Name: Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a administrar vírus oncolíticos por via arterial hepática para terapia locorregional de carcinoma hepatocelular ortotópico em ratos. Este método permite entregar altos títulos virais a múltiplas lesões.

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Este trabalho é apoiado pelos subprojetos C6 e C7 do SFB 824 (DFG Sonderforschungsbereich 824), Fundação Alemã de Pesquisa, Bonn, Alemanha.

Nota: Os passos seguintes foram realizados em conformidade com as orientações da nossa instituição e o governo local da Baviera, Alemanha. Todas as tentativas para reproduzir este protocolo deve ser feita na adesão às diretrizes locais para o tratamento humano dos animais, como ditado pelo cuidado animal local e comitê de uso. Por exemplo, muitos institutos exigem que luvas estéreis são usados ​​durante a cirurgia de roedores. Além disso, trabalhar com vírus deve ser realizada de acordo com os regulamentos locais, tendo o cuidado para a segurança pessoal e ambiental. Cuidados devem ser tomados para descartar adequadamente os resíduos contaminados e limpar instrumentos e espaço de trabalho (ou seja, por autoclavagem e limpar com um desinfectante antiviral adequado de acordo com as instruções do fabricante). 1. Preparações Antes de iniciar a cirurgia <ol><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos (ie, por autoclavagem). </li><li> Dilui-se o vírus para o aproprconcentração iate, que irá variar dependendo da toxicidade do vírus específico a ser utilizado e da susceptibilidade da estirpe de rato. Nota: Por exemplo, quando se utiliza o vírus da estomatite vesicular em ratos Buffalo sexo masculino, que tipicamente injectar 10 7 pfu num volume de 1 ml, que é a dose máxima tolerada em que modelo. <ol><li> Prefill o vírus (utilizando uma técnica asséptica) em seringas de 1 ml, e anexar 30 g de agulhas, tendo o cuidado de eliminar o ar da seringa e agulha. </li></ol></li><li> Prepare o espaço cirúrgico com todos os materiais e equipamentos necessários, e pulverizar a área com etanol para desinfectar. Encha um pequeno recipiente com solução salina estéril (0,9% NaCl) para umedecer compressas de gaze e aplicadores com ponta de algodão. </li></ol> 2. Preparação do Rato <ol><li> Administrar um analgésico (como especificado pelo Animal Care Committee e uso local), no apropriado dose de 30 min antes de se iniciar o procedimento cirúrgico. Por exemplo,administrar uma dose elevada de metamizol (100-200 mg / kg). </li><li> Anestesiar ratos usando inalação (isoflurano) ou injectável (isto é, uma mistura de medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), e fentanilo (0,005 mg / kg), também conhecido como MMF) anestesia. Administrar isolflurane através de um vaporizador em 1-3% e ajustar conforme necessário para manter a respiração normal e do ritmo cardíaco. <ol><li> Antes de prosseguir, certifique-se que o rato está totalmente sedado e incapaz de sentir dor por beliscar a almofada do pé e observando para uma reação. </li><li> Aplique uma pomada veterinária para prevenir o ressecamento durante a anestesia. </li></ol></li><li> Raspar a área abdominal do esterno para baixo a apenas acima dos genitais usando uma pequena máquina de cortar cabelo veterinária. Tome cuidado para conseguir um barbear mais rente sem ferir a pele. </li><li> Corrigir o rato para o leito cirúrgico utilizando fita na previsão e membros posteriores e, se estiver usando anestesia inalação, coloque o focinho em um cone de nariz de dimensões adequadas. Coloque uma almofada de aquecimentosob o rato para manter a temperatura corporal. Desinfecção da área abdominal com um desinfectante de grau cirúrgico, seguido de uma lavagem com álcool e aplicação de uma tinta anti-séptico. </li></ol> 3. A laparotomia <ol><li> Usando um pequeno bisturi curvo, tal como # 15, fazer uma pequena incisão vertical na camada de pele directamente ao longo da linha média. Estender a incisão até o processo xifóide. Em seguida, inciso a camada muscular, gentilmente levantando com um par de fórceps Adson para fazer uma incisão de bisturi, e em seguida, estender a incisão até o processo xifóide com uma tesoura cirúrgica. Tomar cuidado para não puncionar os órgãos da cavidade abdominal ou a danificar os pequenos vasos em ambos os lados do processo xifóide. </li><li> Coloque um afastador através do abdômen para espalhar o músculo ea pele e expor toda a área abdominal. </li><li> Umedeça dois 7,5 x 7,5 cm 2 compressas de gaze com soro fisiológico estéril e espalhar uma na parte superior do cirúrgicae uma abertura através da parte inferior, como se mostra na Figura 2A. </li></ol> 4. Isolamento da artéria hepática <ol><li> Usando duas compressas com aplicador de algodão umedecido umedecidas com soro fisiológico estéril, levante suavemente os intestinos e ceco para fora da cavidade abdominal, e colocá-los no cotonete gaze inferior. Dobre a gaze sobre a manter os órgãos úmido e para mantê-los fora do caminho. </li><li> Usando duas compressas com aplicador de algodão umedecidos, gentilmente levante o lobo hepático lateral esquerdo, que será o lobo mais predominante, tendo em conta nesta fase. Virar o lóbulo para cima, e, usando uma tesoura pequena mola, cortar através da membrana fibrosa na parte inferior do lóbulo, permitindo que o lóbulo para ser completamente virado para cima e para