Name: Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a analisar o perfil transcricional de embriões bovinos pré-implantação usando microarray de duas cores com baixa quantidade de RNA. Este método permite estudar a expressão gênica em nível de picogramas e avaliar fatores que afetam a qualidade embrionária.

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Pesquisa apoiada pela Agência de Pecuária e Carne de Alberta, Alberta Inova - BioSolutions, Ramo de Pesquisa de Leite e Pecuária de Alberta, Agricultura e Silvicultura de Alberta.

A parte animal desse estudo foi realizado na Unidade de Investigação Metabólica da Universidade de Alberta, Edmonton, Canadá, com todos os procedimentos experimentais em animais aprovado (Protocolo # AUP00000131) pela Universidade de Alberta Animal Care e do Comitê Use, e os animais tratados de acordo ao Conselho canadense de diretrizes animal Care (1993). 1. Produção de Embriões, Isolamento de RNA total e Tratamento DNase <ol><li> Para protocolos experimentais de animais e de colheita de embriões se referir em nossas publicações anteriores 17, 18. </li><li> Piscina e encaixe congelar embriões estágio similar de cada vaca em nitrogênio líquido e, em seguida, manter a -80 ° C até a extração de RNA. </li><li> Extrair o ARN total por meio de um estojo de extracção de ARN baseada em coluna, que permite extrair o ARN a partir de amostras escala Pico (kit de informação está disponível na lista de materiais). NOTA: Recomendado kit contém: Condicionado Tampão, Extração Buffer, 70% de etanol, tampão de lavagem 1, tampão de lavagem 2, tampão de eluição, colunas de purificação de RNA com tubos de coleta e microtubos. </li><li> Adicionar 10 ul de tampão de extracção contendo embriões de tubo e incubar durante 30 min a 42 ° C. tubo de centrifugação a 800 xg durante 2 min para recolher o extracto de células no tubo de microcentrífuga. </li><li> Pipetar 250 mL de buffer Condicionado para a membrana do filtro de purificação de coluna. Incubar a coluna de purificação de ARN com tampão condicionado durante 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a coluna de purificação no tubo de recolha a 16.000 xg durante 1 min. </li><li> Pipetar 10 ul de 70% de etanol com a mistura de ARN Tampão de Extracção e embriões. Misture bem, pipetando cima e para baixo. mistura pipeta na coluna de purificação pré-condicionados. </li><li> Para ligar ARN, centrifugar a coluna de purificação de 2 min a 100 xg e segue-se imediatamente através de uma centrifugação a 16000 xg durante 30 segundos para remover o fluxo através. </li><li> pipeta 10081; L de tampão de lavagem 1 para a coluna de purificação e centrifugar durante 1 min a 8000 x g. NOTA: DNase tratamento é recomendado se realizar a transcrição reversa ou amplificação após o isolamento do RNA. </li><li> Digerir o ADN genómico direita após o passo 1.8. NOTA: Recomendado kit DNase está disponível na lista de materiais. kit recomendado contém: solução de DNase I e solução tampão. </li><li> Prepare a mistura de incubação com DNase por mistura de 5 mL de ADNase I solução de reserva com 35 mL de buffer. Misture invertendo suavemente. </li><li> Pipetar a pL de DNase mistura de incubação de 40 directamente para a membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Pipetar 40 ul de tampão de lavagem 1 para a membrana da coluna de purificação e então centrifugar a 8000 xg durante 15 s. </li><li> Tampão Pipetar 100 mL de lavagem 2 para a coluna de purificação e centrifugar durante 1 min a 8000 x g. </li><li> Pipetar outro 100 uL de tampão de lavagem 2 para a coluna de purificação e centrifugardurante 2 minutos a 16.000 x g. </li><li> Transferir a coluna de purificação para um novo tubo de microcentrifugação de 0,5 mL. Pipetar 11 ul de tampão de eluição directamente para a membrana da coluna de purificação. Para garantir a absorção máxima de tampão de eluição na membrana, tocar suavemente a ponta da pipeta para a