Transcriptoma Profiling de In-Vivo embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray
30 de janeiro de 2017
A tecnologia de microarray permite a medição quantitativa e o perfil de expressão gênica de transcritos em todo o genoma. Portanto, este protocolo fornece um procedimento técnico otimizado em uma matriz bovina personalizada de duas cores usando embriões bovinos do Dia 7 para demonstrar a viabilidade do uso de baixa quantidade de RNA total.
O objetivo geral deste vídeo é fornecer um procedimento técnico otimizado usando uma matriz bovina personalizada de duas cores usando uma baixa quantidade de RNA total de embriões bovinos do sétimo dia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a perda embrionária em vacas leiteiras de alta produção e questões sobre a qualidade embrionária em relação à expressão gênica no embrião em desenvolvimento antes da implantação. A vantagem dessa técnica é que podemos estudar a expressão gênica usando o nível de picograma de RNA total extraído de embriões individuais.
Este método pode fornecer informações sobre o fator que afeta a sobrevivência de embriões bovinos pré-implantacionais produzidos in vivo. Isso também pode ajudar a melhorar as tecnologias reprodutivas, como a produção de embriões in vitro. Para iniciar o procedimento, prepare embriões bovinos congelados em um tubo de microcentrífuga a partir de um kit de extração de RNA em escala pico baseado em coluna.
Adicione 10 microlitros de tampão de lise ao tubo e incube os embriões a 42 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por dois minutos a 800 vezes G.Pipete 250 microlitros de tampão de condicionamento na membrana do filtro da coluna de purificação e incube a coluna por cinco minutos à temperatura ambiente. Centrifugar o tubo de recolha a 16 000 vezes G durante um minuto para terminar o pré-condicionamento da coluna.
Adicione 10 microlitros de etanol a 70% à mistura de tampão de lise e embriões e misture bem. Em seguida, coloque a mistura na coluna de purificação. Centrifugar a coluna durante dois minutos a 100 vezes G e depois a 16 000 vezes G durante 30 segundos.
Adicione 100 microlitros do primeiro tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 8.000 vezes G por um minuto. Usando um kit DNase, misture cinco microlitros de solução estoque com 35 microlitros de tampão e misture invertendo suavemente o tubo fechado. Em seguida, carregue a mistura de DNase na membrana da coluna de purificação e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.
Adicione 40 microlitros do primeiro tampão de lavagem à coluna e centrifugue a 8.000 vezes G por 15 segundos. Em seguida, adicione 100 microlitros do segundo tampão de lavagem e centrifugue por um minuto. Adicione outra porção do segundo tampão de lavagem à coluna e centrifugue por dois minutos a 16.000 vezes G.Transfira a coluna de purificação para outro tubo de microcentrífuga e carregue 11 microlitros de tampão de eluição na membrana da coluna.
Incube a coluna por um minuto em temperatura ambiente. Centrifugue a coluna por um minuto a 1.000 vezes G e depois por mais um minuto a 16.000 vezes G. Verifique a qualidade e a quantidade do RNA eluído e, em seguida, armazene a amostra em 80 graus Celsius negativos. Usando um kit de amplificação, amplifice 100 picogramas de RNA de alta qualidade.
Avalie a faixa de tamanho do aRNA amplificado com quantificação baseada em fluorescência. Em seguida, determine a concentração de aRNA por espectrofotometria. Prepare dois microgramas do aRNA amplificado para marcação fluorescente com um kit padrão.
Configure uma caixa de ozônio em uma câmara escura e espere até que o nível de ozônio diminua para 0,001 partes por milhão. Coloque um filtro de câmara escura sobre a luz. Em seguida, traga a amostra para a caixa de ozônio e adicione dois microlitros de cianina, cinco corantes e tampão de rotulagem.
Com a amostra sob uma luz segura, adicione água livre de RNase para atingir um volume total de 20 microlitros. Misture suavemente a amostra e, em seguida, incube o tubo em um termociclador a 85 graus Celsius por 15 minutos. Resfrie a amostra no gelo por um minuto e, em seguida, gire a amostra.
Limpe o aRNA rotulado e amplificado com um kit de extração de RNA. Usando o tipo apropriado de espectrômetro, determine a concentração de aRNA amplificado e marcado. Prepare uma segunda amostra de aRNA amplificado marcado com corante de cianina três.
