntaxin1A VAMP2. Microscopia TIRF na membrana celular basal fornece imagens de alta resolução de eventos de fusão exocíticos individuais em ...

Técnicas de microscopia de luz acopladas a ensaios bioquímicos elucidam o envolvimento da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina. Essa combinação de técnicas permite a identificação de mecanismos moleculares que controlam a ramificação do axônio e a mudança da forma celular.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar observações quantificáveis da ocorrência temporal e espacial da fusão de vesículas exocíticas neuronais e do ramificamento de axônios. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como quando e onde a fusão de vesículas insere material de membrana na membrana plasmática em expansão durante o desenvolvimento neuronal. A principal vantagem desta técnica é que ela combina o uso de imagem em células vivas para obter alta resolução espacial e temporal em células individuais, com abordagens bioquímicas para obter informações baseadas em populações.Após cultivar e simular neurônios corticais com Netrina-1 ou um controle de acordo com o texto do protocolo. Aspire o PBS do primeiro poço de uma condição e substitua por 250 microlitros de tampão de homogenização. Incube em gelo por cinco minutos e, em seguida, usando um espátula celular, homogenize as células em gelo.Aspire o PBS do próximo poço da mesma condição e adicione a mistura recentemente homogeneizada ao poço, o que aumentará as concentrações de proteína. Em seguida, transfira a solução homogeneizada para um tubo microcêntrifugo pré-resfriado de 1,6 mililitro sobre gelo e adicione Triton X-100 20% para atingir uma concentração final de 1%. Então, com uma pipeta de 1.000 microlitros, triture a mistura dez vezes, minimizando ao máximo a formação de bolhas. Incube os tubos em gelo por dois minutos para solubilizar as proteínas.Em seguida, centrifugue a 6.010 RCF a 4 graus Celsius por 10 minutos para obter o pellet do material não solubilizado. Transfira o sobrenadante líquido para um novo tubo de 1,6 mililitro previamente resfriado, sobre gelo. A seguir, utilize o ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteína.Em seguida, utilize o tampão de homogeneização com 1% de Triton X-100 e tampão amostral 5X suplementado com BME para diluir as amostras até uma concentração final de 3-5 miligramas por mililitro. Divida igualmente cada amostra experimental em dois tubos. Incube então uma amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos e a outra a 100 graus Celsius por 30 minutos.Inverta os tubos intermitentemente para manter as amostras em solução. Em seguida, realize a eletroforese SDS-PAGE e o Western blotting de acordo com o protocolo descrito no texto. Após configurar o microscópio TIRF e a amostra e encontrar um plano focal neuronal de acordo com o protocolo descrito no texto.Inicie o software do laser e conecte-se ao software de controle do laser. Configure a iluminação para campo amplo e selecione o objetivo. Em seguida, defina o índice de refração da amostra e ajuste a intensidade do laser desmarcando TTL para o laser de 491.A otimização dos parâmetros de imagem é importante durante a aquisição de imagens de vesículas exocíticas com membrana intacta, a fim de evitar desvios de foco e fototoxicidade, ao mesmo tempo em que se produzem imagens com alta relação sinal-ruído, suficiente para análise. Ajuste o controle deslizante para 100 e, em seguida, reduza-o para um valor entre 20 e 40. Depois, verifique novamente o TTL.Em seguida, foque novamente a amostra com iluminação em luz transmitida. Depois, no software de imagem, selecione a iluminação com laser de 491 e abra o obturador. Coloque o condensador de cabeça para baixo sobre a bancada óptica para não arranhar a lente.Ajuste finamente o ponto focal do laser no teto e, com o condensador removido, centralize o ponto no centro do diafragma de campo fechado. Em seguida, recoloque o condensador e, no software TIRF, defina a profundidade de penetração para 110 nanômetros. Depois, mude do modo de iluminação de campo amplo para o modo de iluminação TIRF para a aquisição de imagens.Agora, utilizando epifluorescência de campo amplo, localize células que expressam VAMP2 fluorescente através das oculares. Em seguida, para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade, ajuste os parâmetros de imagem para maximizar a relação sinal-ruído e a faixa dinâmica, usando o tempo de exposição e a intensidade do laser mínimos possíveis. Configure o foco automático contínuo por célula.Em seguida, adquira um conjunto de imagens em lapso de tempo com aquisição a cada 0,5 segundos durante cinco minutos. Para a condição estimulada com Netrin-1 em capela de fluxo laminar, adicione Netrin-1 até uma concentração final de 500 nanogramas por mililitro a uma placa de células e retorne a placa ao incubador por uma hora antes da aquisição de imagens. Para quantificar a frequência de eventos exocíticos normalizados por área celular e tempo.No ImageJ, abra pilhas de imagens arrastando o arquivo para a janela ou selecionando Arquivo, Abrir, nome do arquivo. Para remover sinais fluorescentes estáveis que não representam eventos de fusão de vesículas, utilize Imagem, Pilha, Projeção Z, tipo de projeção Intensidade Média. Para criar uma projeção Z média de toda a pilha.Subtraia a imagem média resultante de cada imagem na sequência temporal usando Processar, Calculadora de Imagem, Imagem 1 sua pilha, Operação Subtrair imagem dois. Resultando em uma nova Projeção Z. Isso destacará os eventos exocíticos.Agora, visualizemente, conte os eventos de fusão exocítica, que podem ser identificados como pontos de sinais fluorescentes com limite de difração que se difundem rapidamente conforme o VAMP2 fluoren se difunde na membrana plasmática. Destaque a primeira imagem com Imagem, Ajustar, Limiar e ajuste o controle deslizante até que toda a célula seja destacada pelo limiar. Em seguida, em Analisar, escolha Definir Medidas e marque área