Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

O objetivo geral deste experimento é quantificar a dinâmica da actina cortical por espectroscopia de correlação de imagem após aquisição por reflexão interna total, imagem de iluminação estruturada ou simulação de grama. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biofísico, como o papel que o fluxo de actina cortical tem na regulação das interações na sinapse imunológica. A principal vantagem da técnica é que ela combina resolução em escala nanométrica com compatibilidade de estilo de vida, permitindo que processos de menor escala sejam observados e analisados em comparação com as técnicas convencionais de microscopia de instância.

Demonstrando essa técnica estará George Ashdown, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para uma amostra de teste, adicione cinco microlitros de uma solução de estoque de microesferas fluorescentes de subdifração de 100 nanômetros de diâmetro à superfície de uma lamínula fresca não revestida. Em seguida, espalhe a solução de microesferas sobre a lamínula com uma ponta de pipeta e deixe secar.

Adicione 200 microlitros de meio de montagem à lamínula de teste para se preparar para o início da imagem, ligue a incubadora para o stage aquecedor do sistema SIM de grama e encha o reservatório com água destilada para cobrir totalmente a base do elemento de aquecimento. Deixe a água se equilibrar a 37 graus Celsius. Conecte o colar de aquecimento à lente objetiva e ajuste-o para 37 graus Celsius.

Em seguida, prenda o bloco de classificação compatível com relva 4 88 no caminho da luz do microscópio para garantir que o caminho óptico correto esteja engatado. Mude o modo de canal no leito do laser para a posição única. Repita esta ação para o cabo de fibra na platina do microscópio.

Espere ver um erro na janela do software se essas etapas não forem executadas. Depois de definir o modo, abaixe a objetiva para o plano Z mais baixo e coloque uma gota de óleo sobre ela. Coloque a lamínula da amostra de teste com as microesferas fluorescentes no microscópio stage.

Em seguida, selecione o sistema de foco perfeito ou a função PFS no corpo do microscópio. Mova a objetiva gradualmente para cima através do plano Z e pare quando o botão PFS parar de piscar, o que indica que o plano focal foi alcançado no software de controle. Mude para a visualização ao vivo para obter imagens das microesferas na tela.

Faça ajustes finos no foco usando a roda do micromanipulador PFS. Observe a iluminação uniforme sem submissão fluorescente fora de foco acima da onda de cheiro de 75 nanômetros. Finalmente, confirme se a iluminação estruturada é alcançada observando um padrão de iluminação flutuante da amostra de microesfera fluorescente para estimulação de células T lidar com as câmaras de um oito.

Poço de lamínula com 200 microlitros de mistura de anticorpos anti CD três e anti CD 28 e incube a lamínula por duas horas a 37 graus Celsius. Depois de lavar a lamínula conforme descrito no protocolo de texto, coloque-a no microscópio stage e encontre o plano focal da grama. Em seguida, pipete suavemente 200 microlitros de células T transfectadas em um dos poços da lamínula.

Use epifluorescência para rastrear as células transfectadas com actina GFP à medida que pousam na lamínula. Depois que as células estiverem estabilizadas, mude para o modo ao vivo usando o N SimPad e verifique se as células do monitor estão em foco. Para registrar um curso de tempo, abra a janela de aquisição ND e selecione a guia de tempo.

Em seguida, clique em adicionar e defina o intervalo para sem atraso. Defina a duração para 10 minutos. Por fim, comece a gravar os dados selecionando Executar agora na janela de aquisição de ND.

Para reconstruir as imagens, primeiro abra o software de análise que contém o módulo de análise correto. Clique em aplicativos e selecione a janela mostrar final do sim. Defina o contraste da modulação de iluminação e a supressão de ruído de alta resolução para um e reconstrua o conjunto de dados do relvado SIM para produzir uma imagem SIM completa a partir da barra de status da imagem.

Confirme se o tamanho do pixel é de 30 nanômetros e exporte os dados como arquivos TIF para análise de bastão. Depois de baixar e extrair o pacote de software MATLAB sticks, abra o script. Em seguida, defina os parâmetros de entrada conforme descrito no protocolo de texto para o filtro de remoção imóvel.

Na linha 23, defina o parâmetro de filtragem para média móvel e na linha 24, use 21 como o parâmetro de média de movimento para gerar um mapa vetorial. Defina a sub-região temporal na linha 31 para o número máximo de quadros, neste caso 63. Em seguida, na linha 32, defina o deslocamento temporal para um nas linhas 33 a 35.

Insira os nomes dos arquivos de saída, os títulos dos mapas vetoriais de saída e o caminho do diretório de saída. Em seguida, defina o formato em que as imagens do mapa vetorial devem ser salvas. Nesse caso, png.

Na janela do editor MATLAB, abra o script. Execute sticks de um canal e carregue a série de imagens executando as linhas de um a 23 do script. Em seguida, execute as linhas 29 a 35 de varas de um canal.

Para iniciar a análise do stick, siga o prompt e selecione um polígono para definir uma região de interesse ou ROI, se desejar. Para exibir os mapas vetoriais, execute as linhas 38 a 52. Em seguida, execute as linhas 53 a 72 para traçar o histograma de magnitude de velocidade mostrado aqui é uma célula T OT expressando GFP marcada com actina F, que foi fotografada com o protocolo turf sim.

Discutido no texto cinco minutos depois que esta célula foi introduzida em uma lamínula revestida com anticorpos anti CD três e anti CD 28 destinados a estimular a formação de sinapses imunológicas. Um curso de tempo foi feito para que o fluxo molecular de f actina pudesse ser visualizado. A análise subsequente desses dados usando este programa de bastões permitiu a quantificação do fluxo molecular de Factina, conforme representado por este mapa vetorial correspondente à região encaixotada da célula à esquerda, que representa uma porção da periferia da sinapse.

A ampliação adicional deste mapa e da sub-região de células T esclarece a direcionalidade e a velocidade do fluxo de actina, que podem ser determinadas a partir do comprimento do vetor, bem como do código de cores Os dados de velocidade também podem ser plotados em um histograma, permitindo a análise estatística. Coletivamente, esses resultados mostram que na sinapse imunológica a actina F flui de forma simétrica da periferia em direção ao centro celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como adquirir ts em dados e analisar a dinâmica da actina cortical usando espectroscopia de correlação de imagem.

Embora esse método possa ser usado para obter informações sobre o fluxo de actina durante a migração de células T, ele também pode ser usado em outros sistemas onde o fluxo molecular é considerado importante, como fazer a migração celular.