Armazene as amostras de aRNA a 80 graus Celsius negativos por até três dias. Combine 825 nanogramas de aRNA marcado com Cy3 e 5. Adicione a isso o buffer de bloqueio e o buffer de fragmentação.
Incube a mistura a 60 graus Celsius por 15 minutos e, em seguida, deixe esfriar no gelo por um minuto. Adicione tampão de hibridização de 55 microlitros e misture bem sem introduzir bolhas de ar. Centrifugue a mistura a 11.300 vezes G por um minuto.
Carregue 100 microlitros de amostra na lâmina da matriz e sele a lâmina na câmara de hibridização. Hibridizar a amostra por 17 horas a 65 graus Celsius enquanto gira a 10 rotações por minuto. Prepare uma solução estabilizadora e secadora de ozônio.
Lave as matrizes, tomando precauções para minimizar a exposição ao ozônio e, em seguida, mergulhe-as na solução estabilizadora e secadora por 30 segundos. Certifique-se de que a superfície da matriz esteja seca e livre de poeira. Armazene as matrizes em um local escuro.
Ligue o scanner de microarray e aguarde até que esteja pronto para digitalizar. Em seguida, carregue a matriz com o código de barras à esquerda. Execute uma análise pontual e salve os dados como um arquivo GPR.
No software de análise estatística, normalize e analise os dados. Calcule o limite de seleção de ponto positivo e visualize o gráfico de sinais hibridizados e de fundo. Execute uma normalização de Loess dentro da matriz e, em seguida, uma normalização de quantil entre as matrizes.
Exporte os dados normalizados para um arquivo de planilha. Use todos os sinais positivos em um repositório de dados de microarray para criar uma lista de identificação de genes exclusivos selecionados. Carregue a lista de ID em um banco de dados de classificação e análise de proteínas, escolhendo bos taurus como o organismo, e execute um teste de super-representação estatística padrão.
Após a amplificação de duas rodadas, os fragmentos são muito semelhantes em tamanho e de boa qualidade. A amplificação bem-sucedida por este método deve produzir pelo menos um aumento de mil vezes de aRNA. Uma imagem de microarray de alta qualidade tem alta intensidade de ponto e baixa intensidade de fundo em ambos os canais.
Se a intensidade do fundo for muito alta, a resolução do sinal será ruim. Cerca de 46% das manchas estavam acima do fundo, das quais 6.765 transcritos de RNA únicos expressos no blastocisto foram isolados. Um teste estatístico de super-representação indicou que os 10 principais termos de ontologia gênica representavam processos ativos de divisão celular.
O desenvolvimento dessa técnica permitiu que pesquisadores da área de reprodução animal explorassem a expressão gênica embrionária e avaliassem como vários fatores afetam o embrião em desenvolvimento. Essa técnica também foi desenvolvida em outras espécies importantes, como o porco. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo, podem ser usados para validar os resultados do microarray.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair RNA de embriões, bem como amplificar e rotular RNA para realizar análises de microarray de duas cores.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um procedimento técnico otimizado utilizando uma matriz bovina personalizada de duas cores para analisar a expressão gênica em embriões bovinos do sétimo dia. O método permite o uso de pequenas quantidades de RNA total, fornecendo informações sobre a qualidade embrionária e os fatores que afetam a sobrevivência do embrião.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Embriologia
- Expressão Gênica
Antecedentes
- A tecnologia de microarranjos permite o perfilamento da expressão gênica em todo o genoma.
- Compreender a perda embrionária em vacas leiteiras é fundamental para aprimorar as tecnologias reprodutivas.
- Métodos com baixa quantidade de RNA podem aprimorar estudos em embriões individuais.
- A análise da expressão gênica pode orientar práticas na produção in vitro de embriões.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a viabilidade do uso de pequenas quantidades de RNA total de embriões bovinos.
- Investigar a expressão gênica relacionada à qualidade embrionária antes da implantação.
- Fornecer informações sobre fatores que afetam a sobrevivência de embriões bovinos pré-implantação.
Métodos Utilizados
- Preparação de embriões bovinos congelados rapidamente.
- Utilização de um kit de extração de RNA em escala pico baseado em coluna.
- Implementação de uma matriz bovina personalizada de duas cores.