superfície da membrana, enquanto a distribuição do tampão de eluição. </li><li> Incubar a coluna durante 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a coluna durante 1 min a 1000 xg para distribuir tampão de eluição na coluna, e em seguida girar durante 1 min a 16.000 xg, para eluir o ARN. </li><li> Use Bioanalyzer instrumento de acordo com as instruções do fabricante para avaliar a qualidade e quantidade de ARN de 19. </li><li> Armazenar a amostra de ARN a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. RNA amplificação e Rotulagem de Análise de Microarray NOTA: Para o primeiro usuário tempo de trabalho com procedimentos de amplificação de RNA e de rotulagem, use cinco ng de pico-in RNA along com as amostras reais arna para controlar a medição da amplificação de ARN e hibridação de controlo de qualidade. O pico-in mix RNA contém dez in vitro sintetizados, transcrições poliadenilados em proporções predeterminadas. Quando o procedimento realizado adequadamente, as transcrições rotulados especificamente hibridizam apenas para sondas de controlo complementares em matrizes e os dados podem ser digitalizados para rastrear garantia de controle de qualidade com a auto-mínimo ou hibridação cruzada. Mais detalhes descrição sobre o procedimento cravado-in intensidades de controle e normalização após a digitalização da análise da matriz e de dados é referir-se a publicações anteriores 20, 21. O procedimento que se segue é dada para os utilizadores de microarranjos de rotina. <ol><li> Prepare (valor de número de ARN Integridade (NIR), pelo menos&gt; 7,0) de 100 pg de alta qualidade amostra de ARN num volume total de 10 - 11 mL. </li><li> Amplificar a amostras de ARN com um estojo de amplificação de ser capaz detrabalhar com amostras escala pico (tão pouco quanto 100 pg). NOTA: Recomendado informações kit de amplificação está disponível em Lista de materiais e segue as instruções do fabricante, sem qualquer modificação. </li><li> Usar uma quantificação à base de fluorescência para avaliar o perfil da gama de tamanhos do ARNA amplificado. </li><li> Utilizar o instrumento de espectrofotômetro (com base na absorvância a 260 e 280 nm) para medir a concentração da ARNA amplificado. </li><li> Armazenar o ARNA amplificado a -80 ° C até estar pronto para rotulagem. </li><li> Use 2 mg de RNA amplificado para marcação fluorescente de acordo com o guia do usuário ULS ARNA kit rotulagem. NOTA: Uma vez que Cyanine 547 e 647 Cyanine corante são sensíveis a foto-degradação e Cyanine 647 corante é facilmente degradada pelo ozono, o procedimento de marcação tem lugar em uma quantidade mínima de luz e sob um ambiente livre de ozono. </li><li> Ligue a caixa de ozono (Figura 1A) até que o nível de ozono é de 0,001 ppm. </li><li&gt; fazer a configuração de reacção dentro da caixa de ozono (Figura 1B) por adição de 2 ul de Cianina 547 ou Cianina 647, 2 uL de tampão de marcação, e, em seguida, ajustar para um volume final de 20 mL com água sem RNase sob a luz de segurança. Adicionar filtro de câmara escura para a fonte de luz. </li><li> Misturar suavemente e incuba-se os tubos em um termociclador a 85 ° C durante 15 min. Colocar as amostras em gelo durante pelo menos 1 min. Girar para baixo para recolher o conteúdo de tubos, antes de prosseguir com o estojo de extracção de ARN, excepto passos relacionados com tratamento de DNase (1,9-1,11), para limpar o ARN amplificado Cy-corante-rotulados. </li><li> Utilizar o instrumento espectrofotómetro para medir e determinar a concentração de ARN amplificado marcado e manter o ARNA marcado à temperatura de -80 ° C no máximo durante 3 dias antes da utilização. </li></ol> 3. Microarray hibridação e de lavagem NOTA: Os seguintes passos importantes são adaptados de acordo com duas cores à base de Microarray Gene Expression Análise de Protocolo (versão6.5, maio de 2010). <ol><li> Adicionar uma quantidade igual de 825 ng de cada Cyanine 547- e Cyanine 647 