Name: Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprenda a analisar a retrotransposição de LINE-1 em nível de núcleo único usando hibridização in situ por fluorescência (FISH) em células HepG2. Este método permite avaliar com precisão as taxas e padrões de retrotransposição.

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Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (ES014443 e ES017274) e da AstraZeneca para a KSR.

NOTA: Todos os passos devem ser realizados à temperatura ambiente a menos que especificado de outra forma. Consulte a seção Reagentes para obter detalhes sobre como preparar reagentes individuais. 1. Rotulagem L1 Sondas NOTA: As sondas podem ser marcadas através de marcação química ou PCR. <ol><li> marcação química <ol><li> Adicione 0,7-1% de gel de agarose em Tris-acetato-EDTA (TAE) tampão, calor num forno de microondas até derreter, permitir que o gel arrefecer, e, em seguida adicionar brometo de etídio (0,5 ug / ml). Verter em tabuleiro de gel, adicionar pentes e para permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente. </li><li> Rotular a sonda Sneo (1-2 ug) com CY3 ou FITC a 37 ° C durante 1 hora de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: o S indica a Sneo pliced ​​gene neo micina expressa após um ciclo completo de retrotransposição. A sonda é ~ 1000 bp de tamanho. Sneo pode ser amplificado por PCR a partir de qualquer vector ou de genomADN IC. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre Estreptavidina-CY3 / reagentes de marcação FITC. </li><li> Misturar a solução de sonda Sneo marcado com tampão de carregamento de DNA 1x, a carga em cada poço e executar a 75-100 volts para 15-20 min. </li><li> Visualize a banda sonda usando um Ultra Violeta-Iluminador (UV). Note-se que o tamanho da sonda Sneo podem ser ajustados e que o bloqueio de ácido núcleos (LNA) pode também ser ser adicionado (Figura 2). </li><li> Corte sonda marcada Sneo a partir do gel com uma lâmina de limpeza, solubilizar e purifica-se a sonda Sneo a partir do gel utilizando um kit PCR Clean-Up de acordo com o protocolo do fabricante. CUIDADO: Tampa todas as partes expostas do corpo com escudos de proteção (isto é, casacos de laboratório e UV máscara clara) ao visualizar e cortando o gel. Veja a Tabela de materiais e reagentes para informação gel purificar produtos de PCR. </li><li> Re-run 5 mL de Sneo sonda marcada com uma sonda Sneo marcado com un em gel de agarose 0,7% (ver 1.1.1) para conaumento do tamanho firme e perda de intensidade de sinal (Figura 2). </li><li> Quantificar a quantidade de sonda etiquetada Sneo através da medição da absorvância a 260 nm e diluir a sonda Sneo a 10 ng / mL alíquotas em nuclease livre H 2 O. alíquotas armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> PCR Labeling (método alternativo para a rotulagem de sonda) <ol><li> Combinar iniciadores específicos Sneo (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;e 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) com reagentes de PCR num único tubo: 13,6 ul de nuclease livre H 2 O; 0,1 ul de dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 jil dTTP (10 nM); 0,05 ul de dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul Ir Tag 5x tampão; 0,4 ul Ir Tag polimerase; 1 ul Sneo molde (10 ng). Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre reagentes de PCR. </li><li> Ajustar a quantidade de cada reagente, multiplicando pelo número total de amostras. </li><li> Use o seguinte parâmetro de ciclismo PCRs para amplificar e etiqueta Sneo sondas: 95 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; 72 ° C durante 2 min; Manter a 4 ° C indefinidamente. NOTA: A temperatura de recozimento pode ser ajustado ou PCR gradiente pode ser concluída para determinar temperaturas de recozimento ideais para outras sondas. </li><li> Faça gel 0,7-1%, como no ponto 1.1.1, carga e visualizar a banda sonda como no ponto 1.1.4. </li><li> Corte e purificar a sonda Sneo rotulado como no ponto 1.1.5. </li><li> Re-run 5 mL de Sneo sonda marcada com sonda Sneo marcado com un para confirmar aumento do tamanho e perda de intensidade do sinal (veja a Figura 2). </li><li> Quantificar a quantidade de sonda Sneo marcado por absorvência de medição a 260 nm e diluir sonda Sneo a 10 ng / mL alíquotas em nuclease H 2 O. livre </li></ol></li></ol> 2. Preparar Spreads cromossômicas <ol><li> Gerar clones estáveis ​​expressando estrutura do vector (control) ou L1 retrotransposição competente, utilizando metodologias padrão de selecção. 