Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish
19 de fevereiro de 2016
Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.
O objetivo geral deste procedimento é imunolocalizar proteínas que são ativadas no embrião de peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento e da biologia celular, como a localização e ativação de proteínas fosforiladas em um embrião inteiro. A principal vantagem dessa técnica é que é possível localizar a sinalização dependente de cálcio em um embrião inteiro por meio da imunocoloração de proteínas ativadas pelo cálcio.
Depois de obter embriões selvagens ou transgênicos de acordo com o protocolo de texto, adicione 0,003% PTU aos embriões na água do sistema para bloquear a pigmentação e incubar até o estágio de desenvolvimento desejado. Quando os embriões atingirem o estágio correto, adicione MESAB ao prato para anestesiar os peixes. Depois que os peixes estiverem anestesiados, remova o máximo possível de água do sistema, adicione 4% de PFA e PBS frescos e incube em temperatura ambiente por três a quatro horas.
Após a incubação, remova o PFA e use 100% de metanol para substituí-lo. Em seguida, armazene os embriões a 20 graus Celsius negativos por pelo menos 48 horas. Para realizar a imunocoloração, coloque um mínimo de 10 embriões para cada condição experimental em tubos de microcentrífuga de 1,5 milímetro marcados.
Quando os embriões se depositarem no fundo do tubo, remova e descarte o metanol e use lavagens progressivas de concentrações decrescentes de etanol em PBTx para reidratar os embriões. Remova a última lavagem com PBTx e adicione 0,5 mililitros de soro de cabra normal a 10% ou NGS em PBTx. Em seguida, incube em temperatura ambiente por pelo menos uma hora com um balanço suave.
Em seguida, remova a solução e adicione 0,2 a 0,5 mililitros de uma diluição de 1 em 5 de anticorpo monoclonal de tubulina anti-acetilada de camundongo e 10% NGS e PBTx. Incube os embriões com um balanço suave à temperatura ambiente durante a noite. De manhã, remova e descarte o anticorpo e faça três lavagens usando 0,5 mililitros de 2%NGS e PBTx com balanço suave por cinco minutos cada.
Diminua as luzes do teto e adicione 500 microlitros a cada amostra de uma diluição de 1 em 500 de anticorpo secundário conjugado com farinha em 10% NGS e PBTx. Incube no escuro em temperatura ambiente por quatro horas com balanço suave. Após a incubação, lave os embriões três vezes.
Para co-imunocoloração, adicione uma diluição de 1 em 20 do anticorpo anti-fosfo-CaMKII. Incube no escuro com um balanço suave durante a noite. Na manhã seguinte, após lavar os embriões com 2%NGS e PBTx três vezes, adicione uma diluição de 1 em 5 de IgG anti-coelho de cabra conjugada fluorescente vermelha 568 e 10%NGS e PBTx.
Depois de incubar no escuro em temperatura ambiente por quatro horas, lave os embriões três vezes e armazene em PBTx ou 50% de glicerol em PBS, dependendo do procedimento de imagem. Para montar os embriões para imagem, coloque de um a cinco embriões em uma lâmina de vidro. Use quatro fragmentos de lamínula empilhados número um em ambos os lados do peixe para criar uma câmara.
E coloque uma lamínula por cima. Com a lente de imersão em óleo 100X e a luz transmitida, coloque um único embrião em foco. Apague a luz.
Ligue o microscópio confocal com os lasers apropriados e ative o foco remoto. Abra o programa confocal e, na barra de aquisição, selecione o objetivo adequado. Em seguida, na barra básica XY, clique no botão 1024 para definir o tamanho da imagem.
Na barra de laser e detector, clique nas caixas vermelha 488 e verde 568 para ligar o detector de laser para cada canal e definir o orifício para médio. Em seguida, na barra de ganho, ajuste o ganho de cada canal para visualizá-lo. Em seguida, na barra de configurações de aquisição, clique em ao vivo para começar a adquirir imagens.
Na barra de configurações de exibição, desmarque a caixa forçar zoom integral para centralizar na janela ativa. Na barra de configurações de aquisição na guia Z, percorra as camadas da imagem. Depois de selecionar o número de camadas a serem incorporadas à imagem, mova para algum ponto no centro do plano Z.
Na guia Z, clique na pequena caixa de referência vermelha. Isso zerará o RFA no ponto escolhido como centro. Na caixa rotulada tamanho da etapa, selecione a espessura das camadas.
Preste atenção na caixa de tamanho do arquivo e tente limitar os arquivos a um gigabyte. Para encontrar o extremo superior da imagem, clique no círculo ao lado do topo e percorra as camadas Z. Agora clique no círculo ao lado da parte inferior e o computador levará a imagem de volta para a camada como centro.
Em seguida, na caixa de configurações de aquisição, clique em ao vivo novamente para interromper a aquisição do laser. Neste painel, clique nas caixas vermelhas rotuladas média e pilha Z. Essas caixas ficarão verdes.
Na caixa de configurações de aquisição, clique em single para adquirir toda a série de imagens. Monitore o progresso à medida que ele verifica em ambos os canais e em toda a pilha Z. Para salvar, clique na janela de volume e clique em salvar como e nomeie o arquivo.
Para renderizar o arquivo em volume, enquanto a pilha Z ainda estiver aberta, selecione o menu suspenso de dados e clique em renderização de volume. Salve o arquivo renderizado como um arquivo dot tif. Esta figura mostra imunomarcação para P-CaMKII e tubulina acetilada, que é um marcador padrão para cílios na vesícula de Kuppfer ou KV do peixe-zebra. Os cílios primários que se alimentam geram um fluxo circular de fluido, o que leva a uma elevação do cálcio nas células ciliadas que revestem o KV e à ativação de CaMKII em locais discretos, como visto aqui.