descansar em cima da compressa de gaze previamente colocado. Dobre o cotonete de gaze sobre o lobo para segurá-la no lugar. </li><li> Continue com o próximo lobo (caudado anterior), que agora é o lobo mais anterior em vista. com the auxílio de um microscópio de dissecção e uma pinça fina, dissecção da membrana fina em torno do lóbulo de modo a libertar e permitir que seja livremente virado para cima. Colocar o lóbulo debaixo da haste de gaze em conjunto com o lobo lateral esquerdo. </li><li> Observe o lobo caudado posterior, que será agora visível. Repita o passo 4.3 para dissecar completamente a caudado lobo posterior e lançá-lo para cima e para dentro da gaze em conjunto com os lobos do fígado colocados anteriormente. </li><li> Logo abaixo da posição original do lobo caudado, encontrar a artéria hepática comum, que será agora visível e facilmente reconhecida por sua forte pulsação. Após a artéria para o direito anatômico, observar o material membranoso espessura obscurecendo as artérias hepáticas gastroduodenais e apropriadas de vista. Usando uma pinça fina, levante-se este material e gentilmente rasgá-lo, tomando cuidado para evitar quaisquer pequenas embarcações na área. Use cotonetes aplicador de algodão para evitar qualquer sangramento que pode ocorrer. <ol><li> Localize a umrterial ramos, que será claramente visível, com o auxílio de um microscópio de dissecação, quando as membranas são adequadamente dissecadas. </li></ol></li><li> Utilizando duas pinças atraumáticas, finas, dissecar cuidadosamente a artéria hepática comum, artéria gastroduodenal, e a artéria hepática adequada de tal modo que eles são libertados a partir das membranas que rodeiam (Figura 2B). </li></ol> 5. Preparação da Artéria para Injecção <ol><li> Passar um 7-0 Prolene sutura debaixo da artéria gastroduodenal, e usar um micro-porta-agulhas para amarrar uma ligadura permanente na extremidade distal, logo acima da bifurcação (ver Figura 1 para a colocação adequada). Permitir que cerca de 2 polegadas de material de sutura restantes sobre as extremidades, e prenda-os com um suporte de agulha para puxar a artéria ensinado, como na Figura 2C. </li><li> Colocar uma pequena braçadeira na artéria hepática comum para bloquear temporariamente o fluxo de sangue (Figura 2C). Nota: Este é important para prevenir hemorragia massiva uma vez que a agulha é removida da artéria. Além disso, o bloqueio do fluxo de sangue arterial vai permitir a administração de vírus mais lento e uma melhor eficácia de transdução. <ol><li> Importante: Trabalho rapidamente para limitar a quantidade de tempo que o fluxo de sangue é interrompido - executar a injecção e subsequente ligação da artéria dentro de 5 min de aperto da artéria hepática comum. </li></ol></li><li> Se possível, aumentar a ampliação no microscópio de dissecação, de modo a que a artéria gastroduodenal está em foco e aparece grande o suficiente para inserir de forma precisa a agulha G 30. Coloque a agulha da seringa de injecção para dentro do lúmen da artéria gastroduodenal e lentamente empurrar o êmbolo. Nota: A colocação apropriada da agulha vai resultar na solução injectada que flui directamente através da artéria hepática e adequada para o fígado. <ol><li> Realizar a injecção muito lentamente para maximizar a eficiência de transdução. </li></ol></li> &lt;li&gt; Uma vez que todo o volume de injecção ter sido administrada, lentamente retrair a agulha a partir da artéria. Nota: Não deve haver sangramento no local da injecção. No caso em que a hemorragia ocorre, isso indica que a braçadeira não está correctamente colocada e deve ser ajustada rapidamente. </li></ol> 6. Encerramento <ol><li> Passe uma segunda 7-0 Prolene sutura abaixo da artéria gastroduodenal, e amarrar uma segunda ligadura permanente acima do local da injeção. </li><li> Remover o grampo da artéria hepática comum. Confirmar que o fluxo de sangue através da artéria hepática própria para o fígado foi restaurado. <ol><li> Corte as pontas soltas das ligaduras. </li></ol></li><li> Confirmar que não há sangramento antes de devolver os intestinos e fígado para a cavidade abdominal. Tome cuidado para que o apêndice é devolvido em sua orientação original. </li><li> Suturar o músculo e pele em camadas separadas utilizando material de sutura 4-0 vicryl com uma agulha curva. lugar continuous suturas cerca de 1 mm de distância e puxe com força. <ol><li> Durante a fase de sutura, administrar um analgésico tal como buprenorfina (0,05 mg / kg). </li></ol></li><li> Remover rato da anestesia. Se isoflurano foi usado, o rato deve recuperar a consciência dentro de alguns minutos. Se o MMF tem sido usado como uma anestesia injectável, antagonizam com uma injecção subcutânea de atipamezol (0,75 mg / kg), flumazenil (0,2 mg / kg), e naloxona (9,12 mg / kg), o que irá reverter os efeitos da anestesia e permitir que os animais a recuperar a consciência dentro de 20 min. Mantenha ratos quentes com uma lâmpada de aquecimento infravermelha durante a fase inicial despertar. <ol><li> Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li></ol></li><li> Monitorar ratos pós-operatório para os sinais patológicos de aflição, e acompanhamento-se com analgésicos, conforme exigido pela comissão de cuidados com os animais e uso local. Por exemplo, a buprenorfina pode ser administrada em 0,05 mg / kg a cada 12 horas. </li></ol>