12,16 Enquanto repórteres não epissómicos foram usadas para correlacionar os achados com estudos de transcrição, também poderiam ser utilizados vectores epissomais. Cultivar células que expressam de forma estável o controle ou vector L1 (1 x 10 6 células por placa de 10 cm, com ajustes no tamanho da placa feitas conforme necessário) em meio de crescimento completo. Para as células HepG2, utilizar meio RPMI-1600, 10% de FBS e 200 ug / ml de higromicina. Crescer as culturas a 70% de confluência a 37 ° C e 5% de CO 2. NOTA: A escolha do meio de crescimento é dependente do tipo de célula. Dado que os plasmídeos aqui utilizados para transportar cassetes de selecção tanto higromicina e neomicina, a selecção de clones estáveis ​​de também poderia ser feito com neomicina após selecção em higromicina, mas a quantidade de neomicina tem de ser optimizado para estabelecer os níveis de tolerância para cada tipo de célula. </li><li> Adicionar colcemida (0,4 ug / ml) ao meio de cultura e incuba-se durante 90 min para reter as células na metaphase. Se usando diferentes tipos de células para determinar a concentração óptima de colcemida e tempo de exposição (60, 90, e 120 min) para prisão da metafase óptima empiricamente. </li><li> Lavar as células 2x com 10 ml de PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize por adição de 3-5 ml de solução de tripsina a 0,25% para as células e incuba-se durante 5 minutos para separar as células. Inactivar a tripsina com uma quantidade igual de meio contendo 10% de FBS. </li><li> Centrifugar as células durante 2 min a 1000 xg, a 4 ° C, aspirar o meio a partir da pelete de células e lava-se as células com DPBS. Aspirar todos os DPBS, deixando 200 mL de DPBS para voltar a suspender as células. células assegurem são misturados bem e que todos os aglomerados estão dispersos. Use cintilação ou pipetagem suave para misturar e dispersar aglomerações e evitar vórtex. </li><li> Adicionar 5 ml de solução hipotónica (isto é, KCl a 75 mM) que é pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota enquanto se roda o tubo de 15 ml horizontalmente e incubar a 37 ° C durante 20 min. Veja a Tabela de Materiais e Reagents para obter informações sobre como obter e fazer a solução hipotônica. </li><li> células centrifugar a 120 xg durante 5 min a 4 ° C e os passos de repetição 2,4-2,5 3x deixando aproximadamente 200 ul de solução hipotónica para re-suspender as células após cada lavagem. Certifique-se de que no final dos 3 lavagens, o sedimento é visivelmente branco e inchado. </li><li> Re-suspender o sedimento em 200 ul de solução de Carnoy fixador e fazer 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluições em solução de Carnoy fixador. Queda de 10 ul de cada diluição numa lâmina limpa seca de aproximadamente 1 cm acima e expor imediatamente a lado sem se espalhar para o vapor quente da água fervente por 30 segundos. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como fazer a solução de Carnoy fixador. </li><li> Secam-se as propagações à temperatura ambiente, mancha com 0,1 ug / ml de Hoechst-33342 por imersão durante 15-20 min em frasco Coplin e lavar 3x com DPBS. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como fazer a solução Hoechst-33342. </li> &lt;li&gt; Ver espalha em microscópio de fluorescência / de contraste de fase de 40x de ampliação. Depois de otimizar a preparação propagação, os spreads não precisam ser marcadas com Hoechst-33342. Ver se espalha em microscópio de contraste de fase em aumento de 10x para determinar a qualidade disseminação e separação, conforme descrito na seção Resultados (ver Figura 3). </li><li> Escolha e circundar boas para barrar com um diamante ponto do marcador no lado oposto da lâmina (isto é, livre espalhar-lado). </li><li> Loja dissemina-se a -20 ° C durante até um mês. Evitar a exposição à umidade. </li></ol> 3. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) <ol><li> A estabilização e a desidratação de barrar NOTA: Equilibrar cromossoma metáfase se espalha até à temperatura ambiente, se for armazenado a -20 ° C. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como obter e fazer reagentes. <ol><li> Incubar cromossoma metáfase espalha com 200 ul de ARNase A durante1 h a 37 ° C. </li><li> Lavagem das lâminas em tampão SSC 2x-duas vezes durante 5 min cada seguido por lavagem com solução de HCl 10 mM. </li><li> Incubar barrar com 1% de pepsina durante 10 min a 37 ° C, lavar com H 2 O desionizada e lava-se duas vezes com tampão 2 x SSC-durante 5 min cada. </li><li> Incubar barrar com 4% de paraformaldeído durante 10 minutos e lava-se em tampão SSC 2x duas vezes durante 5 min cada. </li><li> Desidratar espalhar por incubação durante 2 min em série de etanol: 70%, 80%, e 95% de etanol. </li><li> lâminas de ar seco. </li></ol></li><li> Hibridação espalha com sondas retrotransposição marcado com L1 (ou seja, Sneo) CUIDADO: Para sondas diretas marcado, manter afastado de luz em todos os momentos. Veja a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como obter e fazer reagentes. <ol><li> Adicione 30 ng de Sneo de tampão de hibridação, aquece-se a 72 ° C durante 10 min e arrefecer durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 30 ml de solução de sonda Sneo para each spread, cubra com lamela e selar as bordas com cimento de borracha. Garantir que não haja formação de bolhas. </li><li> Aquecer a lâmina a 72 ° C durante 5 min num bloco de aquecimento, gradualmente, baixar a temperatura para 37 ° C e incubar durante a noite numa câmara humidificada escuro a 37 ° C. </li></ol></li><li> Lavar e visualizando (ou adição de anticorpo secundário) CUIDADO: Para sondas diretas marcado, manter afastado de luz em todos os momentos. NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e Reagentes para obter informações sobre como se preparar. Uso de um volume suficiente para cobrir toda a propagação cromossoma é recomendado. Lembre-se que o excesso de volume será perdido quando lamela é adicionado. <ol><li> Imergir as lâminas em tampão SSC 2x para remover lamelas. </li><li> Lavagem das lâminas por imersão em tampão SSC 2x-a 45 ° C durante 5 min. </li><li> Lavagem das lâminas por imersão em tampão de lavagem a 45 ° C durante 5 min, 2x. </li><li> Lavagem das lâminas por imersão em tampão SSC 0,1 x a 45 ° C durante 10 min. </li><li>Lavagem das lâminas por imersão em 2X tampão SSC a 45 ° C durante 10 min. NOTA: Coloque um frasco Coplin contendo tampão recomendado num banho de água, ajustar a temperatura a 45 ° C. </li><li> Frescos lâminas à temperatura ambiente e equilibrar as lâminas em tampão de detecção. </li><li> Para sondas marcadas diretos, pule para o passo 3.4.10. </li><li> Para sondas marcadas indirectos, bloco em tampão de bloqueio durante 20-30 min e lava-se 3x em DPBS. </li><li> Incubar com 50 uL de anticorpo secundário (por exemplo, 5 ug / ml de estreptavidina-FITC, ou αCY3 em tampão de bloqueio) durante 1 h. </li><li> Lavar as lâminas em 2x SSC durante 5 minutos duas vezes. </li><li> Contracoloração com Hoechst-33342 solução (0,1 ug / ml) durante 10 min. NOTA: Esta coloração é feito para manchar cromossomos para co-localização com a sonda. </li><li> Lavar em DPBS 3x, adicione uma gota de meio de montagem, coloque uma lamela e selar as bordas com unha polonês. </li><li> Analisar L1 retrotransposição usando microscópio de fluorescência em 40X magnification. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver potenciais interesses concorrentes.