- Medição quantitativa da expressão gênica em níveis de RNA da ordem de picogramas.
Resultados Principais
- Perfilagem bem-sucedida da expressão gênica utilizando RNA mínimo.
- Informações sobre a qualidade embrionária e fatores que influenciam a sobrevivência.
- Melhorias potenciais nas tecnologias reprodutivas.
- Demonstração da viabilidade do método para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da expressão gênica em embriões bovinos.
- Métodos com baixa quantidade de RNA podem facilitar a pesquisa sobre o desenvolvimento embrionário.
- Essa abordagem pode levar a avanços nas práticas reprodutivas na pecuária leiteira.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o perfilamento da expressão gênica em todo o genoma a partir de RNA em nível de picogramas extraído de embriões bovinos individuais, abordando um gargalo crítico na pesquisa em biologia reprodutiva. Ao fornecer dados transcriptômicos quantitativos de embriões pré-implantacionais produzidos in vivo, o método auxilia na desmistificação mecanicista dos fatores de perda embrionária em bovinos leiteiros de alta produção. A abordagem oferece valor translacional para a validação de alvos em terapias reprodutivas e confiabilidade preditiva em pipelines de avaliação da qualidade embrionária.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das redes transcricionais que regulam a sobrevivência e a qualidade embrionária antes da implantação.
- Valor Operacional: Facilita a validação funcional de alvos ao associar padrões de expressão gênica a desfechos fenotípicos no desenvolvimento embrionário.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar assinaturas moleculares associadas a embriões viáveis e não viáveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera perfis transcriptômicos padronizados e reprodutíveis, adequados para a descoberta de biomarcadores e padronização de ensaios.
- Escalabilidade: O design de microarranjo com duas cores aumenta a replicação técnica e minimiza a variabilidade, permitindo comparações robustas entre amostras.
- Utilidade da plataforma: Cria uma base reutilizável para validação posterior por meio de qPCR ou triagem funcional de genes candidatos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Fornece um sistema modelo bovino com paralelos no desenvolvimento da embriogênese humana pré-implantacional para estudos mecanicistas.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas de expressão gênica na fase de pesquisa à avaliação pré-clínica de fatores que afetam a sobrevivência embrionária.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite decisões baseadas em dados sobre intervenções em tecnologias reprodutivas com base em perfis de expressão de vias de desenvolvimento essenciais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a identificação de alvos orientada por hipóteses e a validação mecanicista antes de avançar para ensaios funcionais ou estudos de validação in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos mediante o isolamento de transcritos diferencialmente expressos associados à qualidade e sobrevivência do embrião.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e normalizadas de expressão que permitem comparações confiáveis dos efeitos de condições genéticas ou ambientais no desenvolvimento embrionário.
- Análise: Utiliza normalização por Loess e quantílica, combinada com testes estatísticos de super-representação, para obter informações acionáveis de ontologia gênica a partir de dados de microarranjos.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se aos esforços de descoberta de biomarcadores ao identificar processos conservados, como divisão celular ativa, como termos funcionais de maior classificação em embriões na fase de blastocisto.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado de RNA para dados, aplicável entre espécies pecuárias e adaptável a outros modelos de embriões de mamíferos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na perda embrionária ao fornecer dados de expressão em escala genômica de estágios de desenvolvimento clinicamente relevantes.
- Valor Operacional: Permite a detecção de alta sensibilidade a partir de quantidade mínima de RNA, padronizando protocolos com baixa entrada para amostras biológicas preciosas ou limitadas.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento de tecnologias reprodutivas ao associar perfis moleculares aos resultados de viabilidade embrionária.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos ou intervenções com base no enriquecimento de redes gênicas funcionalmente coerentes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de RNA, amplificação enzimática e técnicas de marcação fluorescente para evitar a degradação da amostra.
- Depende do acesso a escâneres de microarranjos, câmaras de hibridização e ambientes controlados quanto ao ozônio para manter a integridade do sinal.
- Necessita padronização entre equipes quanto às métricas de qualidade do RNA, eficiência de marcação e condições de hibridização para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o protocolo para diferentes estágios embrionários, espécies ou tipos de amostras com rendimentos variáveis de RNA.
- As limitações práticas incluem a necessidade de entrada de RNA amplificado e o viés potencial introduzido durante as etapas de amplificação em duas rodadas.