Essas figuras mostram o P-CaMKII como aparece na superfície apical das células ciliadas que revestem regiões específicas dos ductos perinefréticos entre 24 e 72 horas após a fertilização ou HPF. Em um dia de desenvolvimento, a orelha embrionária do peixe-zebra fixada com PFA e metanol retém suas estruturas e permite a detecção da coloração CaMKII na base e ao longo do comprimento do cinocilimo. Aos 72 HPF, a orelha interna foi contracorada com faloidina Alexa 488 e tubulina antiacetilada com Alexa 568.
A fixação de metanol PFA preservou tanto a F-actina quanto a tubulina. Este peixe 30 HPF expressou uma GFP direcionada à membrana, que seria perdida com a fixação de metanol. A fixação do PFA resultou em um sinal de P-CaMKII diminuído em comparação com a fixação com PFA e metanol.
No entanto, neste estágio de desenvolvimento, o sinal é forte o suficiente para ser detectado sem metanol. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar embriões frescos e agentes livres frescos.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como localizar fosfoproteínas em embriões de peixe-zebra.
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Visão Geral
Este artigo descreve técnicas para imunomarcação de epítopos fosforilados em embriões inteiros de peixe-zebra e realização de localização confocal fluorescente de duas cores. Esses métodos podem definir a localização e a cinética de proteínas específicas em estruturas celulares, como cílios primários.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Desenvolvimento
- Biologia Celular
- Neurociência
Contexto
- Imunolocalização de proteínas em embriões de peixe-zebra.
- Compreensão da ativação de proteínas fosforiladas.
- Localização de sinalização dependente de cálcio.
- Importância do estudo de embriões inteiros para obter insights sobre o desenvolvimento.
Objetivo do Estudo
- Imunolocalizar proteínas ativadas em embriões de peixe-zebra.
- Investigar questões fundamentais da biologia do desenvolvimento e celular.
- Definir a cinética da ativação proteica em um embrião inteiro.
Métodos Utilizados
- Uso de embriões de peixe-zebra selvagens ou transgênicos.
- Aplicação de PTU a 0,003% para bloquear a pigmentação.
- Incubação dos embriões até o estágio de desenvolvimento desejado.
- Imunomarcação com PFA a 4% e PBS para localização proteica.
Resultados Principais
- Localização bem-sucedida de proteínas sinalizadoras dependentes de cálcio.
- Visualização de proteínas fosforiladas em estruturas celulares.
- Cinética definida da ativação de proteínas durante o desenvolvimento.
- Compreensão aprimorada da dinâmica de proteínas em embriões inteiros.
Conclusões
- As técnicas permitem o estudo detalhado da localização e ativação de proteínas.
- A imunomarcação em embriões de peixe-zebra é eficaz para pesquisas em biologia do desenvolvimento.
- Esses métodos podem fornecer informações sobre os mecanismos de sinalização celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imunomarcação de epítopos fosforilados em embriões inteiros de peixe-zebra permite a visualização direta da dinâmica de sinalização em órgãos ciliados, auxiliando na validação de alvos em vias de desenvolvimento. Esta abordagem fornece uma redução de riscos mecanicista ao associar modificações pós-traducionais a resultados fenotípicos em um modelo vertebrado. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao localizar proteínas ativadas, como a CaMKII fosforilada, em estruturas como a vesícula de Kupffer, rim e ouvido interno.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a localização de proteínas fosforiladas em células ciliadas.
- Valor Operacional: Confirma o engajamento do alvo por meio da co-localização com tubulina acetilada, um marcador de cílios.
- Valor Preditivo: Apoia a clarificação da via ao visualizar a ativação da sinalização dependente de cálcio no KV.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em peixe-zebra.
- Saída Quantitativa: Permite medições da intensidade de fluorescência de epítopos fosforilados em regiões anatômicas definidas.
- Escalabilidade: Permite o processamento de múltiplos embriões para detecção reprodutível de sinal entre diferentes condições.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Alinha-se a modelos de ciliopatias ao avaliar a sinalização dependente de cílios no KV e na orelha interna.
- Continuidade Translacional: Conecta mecanismos de sinalização embrionários a desfechos funcionais pós-natais.
- Avanço Ajustado ao Risco: Informa decisões de avançar/não avançar com base na modulação do alvo em tecidos em desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes, ao fornecer dados de ativação com resolução espacial em tecidos de vertebrados.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da visualização direta da localização de proteínas fosforiladas em estruturas embrionárias.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de imunomarcação padronizada de órgãos ciliados em preparações inteiras.
- Análises: Gera leituras quantitativas de fluorescência no vesículo de Kupffer (KV), rim e ouvido interno para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a sinalização de cílios embrionários a modelos pré-clínicos de ciliopatias e doenças renais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o mapeamento de epítopos fosforilados em diferentes estágios de desenvolvimento e modelos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar eventos de fosforilação à localização em cílios.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de fixação e incubação com anticorpos.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança na seleção de alvos ao validar a ativação da via in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados de sinalização embrionária.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em embriologia de peixe-zebra e técnicas de imunofluorescência.
- Depende de infraestrutura de microscopia confocal com ajuste de laser para detecção em dois canais.
- Necessita padronização da diluição de anticorpos e tempos de incubação entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes origens genéticas e estágios de desenvolvimento.
- Limitado pela sensibilidade da preservação de epítopos aos métodos de fixação, já que a PFA sozinha reduz o sinal de fosfo-CaMKII.