marcado ARNA e misture com 25x e 10x fragmentação buffers de bloqueio. </li><li> Aquecer a mistura a 60 ° C durante 15 minutos e arrefece-se em gelo durante 1 min. </li><li> Adicionar uma quantidade igual de 2x tampão de hibridização e misturar bem. </li><li> Centrifuga-se a 13000 rpm, em seguida, a mistura está pronta para hibridação. </li><li> Carga de 100 mL da mistura sobre a lâmina de matriz e vedar a corrediça no interior da câmara de hibridação. </li><li> Carregar a câmara montada no forno de hibridação durante 17 h a 65 ° C em rotação a 10 rpm em forno. </li><li> Lave as matrizes de acordo com o protocolo com tratamento de protecção de ozono por imersão em solução de estabilização e secagem durante 30 s. </li><li> Retirar as matrizes a partir da solução e certificar-se da superfície da matriz é seca com as partículas de poeira não há </li></ol> 4. Digitalização Microarray Deslize <ol><li> Mantenha as matrizes no lugar escuro e ligue scannER até que esteja pronta a utilizar (15 min de tempo de espera). </li><li> Coloque o código de barras matriz na esquerda, no scanner e iniciar a digitalização. Fazer a análise local de acordo com o guia do usuário do software e salvar os dados como (GPR) formato de arquivo. </li></ol> 5. Análise Estatística <ol><li> Faça o download do software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Clique em &quot;dados brutos de importação&quot; e carregar os arquivos de GPR em FlexArray. </li><li> Realizar a normalização e a análise estatística, se necessário, seguindo as instruções. Nota: o cálculo do limiar para a seleção local positiva neste estudo como foi descrito anteriormente 22. </li><li> Selecione no menu suspenso o manual do visualizador gráfico da FlexArray para ver todos os pontos cruzados e sinais de fundo. Nota: Um quadro semelhante das cravado nos controlos, após hibridação com o micro-arranjo pode ser visto no estudo anterior 8. </li><li> Selecione umanormalização Loess dentro matriz seguinte por um quantil entre o processo de matrizes normalização do FlexArray suspensa manual de conformidade. </li><li> Exportar todos os dados normalizados de FlexArray em um arquivo do Excel para posterior utilização. </li></ol> 6. Análise Bioinformatics A anotação original das sequências de sondas de transcrições específicas de embriões bovinos (BESTv1) microarray foi descrita anteriormente 8. No presente estudo, foram obtidos 20,403 símbolos único gene (GS) ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Suplemento File1</a> ) através do Sistema de Gestão EmbryoGENE Laboratório de Informação (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Uma lista de 6.765 genes únicos ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">Suplemento File2</a> ) foi seleccionado e correspondiam aos sinais positivos após todo processo de normalização de microarray (Passo 50,5) a partir do dia 7 gene embriões perfil de expressão bovina. Limite sinal positivo foi calculado com base na publicação permeável 16 da intensidade do sinal de um valor A. <ol><li> Para realizar a análise funcional com PANTHER (análise de proteínas através de relações evolucionárias) Classification System 23, 24, abra o seguinte link (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li> Carregar uma lista de 6.765 GS específicas do embrião para identificar processo biológico específico durante o desenvolvimento embrionário por meio do teste sobre-representação estatística e usar a configuração padrão do Bos taurus (todos os genes no banco de dados), como lista de referência 25. NOTA: Este permite a identificação de processos de desenvolvimento relacionadas com a de os termos GO que são estatisticamente super ou sub-expresso utilizando um teste binomial. </li><li> Definir limite P-valor em &lt;0,05 como padrão de software. Os dados podem ser baixados e exported em arquivo de Excel para posterior selecção 16. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