e exibir rótulo.Com a ferramenta de rastreamento por ponteira, defina a área celular com limiar e pressione M para medir. Transfira os dados coletados para uma planilha de acordo com o protocolo descrito no texto. Após dois dias in vitro, coloque o recipiente de imagem com fundo de vidro contendo neurônios não transfectados em uma câmara ambiental umidificada previamente aquecida.Utilize um microscópio equipado com uma objetiva planapocromática six DX 1,4 NA DIC e um condensador de alta abertura numérica para obter a melhor qualidade de imagem e resolução. Em seguida, com iluminação de luz transmitida, ajuste o plano de foco para localizar neurônios através das oculares. Para a imagem de ramificação axonal em contraste de interferência diferencial (DIC), a configuração adequada da iluminação será fundamental para a otimização da imagem e essencial para gerar resultados analisáveis.Em seguida, com os neurônios de interesse dentro do campo de visão, utilize a função de aquisição multizona no software de imagem para localizar e salvar as posições XYZ de pelo menos seis células. Agora, adicione uma concentração final de 250 nanogramas por mililitro de Netrin-1 ou outro fator de interesse para estimular as células e pressione iniciar a aquisição multizona. Adquira sequencialmente imagens em cada posição a cada 20 segundos durante 24 horas.Interrompendo a aquisição e refocalizando conforme necessário. No software de imagem, revise as imagens selecionando Aplicativos, Revisar Dados Multidimensionais e abra o arquivo desejado. Identifique ramos axonais estáveis que se formaram durante a sessão de imagem. Utilize a ferramenta de região de traçado para medir um ramo axonal estável, desde a base do axônio até a sua extremidade. Após tratar os neurônios com netrina e toxina botulínica, fixar e realizar imunomarcação, e imunomarcar para beta-3 tubulina e actina de acordo com o protocolo descrito no texto. Utilize um microscópio invertido para obter imagens de fluorescência em campo amplo.Abra uma pilha de imagens no ImageJ e, para analisar manualmente a ramificação, use a ferramenta linha, linha segmentada e siga o axônio, definido como o neurito mais longo que se estende do corpo celular. Com Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI, salve o rastreamento do axônio como uma região de interesse. Em seguida, siga e salve cada ramificação do axônio, definida como um neurito com comprimento maior ou igual a 20 micrômetros.Inclua apenas ramos primários na análise. É mostrado aqui um blot ocidental após a conclusão do ensaio de complexo SNARE resistente a SDS. Revelado para SNAP25, Syntaxin 1A e VAMP2.Proteínas SNARE em complexo, com monômeros identificáveis mostrados aqui. Um exemplo de um evento exocítico mediado por fluoróforo de VAMP2 ocorrendo ao longo do tempo em um neurônio cortical é mostrado aqui. Os insets ampliados indicam o soma, um ramo axonal e um cone de crescimento axonal, demonstrando a utilidade espacial deste ensaio.Os círculos indicam eventos únicos de fusão exocítica, que podem ser observados por microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF). Esta imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) em lapso de tempo mostra, em tempo real, a formação de um ramo axonal estimulada por Netrina. Esses locais indicam a protrusão inicial a partir de um sítio de ramificação.Estas representam ramificações estáveis totalmente formadas com pelo menos 20 micrômetros, medidos do axônio principal até a ponta da ramificação. Neste experimento, neurônios corticais em 3 DIV foram tratados com Netrina-1, que estimula a ramificação, ou com toxina botulínica tipo A, que cliva a SNAP25, um componente do complexo SNARE e bloqueia a exocitose. Os resultados demonstram que a exocitose mediada pelo complexo SNARE é necessária para a ramificação dependente de Netrina.Uma vez dominada, a microscopia DIC pode ser concluída em uma única sessão de imagem noturna. A microscopia TIRF de eventos exocitóticos individuais pode ser realizada em 4 a 5 horas. O protocolo bioquímico de formação do complexo SNARE pode ser executado em duas horas.Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar de manter um ritmo adequado e não se apressar em nenhuma etapa específica. Cada procedimento exige atenção e paciência para obter os melhores resultados. Após seguir este procedimento, outros métodos, como a cotransfeção de componentes de vesículas marcados com cargas candidatas marcadas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.Como é, por exemplo, o conteúdo das vesículas exocíticas? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de neurociência explorassem a neuritogênese, o ramificamento axonal e outras etapas da morfogênese em qualquer cultura neuronal dissociada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como observar e quantificar a natureza espacial e temporal dos eventos de fusão de vesículas exocíticas neuronais correspondentes às alterações na morfogênese neuronal.Não se esqueça de que trabalhar com toxina botulínica ou lasers de alta potência pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de roupas de segurança adequadas e a utilização do mecanismo de bloqueio de segurança do microscópio devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

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Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

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Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

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In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Aprenda a observar a exocitose mediada por SNARE na ramificação de axônios dependente de netrina usando neurônios corticais. Este método combina imagens de células vivas com ensaios bioquímicos para análise abrangente.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese (Vídeo) | JoVE Journal

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

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