Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

O objetivo geral deste procedimento é fazer observações quantificáveis da ocorrência temporal e espacial de fushion de vesícula exocítica neuronal e ramificação de axônio. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como quando e onde a fusão de vesículas insere material de membrana na membrana plasmática em expansão durante o desenvolvimento neuronal. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina imagens de células vivas para adquirir alta resolução espacial e temporal em células únicas e abordagens bioquímicas para adquirir informações baseadas na população.

Após a cultura e simulação de neurônios corticais com Netrin-1 ou um controle de acordo com o texto do protocolo. Aspire PBS do primeiro poço de uma condição e substitua por 250 microlitros de tampão de homogeneização. Incube no gelo por cinco minutos e, em seguida, usando um levantador de células, homogeneize as células no gelo.

Aspire o PBS do próximo poço da mesma condição e adicione a mistura recentemente homogeneizada ao poço, o que aumentará as concentrações de proteína. Em seguida, transfira a solução homogeneizada para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,6 mililitro no gelo e adicione 20% Triton X-100 para atingir uma concentração final de 1% Em seguida, com uma pipeta de 1.000 microlitros, triture a mistura dez vezes, minimizando as bolhas. Incube os tubos no gelo por dois minutos para solubilizar as proteínas.

Em seguida, centrifugue a 6.010 RCF a 4 graus Celsius por 10 minutos para granular o material não solubilizado. Transfira o sobrenadante do estado de mentira para um novo tubo refrigerado de 1,6 mililitro no gelo. Em seguida, use o ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteínas.

Em seguida, use tampão de homogeneização com 1% Triton X-100 e tampão de amostra 5X suplementado com BME para diluir as amostras até uma concentração final de 3-5 miligramas por mililitro. Divida cada amostra experimental uniformemente em dois tubos. Em seguida, incube uma amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos e a outra a 100 graus Celsius por 30 minutos.

Inverta os tubos intermitentemente para manter as amostras em solução. Em seguida, execute a página SDS e o Western blotting de acordo com o protocolo de texto. Depois de configurar o microscópio TIRF e a amostra e encontrar um plano focal neuronal de acordo com o protocolo de texto.

Inicie o software do laser e conecte-se ao software de controle do laser. Defina a iluminação para campo amplo e selecione a objetiva. Em seguida, defina o índice de refração da amostra e ajuste a intensidade do laser desmarcando TTL para o laser 491.

A otimização dos parâmetros de imagem é importante durante a aquisição de imagens de vesículas exocíticas intactas no assoalho para evitar desvio de foco e fototoxicidade, ao mesmo tempo em que produz imagens de alta relação sinal-ruído suficiente para análise. Ajuste o controle deslizante para 100 e, em seguida, abaixe-o novamente para um valor entre 20 e 40. Em seguida, verifique novamente o TTL.

Em seguida, concentre-se na amostra novamente na iluminação de luz transmitida. Em seguida, no software de imagem, selecione a iluminação do laser 491 e abra o obturador. Coloque o condensador de cabeça para baixo na bancada óptica para não arranhar a lente.

Ajuste fino o ponto focal do laser no teto e com o condensador removido, centralize o ponto no centro do diafragma de campo fechado. Em seguida, substitua o condensador e no software TIRF enviou a profundidade de penetração para 110 nanômetros. Em seguida, alterne da iluminação de campo amplo para o modo de iluminação TIRF para geração de imagens.

Agora, usando epifluorescência de campo amplo, encontre células que expressam fluorente VAMP2 através das oculares. Em seguida, para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade, ajuste os parâmetros de imagem para maximizar a relação sinal-ruído e a faixa dinâmica usando o mínimo de tempo de exposição e intensidade do laser. Defina o foco automático contínuo por célula.

Em seguida, adquira um conjunto de imagens de lapso de tempo com aquisição ocorrendo a cada 0,5 segundos por cinco minutos. Para a condição estimulada por Netrin-1 em uma capela de fluxo laminar, adicione uma concentração final de 500 nanogramas por mililitro de Netrin-1 a um prato de células e retorne o prato à incubadora por uma hora antes da imagem. Quantificar a frequência de eventos exocíticos normalizados por área e tempo de célula.

No ImageJ, abra as pilhas de imagens arrastando o arquivo para a janela ou escolhendo Arquivo, Abrir, nome do arquivo. Para remover sinais fluorescentes estáveis que não representam eventos de fusão de vesículas, use Imagem, Pilha, Projeto Z, Tipo de projeção Intensidade média. Para criar uma projeção Z média de toda a pilha.

Subtraia a imagem média resultante de cada imagem no timelapse usando Processo, Calculadora de imagem, Imagem 1 sua pilha, Operação Subtrair imagem dois. Resultando em uma projeção Z recém-criada. Isso enfatizará eventos exocíticos.