Metodologias como toda a sequenciação do genoma, PCR inversa e transferência de Southern foram utilizados para estudar L1 retrotransposição. Embora estas metodologias são extremamente valiosas na localização onde ocorrem inserções de L1 dentro de genomas, um desafio de confusão para todos eles, é a necessidade de programação in silico para montar sequências. A metodologia aqui descrita FISH foi concebido para complementar estes métodos, especialmente no caso dos estudos que requerem a...

Humano longo Intercaladas Nuclear Elemento-1 (Linha-1 ou L1) é um elemento móvel autônomo que se propaga dentro do genoma através de um &quot;copiar e colar&quot; mecanismo de retrotransposição. Um L1 humano típico é ~ 6 kb de comprimento e é composto por uma 5&#39;UTR (região não traduzida) que serve como um promotor, duas grelhas de leitura abertas (ORFs): L1 e L1 -ORF1 -ORF2, e um 3&#39;UTR com um poliA . -ORF1 cauda proteína L1 tem três domínios distintos: um domínio de bobina da bobina, ARN reconhecimento do motivo e domínio C-terminal, enquanto que a proteína L1 -ORF2 tem endonuclease, transcriptase reversa e rico em cisteína domínios 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 exibe actividades chaperonas de ácido nucleico, enquanto L1 -ORF2 fornece actividades enzimáticas, com ambas as proteínas necessárias para a retrotransposição 1,2,6. Um ciclo de L1 retrotransposição começa com a transcrição da 5&#39;UTR de L1 </em&gt; ARNm bicistrónico pela ARN-polimerase II, a translocação para o citoplasma, e a tradução. No citoplasma, L1 -ORF1 exposições quer ligaï¿½o ao cis em que empacota o seu próprio RNA ou trans onde ligaï¿½o ao empacota outros ARN (isto é, forma de seno / Svas / pseudogenes) para formar uma partícula ribonucleoproteica (RNP) com L1 -ORF2p 7, 8. RNP translocar para o núcleo, onde a actividade de endonuclease de L1 -ORF2p cortes de ADN genómico (ADNg) para expor um OH - Grupo 9, que por sua vez é usado por transcriptase reversa para escorvar e reverso de ARN a sintetizar ADN a partir da extremidade 3 &#39;. Durante a síntese inverso, a segunda cadeia de ADN é cortado 7-20 pb a partir do site original nick para criar quebras escalonados que são preenchidos para formar a assinatura sequências de inserção L1 (por exemplo, TTTTAA) chamados duplicações no local alvo (TSD) 9,10. Este processo é conhecido como o principal alvo da transcrição reversa (TPRT) e leva a insertina de cópias completas ou truncadas de L1 / outros ADNs com TSDs em ambas as extremidades da sequência inserida. L1 retrotransposição também tem sido mostrado para ser mediada através TPRT semelhante de extremidades não homólogas-se juntar, em alguns tipos de células 11. O vector de L1 retrotransposição empregue nos nossos estudos é não-epissomal e consiste em etiquetado L1 -ORF1 &amp; 2p impulsionado por promotores CMV-L1-5&#39;UTR combinadas (Figura 1) 12. As versões anteriores desta construção foram descritos em estudos utilizando leveduras e culturas de células humanas 13,14,15. Dois promotores de CMV distintas localizadas nas extremidades 5 &#39;e 3&#39; do vector, com a extremidade 3 &#39;colocado na orientação inversa, para dirigir a expressão da neomicina após splicing e integração. A cassete de indicador retrotransposição na extremidade 3 &#39;de um composto anti-sentido do gene inserido a neomicina L1 -ORFs e tornada inactiva por separação em duas metades por uma globno intrão com splicing dador (SD) e locais de splicing aceitador (SA) (Figura 1). Após a integração num cromossoma, L1 é transcrito a partir do promotor comum para produzir um ARNm que consiste de um ARNm bicistrónico e ARNm neomicina inactivo. Durante o processamento de ARN, o intrão de globina é spliced ​​out do gene da neomicina para restaurar um gene da neomicina totalmente funcional. O ARNm híbrido é embalada em uma RNP em cis e translocado para o núcleo, onde ele é integrado no genoma como qualquer um de comprimento completo ou truncadas, utilizando inserções TPRT. Aqui nós descrevemos uma metodologia que utiliza hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas especificamente dirigidas ao gene neomicina emendado (Sneo) para rastrear padrões de -retrotransposiition L1 e as taxas de inserção no nível de núcleo único. A eficiência e especificidade da detecção foi confirmada usando retrotransposição competente e construções incompetentes e sondas para detect Sneo ou a neomicina e globina junção intron 16. Esta metodologia é responsável por algumas das deficiências de ensaios retrotransposição base de cultura de células, tais como várias inserções, resistência à colónia e expansão clone favorável.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sondas de Rotulagem</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polimerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x tampão incolor</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Ajuste a concentração de dATP, dGTP, dCTP para 2&nbsp; mM e dTTP para 1,5&nbsp; mM em água livre de nuclease.