Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

O objetivo geral deste vídeo é fornecer um procedimento técnico otimizado usando uma matriz bovina personalizada de duas cores usando uma baixa quantidade de RNA total de embriões bovinos do sétimo dia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a perda embrionária em vacas leiteiras de alta produção e questões sobre a qualidade embrionária em relação à expressão gênica no embrião em desenvolvimento antes da implantação. A vantagem dessa técnica é que podemos estudar a expressão gênica usando o nível de picograma de RNA total extraído de embriões individuais.

Este método pode fornecer informações sobre o fator que afeta a sobrevivência de embriões bovinos pré-implantacionais produzidos in vivo. Isso também pode ajudar a melhorar as tecnologias reprodutivas, como a produção de embriões in vitro. Para iniciar o procedimento, prepare embriões bovinos congelados em um tubo de microcentrífuga a partir de um kit de extração de RNA em escala pico baseado em coluna.

Adicione 10 microlitros de tampão de lise ao tubo e incube os embriões a 42 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por dois minutos a 800 vezes G.Pipete 250 microlitros de tampão de condicionamento na membrana do filtro da coluna de purificação e incube a coluna por cinco minutos à temperatura ambiente. Centrifugar o tubo de recolha a 16 000 vezes G durante um minuto para terminar o pré-condicionamento da coluna.

Adicione 10 microlitros de etanol a 70% à mistura de tampão de lise e embriões e misture bem. Em seguida, coloque a mistura na coluna de purificação. Centrifugar a coluna durante dois minutos a 100 vezes G e depois a 16 000 vezes G durante 30 segundos.

Adicione 100 microlitros do primeiro tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 8.000 vezes G por um minuto. Usando um kit DNase, misture cinco microlitros de solução estoque com 35 microlitros de tampão e misture invertendo suavemente o tubo fechado. Em seguida, carregue a mistura de DNase na membrana da coluna de purificação e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Adicione 40 microlitros do primeiro tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 8.000 vezes G por 15 segundos. Em seguida, adicione 100 microlitros do segundo tampão de lavagem e centrifugue por um minuto. Adicione outra porção do segundo tampão de lavagem à coluna e centrifugue por dois minutos a 16.000 vezes G.Transfira a coluna de purificação para outro tubo de microcentrífuga e carregue 11 microlitros de tampão de eluição na membrana da coluna.

Incube a coluna por um minuto em temperatura ambiente. Centrifugue a coluna por um minuto a 1.000 vezes G e depois por mais um minuto a 16.000 vezes G. Verifique a qualidade e a quantidade do RNA eluído e, em seguida, armazene a amostra em 80 graus Celsius negativos. Usando um kit de amplificação, amplifice 100 picogramas de RNA de alta qualidade.

Avalie a faixa de tamanho do aRNA amplificado com quantificação baseada em fluorescência. Em seguida, determine a concentração de aRNA por espectrofotometria. Prepare dois microgramas do aRNA amplificado para marcação fluorescente com um kit padrão.

Configure uma caixa de ozônio em uma câmara escura e espere até que o nível de ozônio diminua para 0,001 partes por milhão. Coloque um filtro de câmara escura sobre a luz. Em seguida, traga a amostra para a caixa de ozônio e adicione dois microlitros de cianina, cinco corantes e tampão de rotulagem.

Com a amostra sob uma luz segura, adicione água livre de RNase para atingir um volume total de 20 microlitros. Misture suavemente a amostra e, em seguida, incube o tubo em um termociclador a 85 graus Celsius por 15 minutos. Resfrie a amostra no gelo por um minuto e, em seguida, gire a amostra.

Limpe o aRNA rotulado e amplificado com um kit de extração de RNA. Usando o tipo apropriado de espectrômetro, determine a concentração de aRNA amplificado e marcado. Prepare uma segunda amostra de aRNA amplificado marcado com corante de cianina três.

Armazene as amostras de aRNA a 80 graus Celsius negativos por até três dias. Combine 825 nanogramas de aRNA marcado com Cy3 e 5. Adicione a isso o buffer de bloqueio e o buffer de fragmentação.

Incube a mistura a 60 graus Celsius por 15 minutos e, em seguida, deixe esfriar no gelo por um minuto. Adicione tampão de hibridização de 55 microlitros e misture bem sem introduzir bolhas de ar. Centrifugue a mistura a 11.300 vezes G por um minuto.

Carregue 100 microlitros de amostra na lâmina da matriz e sele a lâmina na câmara de hibridização. Hibridizar a amostra por 17 horas a 65 graus Celsius enquanto gira a 10 rotações por minuto. Prepare uma solução estabilizadora e secadora de ozônio.

Lave as matrizes, tomando precauções para minimizar a exposição ao ozônio e, em seguida, mergulhe-as na solução estabilizadora e secadora por 30 segundos. Certifique-se de que a superfície da matriz esteja seca e livre de poeira. Armazene as matrizes em um local escuro.

Ligue o scanner de microarray e aguarde até que esteja pronto para digitalizar. Em seguida, carregue a matriz com o código de barras à esquerda. Execute uma análise pontual e salve os dados como um arquivo GPR.

No software de análise estatística, normalize e analise os dados. Calcule o limite de seleção de ponto positivo e visualize o gráfico de sinais hibridizados e de fundo. Execute uma normalização de Loess dentro da matriz e, em seguida, uma normalização de quantil entre as matrizes.

Exporte os dados normalizados para um arquivo de planilha. Use todos os sinais positivos em um repositório de dados de microarray para criar uma lista de identificação de genes exclusivos selecionados. Carregue a lista de ID em um banco de dados de classificação e análise de proteínas, escolhendo bos taurus como o organismo, e execute um teste de super-representação estatística padrão.

Após a amplificação de duas rodadas, os fragmentos são muito semelhantes em tamanho e de boa qualidade. A amplificação bem-sucedida por este método deve produzir pelo menos um aumento de mil vezes de aRNA. Uma imagem de microarray de alta qualidade tem alta intensidade de ponto e baixa intensidade de fundo em ambos os canais.

Se a intensidade do fundo for muito alta, a resolução do sinal será ruim. Cerca de 46% das manchas estavam acima do fundo, das quais 6.765 transcritos de RNA únicos expressos no blastocisto foram isolados. Um teste estatístico de super-representação indicou que os 10 principais termos de ontologia gênica representavam processos ativos de divisão celular.

O desenvolvimento dessa técnica permitiu que pesquisadores da área de reprodução animal explorassem a expressão gênica embrionária e avaliassem como vários fatores afetam o embrião em desenvolvimento. Essa técnica também foi desenvolvida em outras espécies importantes, como o porco. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo, podem ser usados para validar os resultados do microarray.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair RNA de embriões, bem como amplificar e rotular RNA para realizar análises de microarray de duas cores.