Manutenção de um Drosophila melanogaster Gaiola População

Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado e flexível para a manutenção de uma gaiola populacional de moscas. Uma maneira eficiente de produzir regularmente miligramas a dezenas de gramas de embriões, larvas, púbis e moscas adultas. Moscas coletadas que acabam de entrar no processo para obter grandes quantidades de DNA, RNA, proteínas e outros componentes semelhantes necessários para experimentos de bioquímica e biologia molecular.

A gaiola populacional pode ser demorada para configurar. No entanto, manter uma gaiola ao longo de meses economiza tempo e permite a coleta rápida de material biológico em um curto período. Para começar, configure o recipiente de plástico cortando três quadrados de dois por dois centímetros na tampa do recipiente de plástico.

Adicione fita adesiva de três quartos de polegada nos quatro cantos de cada orifício para garantir um ajuste firme para os plugues de espuma. Em seguida, coloque um tampão de espuma em cada orifício. Cubra o interior do recipiente com filme plástico.

Sobre este filme, adicione uma camada de algodão para cobrir o fundo do recipiente de plástico e rasgue o excesso de algodão. Em seguida, passe para a preparação de alimentos voadores adicionando 333 mililitros de água deionizada a um copo de 500ml. Em uma coifa química, mexa a solução com uma barra magnética e adicione 167 microlitros de ácido propiônico e 1,08 mililitros de ácido fosfórico de soluções padrão.

Adicione lentamente 77,5 gramas de fermento seco ativo, evitando grandes grumos. Depois de dissolver o fermento seco, adicione 38,8 gramas de sacarose por último. Imediatamente após dissolver a sacarose, despeje os alimentos frescos sobre o algodão.

Certifique-se de cobrir o algodão uniformemente, antes de fechar o recipiente de plástico com a tampa para evitar que as moscas que escapam contaminem os alimentos. Suspendemos 1,5 gramas dos embriões não coroados mais duros do ciclo anterior. Corte dois papéis de filtro ao meio e distribua a mistura biológica uniformemente sobre os quatro pedaços usando uma espátula.

Coloque os papéis de filtro em cima do algodão embebido e feche a tampa. Por fim, incube o recipiente de plástico até o estágio da pupila. Monitore os embriões à medida que se tornam larvas de primeiro ínstar.

As larvas resultantes se alimentam da mistura de leveduras, crescendo e mudando duas vezes em larvas de segundo e terceiro ínstares. Durante o período de crescimento, limpe a gaiola da população de moscas conforme detalhado no protocolo de texto que acompanha o documento. Quatro dias após a configuração inicial, observe a pupa das larvas.

As larvas permanecerão nesse estágio por mais quatro dias. Antes que as primeiras moscas surjam, abra o recipiente de plástico e coloque o filme plástico contendo o algodão com todos os pupi sobre o papel de imersão de laboratório dentro da gaiola de população limpa. Reproduza automaticamente a mistura de melaço previamente preparada com uma barra de agitação por 30 minutos.

Resfrie a mistura e adicione a solução de Tegosept à mistura de melaço. Em seguida, despeje a mistura em uma bandeja de carne de 21 x 14,5 centímetros. Certifique-se de que o volume seja suficiente para cobrir 16 bandejas.

Aguarde até 20 minutos para que o melaço solidifique e cubra cada bandeja com filme plástico para evitar que seque. Em seguida, guarde as bandejas a 4 graus Celsius até serem usadas. Adicione 200 mililitros de água deionizada em um copo e despeje lentamente o fermento seco, mexendo com uma colher.

Pare de adicionar fermento seco quando a mistura atingir a consistência de manteiga de amendoim para evitar que as moscas grudem nos alimentos. Remova o filme plástico de uma bandeja de melaço e cubra-o com uma camada de fermento úmido recém-preparado usando uma colher ou espátula. Certifique-se de que toda a superfície esteja coberta.

Coloque a gaiola no coldrum a 4 graus Celsius por até 30 minutos para garantir que as moscas pararam de voar. Enquanto a gaiola está no coldrum, abra a rede e adicione cuidadosamente a bandeja de melaço com fermento úmido na gaiola. Feche a rede e coloque a gaiola em temperatura ambiente.

Dois dias após a eclosão, introduza uma nova bandeja de melaço com comida úmida fresca na gaiola. Para aumentar o rendimento da deposição de ovos, torne a superfície do fermento úmido o mais irregular possível. Mantenha a gaiola em temperatura ambiente.

Quando os embriões podem ser visualizados como pequenos pontos brancos, eles estão prontos para serem coletados. Para colher os embriões, acalme as moscas colocando a gaiola em uma câmara fria por até 30 minutos. Prepare o recipiente de plástico e a comida para moscas para o próximo ciclo.

Em seguida, em uma bandeja de autoclave de oito litros, adicione água a um quarto da capacidade total e adicione um mililitro de 10% Triton X-100. Enquanto a gaiola estiver no coldrum, remova cuidadosamente a placa de melaço e coloque-a dentro de um saco de risco biológico. Remova a bandeja do saco e mergulhe-a rapidamente na solução de detergente na bandeja da autoclave, feche o saco de risco biológico e coloque o saco em um recipiente de risco biológico.

Use uma pistola de água destilada para lavar embriões e fermento do melaço. Descarte os pratos e o melaço em uma caixa de risco biológico. Despeje a solução cuidadosamente em um conjunto de três peneiras.

Lave os aglomerados no nível superior com a pistola de água destilada até que não haja grumos. Enxágue a bandeja da autoclave com água destilada e despeje a água de enxágue pelas peneiras. Remova a peneira superior.

A maior parte das larvas do primeiro e do segundo ínstar permanecerá na peneira 40. Remova a segunda peneira. O material amarelo na terceira peneira é a mistura de embriões e pequenas larvas de primeiro ínstar.

Use a pistola de água destilada para mover todos os ovos para um lado da peneira. Em seguida, colete-os com uma espátula e pese-os. Use 1,5 gramas para iniciar um novo ciclo.

Use o restante dos embriões para processamento posterior ou descarte-os. Seis ciclos consecutivos foram coletados a partir de material de partida de 1,5 gramas. E rendeu uma média de 10 gramas de embriões e larvas por ciclo.

São mostrados os rendimentos de cinco coletas consecutivas uma hora após a adição de novo alimento e três coletas consecutivas três horas após a colocação de um novo prato de melaço. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como regular uma cultura, uma população de drosophila melanogaster, usando uma gaiola de população de moscas.