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotina (0,5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Rotulagem de PEIXES MIRUS</td><td></td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Rotulagem de PEIXES MIRUS</td> Kit de Limpeza <td>de PCR NucleoSpin MIR3225</td><td></td><td>MIRUS</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Qualquer reagente limpo de PCR pode ser usado no lugar do kit de limpeza de PCR NucleoSpin</td></tr> Máquina <tr><td>de PCR</td><td></td><td></td><td>Qualquer máquina termocicladora pode ser usada para amplificar o produto de etiqueta.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Preparando Spreads Cromossômicos</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Adicionar Colcemid diretamente ao meio de crescimento até uma concentração final de 0,4&nbsp; &micro; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Diluir 1&nbsp; M KCl solução para 75&nbsp; Solução mM para fazer Solução Hipotônica</td></tr><tr><td>Solução Fixadora</td><td></td><td></td> Carnoy <td>Misture 3 volumes de metanol e 1 volume de ácido acético para fazer Solução Fixadora Carnoy. Faça fresco todas as vezes.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolver Hoechst-33342 em PBS até a concentração final de 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Marcador de Ponto de Diamante</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Foscas</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Para detechar células, incube a célula em tripsina por 5 min e inativa com igual volume de meio completo.</td></tr><tr><td>Corrediças de cobertura</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Qualquer bloco de calor pode ser utilizado para este fim, embora sejam recomendados blocos para aquecimento de corrediças.</td></tr><tr><td>Copo (600&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Encha o copo com água, aqueça para ferver, use o vapor quente para estourar os cromossomos.</td></tr><tr><td>Microscópio Nikon</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>Qualquer microscópio pode ser usado para observar a qualidade da propagação.</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes e Materiais para FISH</td></tr><tr><td>Citrato trissódico</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Criride de sódio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfato</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissolver Hoechst-33342 em PBS até a concentração final de 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Cimento de Borracha/Selante Cytobond&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Sete Frascos Coplin</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Umidificada Escura</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Cobertura</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de Calor Digital Seco</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>de Fluorescência</tr><tr><td>20x Citrato de Sódio-Salino (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Combine 175 g de NaCl e 88,2&nbsp; g de citrato trissódico com 800 ml de H2O. Agitar enquanto regula para pH 7. Assim que todos os sais se dissolverem, ajuste o volume para 1 L e filtre através de 0,22 &micro; m Papel de filtro. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml de Rnase A</td><td></td><td></td><td>Diluir 20x tampão SSC para 2x tampão SSC. Dissolva a RNase A em 2x tampão SSC até uma concentração final de 1&nbsp; mg/ml. Faça uma nova solução todas as vezes.</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td></td><td></td> a 1% <td>Dissolva a pepsina (W/V) em HCl 10 mM até uma concentração final de solução a 1%. Faça sempre fresco.</td></tr><tr><td>4% de Paraformaldeído (4% PFA)</td><td></td><td></td> <td>Pese 4,0 g de PFA na capela de exaustão, adicione 50 ml de 1xPBS, aqueça a 60&nbsp; &deg; C enquanto mexe e ajuste o pH com gotas de NaOH até que todo o PFA se dissolva e a solução fique límpida. Ajuste o volume para 100&nbsp; ml, filtre através de 0,22 &micro; m Papel de filtro e armazene alíquotas de 5 ml a -20&nbsp; &deg;C. Alíquota de descongelamento de PFA em 37 &deg; C por 10-15 min para usos subsequentes. Ajuste o tamanho do filtro dependendo da quantidade de paraformaldeído.</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>de lavagem Combine 100 ml de formamida (20%) com 2,5 ml de 20x SSC, ajuste para pH 7 com 1,0 M HCl e leve o volume para 500 ml com grau molecular H2O.</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de hibridização <td>Combine 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 0,1% de SDS e 300 ng/ml de DNA de esperma de salmão em 2x tampão SSC. A quantidade de formamida determina o quão focadas são as cromátides; titular a quantidade.</td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td> de detecção <td>Dilua o buffer SSC de 20x para 4x e adicione 0,2% de Tween-20 para fazer o buffer de detecção.</td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio</td><td></td><td></td><td>Combine albumina de soro bovino (BSA) a 5% com Tween-20 a 0,2% em tampão SSC 4x.</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td>desidratante</td><td>Faça soluções de etanol de 70%, 80% e 95%.</td></tr></tbody></table>