O primeiro problema a realizar análise de microarray utilizando Dia 7 embriões não é obter quantidades suficientes de ARN de alta qualidade para estudar a expressão do gene. extração de RNA fenol tradicional / clorofórmio e método de precipitação de etanol não é recomendado para o dia 7 embriões, resultando em baixo rendimento e possíveis fenol restante inibir reação de amplificação de ARN. Em vez disso, um método baseado em coluna padrão é melhor para isolar o ARN total e, em seguida, eluir o ARN com tampão de eluição ...

Perda embrionária precoce em vacas leiteiras de alta produção é um dos principais desafios para a indústria de laticínios 1, 2. Bovine tornou-se um modelo interessante para estudar o desenvolvimento pré-implantação do embrião humano devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante 3, 4. No entanto, é necessária mais investigação para ter uma melhor compreensão sobre genes envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos. Depois de vinte anos desde a primeira tecnologia de microarray desenvolvido em 1995 5, o desenvolvimento da tecnologia de fabricação sonda erros de impressão reduzidos mais sofisticados e variabilidade de chips de matriz dentro e entre diferentes plataformas de microarray 6. Tecnologia de microarray melhorou amplamente resultou numa aplicação desta tecnologia em investigação clínica 7 e, mais recentemente, no embrião inicial Qavaliação ualidade 8. A grande quantidade de material necessário para a tecnologia de microarray é a principal razão pela qual a tecnologia de microarrays inicialmente não conseguiu introduzir um número de campos de pesquisa, como o desenvolvimento embrionário inicial. Mais recentemente, métodos de amplificação de ARN foram melhorados para amplificar ARN linearmente até ao nível de sub-microgramas nanograma material de partida ARN 9. Existem vários kits de amplificação de ARN comerciais disponíveis no mercado; no entanto, os mais populares kits bem desenvolvidos estão relacionados com Ribo-Single Primer isotérmico amplificação 10 e promotor T7 conduzida 11 métodos. O mais popular de amplificação anti-sentido de ARN utiliza na transcrição in vitro com um iniciador oligo dT de ligação a um promotor de T7 na extremidade 5 &#39;12. Esta tecnologia permite a manutenção da maior parte dos transcritos anti-sentido representativas após amplificação linear fou matrizes de hibridação 13. Este método foi adaptado para amplificar nível picograma de RNA total extraído de embriões de bovino 8. Universal Linkage System (ULS) é o método de marcação que incorpora diretamente o DNA ou RNA amplificado com corante fluorescente ligada à platina quer Cyanine 547 ou Cyanine 647, formando uma ligação de coordenação sobre a posição N7 de guanina 14. Este método foi adaptado em investigação embriões para gerar mais estável, sem modificação ARNA amplificado em comparação com o aminoallyl ARNA modificada gerado pelo método enzimático 15. tanto métodos de corante único e rotulagem dois corantes foram adaptados usando Universal sistema de ligação em microarray. Um grande estudo comparações microarray foi que há uma boa correlação da qualidade dos dados entre as plataformas de matriz de um e dois de cor 6. Recentemente, tanto unidade promotor T7métodos de amplificação N ARN anti-sentido e de rotulagem ULS têm sido desenvolvidos para proporcionar um protocolo mais fiável para gerar uma quantidade suficiente de materiais de alta qualidade marcado arna para hibridação microarray 8, 16. Portanto, este estudo fornece um protocolo para demonstrar algumas das etapas importantes de extração de RNA para análise de dados envolvidos em microarray de duas cores utilizando Dia 7 embriões bovinos como um exemplo.

<table><tbody><tr><td>Kit de Isolamento de RNA PicoPure</td> Conjunto <td>de</td> DNase Livre de RNase KIT0204 <td></td>da <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>(50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Kit Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td> Instrumentos <td>Bioanalyzer KIT0505</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 da Applied Biosystems</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Tela de RNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Kit de Rotulagem Fluorescente</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Microarrays de Expressão Gênica Personalizada</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression tampão de lavagem 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Parte #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression tampão de lavagem 2</td><td>Peças da Agilent Technologies</td><td>Parte #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Buffer de Hibridização</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Parte #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Buffer de fragmentos</td><td>Parte</td><td>#5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x Agente de Bloqueio GE</td><td>Agilent Technologies</td><td>Parte #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Solução de estabilização e secagem</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Parte #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de junta habilitadas pela tecnologia Agilent SureHyb</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Pacote de 20 lâminas de junta, 4 microarrays/lâmina</td></tr><tr><td>Kit de Pico de RNA de Duas Cores</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B scanner de matriz</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr> Caixa <tr><td>Livre de Ozônio</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>arquivo GAL</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptoma profiling de in-vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores plataforma microarray