Agora, a olho nu, conte os eventos de fushion exocíticos, que podem ser identificados como pontos de sinais fluorescentes limitados por difração que se difundem rapidamente à medida que o flúor VAMP2 se difunde dentro da membrana plasmática. Realce a primeira imagem com Imagem, Ajustar, Limite e ajuste o controle deslizante até que toda a célula seja realçada. Em seguida, em Analisar, escolha Definir medidas e verifique a área e o rótulo de exibição.

Com a ferramenta de rastreamento de varinha, defina a área celular limite e pressione M para medir. Transfira os dados coletados para uma planilha de acordo com o protocolo de texto. Em dois dias in vitro, coloque a placa de imagem com fundo de vidro contendo neurônios não transfectados em uma câmara ambiental úmida pré-aquecida.

Utilize um microscópio equipado com uma lente objetiva APOCROMÁTICA de plano DX 1.4 NA DIC e um condensador de alta abertura numérica para obter a melhor qualidade e resolução de imagem. Em seguida, com a iluminação de luz transmitida, ajuste o plano focal para encontrar neurônios através de oculares. Para imagens DIC de ramificação de axônio, a configuração adequada da iluminação mais fria será essencial para a otimização da imagem e é fundamental para produzir resultados analisáveis.

Em seguida, com os neurônios de interesse dentro do campo de visão, use a função de aquisição de várias áreas no software de imagem para encontrar e salvar as localizações XYZ de pelo menos seis células. Agora, adicione a uma concentração final de 250 nanogramas por mililitro de Netrin-1 ou outro fator de interesse para simular as células e pressione iniciar a aquisição de várias áreas. Adquira imagens sequencialmente em cada posição a cada 20 segundos por 24 horas.

Pausar a aquisição e reorientar conforme necessário. No software de imagem, revise as imagens escolhendo Aplicativos, Revise Dados Multidimensionais e abra o arquivo desejado. Identifique ramos de axônios estáveis que se formaram durante a sessão de imagem.

Use a ferramenta de região de rastreamento para medir uma ramificação de axônio estável da base do axônio até a ponta. Após o tratamento dos neurônios com Netrin e toxina botulínica e fixação e imunocoloração, e imunocoloração para beta-3 tubolin e actina de acordo com o protocolo de texto. Use um microscópio invertido para coletar imagens de epifluorescência de campo amplo.

Abra uma pilha de imagens no ImageJ e, para analisar manualmente a ramificação, use a linha, a linha segmentada e trace o axônio que é definido como o neurite mais longo que se estende do soma. Com Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI, salve o rastreamento do axônio como uma região de interesse. Em seguida, trace e salve cada ramo do axônio, que é definido como um neurite maior ou igual a 20 micrômetros de comprimento.

Inclua apenas ramificações primárias na análise. Aqui é mostrado um Western blot após a conclusão do ensaio do complexo SNARE resistente a SDS. Sondado para SNAP25, Sintaxina 1A e VAMP2.

As proteínas SNARE em monômeros complexos e identificáveis são mostradas aqui. Um exemplo de um evento exocítico mediado por fluroen VAMP2 ocorrendo ao longo do tempo em um neurônio cortical é mostrado aqui. As inserções ampliadas denotam o soma, um ramo axonal e um cone de crescimento axonal mostrando a utilidade espacial deste ensaio.

Os círculos detonam eventos únicos de fusão exocítica, que podem ser vistos por meio de microscopia TIRF. Esta imagem DIC de lapso de tempo mostra a formação estimulada por Netrin de um ramo axônico em tempo real. Esses locais denotam a saliência inicial de um site de filial.

Estes representam ramos estáveis totalmente formados de pelo menos 20 micrômetros medidos do axônio principal até a ponta do ramo. Neste experimento, os neurônios corticais em 3 DIV foram tratados com Netrin-1, que estimula a ramificação, ou toxina botulínica A, que cliva o SNAP25, um componente do complexo SNARE e bloqueia a exocitose. Os resultados demonstram que a exocitose mediada por SNARE é um requisito para a ramificação dependente de Netrin.

Uma vez dominada, a imagem DIC pode ser concluída em uma única sessão de imagem durante a noite. A imagem TIRF de eventos exocíticos individuais pode ser tratada em 4-5 horas. O protocolo de bioquímica de formação do complexo SNARE pode ser realizado em duas horas.

Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de controlar o ritmo e não apressar nenhum passo. Cada procedimento requer atenção e paciência para obter os melhores resultados. Seguindo este procedimento, outros métodos, como a cotransfecção de componentes de vesículas marcados com cargas candidatas marcadas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.

Como qual é a carga das vesículas exocíticas? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a neuritogênese, ramificação do axônio e outros estágios da morfogênese em qualquer cultura neuronal dissociada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como observar e quantificar a natureza espacial e temporal dos eventos de fusão de vesículas exocíticas neuronais correspondentes a mudanças na morfogênese neuronal.

Não se esqueça de que trabalhar com toxina botulínica ou lasers de alta potência pode ser extremamente perigoso e precauções como usar roupas de segurança adequadas e usar o mecanismo de trava de segurança do microscópio devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.