análise de line-1 retrotransposição no núcleo de nível único

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

O elemento nuclear intercalado longo-1 (Linha-1 ou L1) é responsável por aproximadamente 17% do DNA presente no genoma humano. Embora a maioria dos L1s esteja inativa devido a truncamentos de 5 ', ~ 80-100 desses elementos permanecem competentes para retrotransposição e se propagam para diferentes locais ao longo do genoma por meio de intermediários de RNA. Embora se acredite que os L1s mais antigos tenham como alvo regiões ricas em AT do genoma, os alvos cromossômicos de L1s mais novos e ativos permanecem mal definidos. Aqui descrevemos a metodologia de hibridização in situ de fluorescência (FISH) que pode ser usada para rastrear padrões de inserção de L1 e taxas de incorporação ectópica de L1 no nível de núcleo único. Nesses experimentos, sondas de neomicina marcadas com isotiocianato de fluoresceína / cianina-3 (FITC / CY3) foram empregadas para rastrear a retrotransposição de L1 in vitro em células HepG2 expressando de forma estável L1 ectópica. Essa metodologia evita erros na estimativa das taxas de retrotransposição impostas pela toxicidade e leva em conta a ocorrência de múltiplas inserções em um único núcleo.

Um diagrama esquemático do vector de retrotransposição L1 é apresentado na Figura 1. O vector consiste em um gene da neomicina em orientação anti-sentido para L1 ORFs que é interrompida por um intrão de globina em orientação com sentido e colada por DP Sites e SA. Quando integrado de forma estável no cromossoma, L1 ARNm é transcrito a partir do promotor de CMV e combinado L1-5&#39;UTR (Figura 1). Durante o processamento de ARN,...

Aqui nós utilizamos a metodologia FISH para rastrear LINE-1 retrotransposição no nível núcleos único dos spreads de cromossomos de linhas celulares HepG2 expressam de forma estável LINE-1 sintético.

Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e analisar as taxas e padrões de retrotransposição de L-1 no nível de núcleo individual utilizando hibridização fluorescente in situ, ou FISH. A principal vantagem desta metodologia é o fato de permitir que o pesquisador evite superestimar ou subestimar as taxas e padrões de retrotransposição, e, quando complementada com outras metodologias, permite o estudo da retrotransposição de L-1 no nível de núcleos individuais. Realizando este procedimento hoje está o Dr. Pasano Bojang, pesquisador sênior do laboratório.Para começar, após preparar um gel de agarose de 0,7% a 1% em tampão TAE conforme o protocolo descrito no texto, marque a sonda SNeo com CY3 ou FITC e incube a 37 graus Celsius por uma hora, conforme instruções do fabricante. Misture a solução da sonda SNeo marcada com tampão de carregamento de DNA 1X e aplique nos poços do gel de agarose. Em seguida, execute a eletroforese a 75 a 100 volts por 15 a 20 minutos.Utilizando um iluminador UV, visualize a banda da sonda. Com uma lâmina limpa, corte a sonda SNeo marcada do gel. Em seguida, utilize um kit de purificação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante para solubilizar e

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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