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

A perda embrionária precoce é um grande contribuinte para a infertilidade em bovinos. Além disso, bovinos se tornam um modelo interessante para estudar o desenvolvimento embrionário pré-implantação humana devido ao seu processo de desenvolvimento semelhante. Embora se saiba que fatores genéticos afetam o desenvolvimento embrionário inicial, a descoberta de tais fatores tem sido um sério desafio. A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica dos níveis de transcrição em todo o genoma. Uma das principais decisões que devem ser tomadas ao planejar um experimento de microarray é usar uma abordagem de uma ou duas cores. O design de duas cores aumenta a replicação técnica, minimiza a variabilidade, melhora a sensibilidade e a precisão, além de permitir designs de loop, definindo as amostras de referência comuns. Embora o microarray seja uma ferramenta biológica poderosa, existem armadilhas potenciais que podem atenuar seu poder. Portanto, neste artigo técnico, demonstramos um protocolo otimizado para extração de RNA, amplificação, marcação, hibridização do RNA amplificado marcado para a matriz, varredura de matriz e análise de dados usando a estratégia de análise de duas cores.

Um resultado representativo de ARN total e amplificado ARNA desde o dia 7 embriões é mostrada na Figura 3 e resumidos no Quadro 1. integridade do RNA e do perfil pode ser avaliada após a extração do RNA. Avaliação da qualidade do ARN podia ser realizado por instrumento Bioanalyzer (Figura 3A) e apenas as amostras com um valor superior a 7,0 RIN estão qualificados para ser usad...

A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica de transcritos em todo o genoma. Portanto, este protocolo fornece um procedimento técnico otimizado em uma matriz bovina personalizada de duas cores usando embriões bovinos do Dia 7 para demonstrar a viabilidade do uso de baixa quantidade de RNA total.

Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

O objetivo geral deste vídeo é fornecer um procedimento técnico otimizado usando uma matriz bovina personalizada de duas cores usando uma baixa quantidade de RNA total de embriões bovinos do sétimo dia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a perda embrionária em vacas leiteiras de alta produção e questões sobre a qualidade embrionária em relação à expressão gênica no embrião em desenvolvimento antes da implantação. A vantagem dessa técnica é que podemos estudar a expressão gênica usando o nível de picograma de RNA total extraído de embriões individuais.Este método pode fornecer informações sobre o fator que afeta a sobrevivência de embriões bovinos pré-implantacionais produzidos in vivo. Isso também pode ajudar a melhorar as tecnologias reprodutivas, como a produção de embriões in vitro. Para iniciar o procedimento, prepare embriões bovinos congelados em um tubo de microcentrífuga a partir de um kit de extração de RNA em escala pico baseado em coluna.Adicione 10 microlitros de tampão de lise ao tubo e incube os embriões a 42 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por dois minutos a 800 vezes G.Pipete 250 microlitros de tampão de condicionamento na membrana do filtro da coluna de purificação e incube a coluna por cinco minutos à temperatura ambiente. Centrifugar o tubo de recolha a 16 000 vezes G durante um minuto para terminar o pré-condicionamento da coluna.Adicione 10 microlitros de etanol a 70% à mistura de tampão de lise e embriões e misture bem. Em seguida, coloque a mistura na coluna de purificação. Centrifugar a coluna durante dois minutos a 100 vezes G e depois a 16 000 vezes G durante 30 segundos.Adicione 100 microlitros do primeiro tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 8.000 vezes G por um minuto. Usando um kit DNase, misture cinco microlitros de solução estoque com 35 microlitros de tampão e misture invertendo suavemente o tubo fechado. Em seguida, carregue a mistura de DNase na membrana da coluna de purificação e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.Adicione 40 microlitros do primeiro tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 8.000 vezes G por 15 segundos. Em seguida, adicione 100 microlitros do segundo tampão de lavagem e centrifugue por um minuto. Adicione outra porção do segundo tampão de lavagem à coluna e centrifugue por dois minutos a 16.000 vezes G.Transfira a coluna de purificação para outro tubo de microcentrífuga e carregue 11 microlitros de tampão de eluição na membrana da coluna.Incube a coluna por um minuto em temperatura ambiente. Centrifugue a coluna por um minuto a 1.000 vezes G e depois por mais um minuto a 16.000 vezes G. Verifique a qualidade e a quantidade do RNA eluído e, em seguida, armazene a amostra em 80 graus Celsius negativos. Usando um kit de amplificação, amplifice 100 picogramas de RNA de alta qualidade.Avalie a faixa de tamanho do aRNA amplificado com quantificação baseada em fluorescência. Em seguida, determine a concentração de aRNA por espectrofotometria. Prepare dois microgramas do aRNA amplificado para marcação fluorescente com um kit padrão.Configure uma caixa de ozônio em uma câmara escura e espere até que o nível de ozônio diminua para 0,001 partes por milhão. Coloque um filtro de câmara escura sobre a luz. Em seguida, traga a amostra para a caixa de ozônio e adicione dois microlitros de cianina, cinco corantes e tampão de rotulagem.Com a amostra sob uma luz segura, adicione água livre de RNase para atingir um volume total de 20 microlitros. Misture suavemente a amostra e, em seguida, incube o tubo em um termociclador a 85 graus Celsius por 15 minutos. Resfrie a amostra no gelo por um minuto e, em seguida, gire a amostra.Limpe o aRNA rotulado e amplificado com um kit de extração de RNA. Usando o tipo apropriado de espectrômetro, determine a concentração de aRNA amplificado e marcado. Prepare uma segunda amostra de aRNA amplificado marcado com corante de cianina três.Armazene as amostras de aRNA a 80 graus Celsius negativos por até três dias. Combine 825 nanogramas de aRNA marcado com Cy3 e 5. Adicione a isso o buffer de bloqueio e o buffer de fragmentação.Incube a mistura a 60 graus Celsius por 15 minutos e, em seguida, deixe esfriar no gelo por um minuto. Adicione tampão de hibridização de 55 microlitros e misture bem sem introduzir bolhas de ar. Centrifugue a mistura a 11.300 vezes G por um minuto.Carregue 100 microlitros de amostra na lâmina da matriz e sele a lâmina na câmara de hibridização. Hibridizar a amostra por 17 horas a 65 graus Celsius enquanto gira a 10 rotações por minuto. Prepare uma solução estabilizadora e secadora de ozônio.Lave as matrizes, tomando precauções para minimizar a exposição ao ozônio e, em seguida, mergulhe-as na solução estabilizadora e secadora por 30 segundos. Certifique-se de que a superfície da matriz esteja seca e livre de poeira. Armazene as matrizes em um local escuro.Ligue o scanner de microarray e aguarde até que esteja pronto para digitalizar. Em seguida, carregue a matriz com o código de barras à esquerda. Execute uma análise pontual e salve os dados como um arquivo GPR.No software de análise estatística, normalize e analise os dados. Calcule o limite de seleção de ponto positivo e visualize o gráfico de sinais hibridizados e de fundo. Execute uma normalização de Loess dentro da matriz e, em seguida, uma normalização de quantil entre as matrizes.Exporte os dados normalizados para um arquivo de planilha. Use todos os sinais positivos em um repositório de dados de microarray para criar uma lista de identificação de genes exclusivos selecionados. Carregue a lista de ID em um banco de dados de classificação e análise de proteínas, escolhendo bos taurus como o organismo, e execute um teste de super-representação estatística padrão.Após a amplificação de duas rodadas, os fragmentos são muito semelhantes em tamanho e de boa qualidade. A amplificação bem-sucedida por este método deve produzir pelo menos um aumento de mil vezes de aRNA. Uma imagem de microarray de alta qualidade tem alta intensidade de ponto e baixa intensidade de fundo em ambos os canais.Se a intensidade do fundo for muito alta, a resolução do sinal será ruim. Cerca de 46% das manchas estavam acima do fundo, das quais 6.765 transcritos de RNA únicos expressos no blastocisto foram isolados. Um teste estatístico de super-representação indicou que os 10 principais termos de ontologia gênica representavam processos ativos de divisão celular.O desenvolvimento dessa técnica permitiu que pesquisadores da área de reprodução animal explorassem a expressão gênica embrionária e avaliassem como vários fatores afetam o embrião em desenvolvimento. Essa técnica também foi desenvolvida em outras espécies importantes, como o porco. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo, podem ser usados para validar os resultados do microarray.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair RNA de embriões, bem como amplificar e rotular RNA para realizar análises de microarray de duas cores.

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Aprenda a analisar o perfil transcricional de embriões bovinos pré-implantação usando microarray de duas cores com baixa quantidade de RNA. Este método permite estudar a expressão gênica em nível de picogramas e avaliar fatores que afetam a qualidade embrionária.

Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

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