<ol><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+health+policy+-+lessons+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study.</a> Science. 274, 740-743 (1996).</li>
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<li>Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+newcastle+disease+virus+as+an+improved+oncolytic+agent+against+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma.</a> Mol Ther. 18, 275-284 (2010).</li>
<li>Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolysis+of+multifocal+hepatocellular+carcinoma+in+the+rat+liver+by+hepatic+artery+infusion+of+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus.</a> Mol Ther. 9, 368-376 (2004).</li>
<li>Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+advanced+hepatocellular+carcinoma+in+rats+via+repeated+hepatic+arterial+infusions+of+recombinant+VSV%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV.</a> Hepatology. 41, 196-203 (2005).</li>
<li>Altomonte, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+effects+of+transarterial+viroembolization+for+multifocal+hepatocellular+carcinoma+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats.</a> Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora a injeção intratumoral direta seja, sem dúvida, o método mais simples para resultar na transdução tumoral eficiente de um único nódulo tumoral, a infusão arterial hepática representa uma via de administração ideal para atingir o CHC ortotópico multifocal. Este método provou ser seguro e eficaz para o tratamento do CHC em ratos imunocompetentes com vírus oncolíticos. Além disso, como os pacientes com CHC são tratados rotineiramente por aplicação transarterial de quimioembolização, o método descrito aqui é facilme...

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum no mundo, ea terceira principal causa de morte relacionada ao câncer, tornando-se um problema de saúde significativo 1,2. Para os pacientes que não são elegíveis para ressecção do tumor, ou aqueles aguardando transplante hepático, terapia loco-regional envolvendo embolização transarterial (TAE) ou quimioembolização transarterial (TACE) são aplicados como cuidados paliativos padrão 3,4. Estas terapias explorar a característica única de fornecimento de sangue duplo, no qual os tumores do fígado são alimentados quase exclusivamente pelo fluxo de sangue arterial hepático, enquanto o fígado circundante recebe a maioria do seu fornecimento de sangue a partir da veia portal de 5,6. Devido às eficácias muito limitado de terapias estabelecidas de carcinoma hepatocelular, os vírus oncolí ticos têm emergido como agentes terapêuticos alternativos promissores. JX-594, recentemente renomeado Pexa-Vec, é um excluído-quinase vector vaccinia timidina, armado com granulócitos-macrophage-fator estimulador de colônias (GM-CSF), que foi concluída a fase II de ensaios clínicos para HCC 7. Mais recentemente, um vector recombinante do vírus da estomatite vesicular (VSV) que expressam o interferão-beta humano entrou numa fase I de ensaios clínicos para HCC-sorafenib refractário (NCT01628640). Como os vírus oncolí ticos aproximar-se a obtenção de aprovação para a aplicação clínica de HCC em pacientes, a necessidade de uma via de administração eficaz para alvejar doença multifocal é evidente. Enquanto a libertação sistémica é largamente ineficaz devido a transdução do tumor ineficiente, aplicações intratumorais poderia limitar a eficácia da terapia para o tumor injectado, deixando lesões microscópicas uninjectable sensíveis à progressão da doença. Nós estabelecemos um método de isolamento da artéria hepática em ratos para administrar oncolytic vírus terapia de forma loco-regional para alvejar HCC ortotópico. Nós demonstramos que esta via de administração resultados em segurança e effective transdução de nódulos HCC multifocais, resultando no prolongamento de sobrevivência significativo em ratos imuno-competentes 8-10. Aqui, descrevemos o método de acesso, dissecando, e injetar na artéria hepática em ratos. Um esquema do processo é mostrado na Figura 1 (publicado anteriormente 9)

<table><tbody><tr><td>Aparadores veterinários</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>Aparador pequeno e sem fio ideal para remover pêlos da área cirúrgica</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>30 G Agulhas</td><td>Braun</td><td>4656300</td><td>30 G x &frac12; "</td></tr><tr><td>Seringas de 1 ml</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>Seringa de tuberculina</td></tr><tr><td>Bisturi descartável</td><td>Pena</td><td>2975#15</td><td>#15 lâmina&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica padrão</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13&nbsp;</td><td>Afiado/rombudo, para abrir a pele e os músculos</td></tr><tr><td>Pinça Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>1101-12</td><td>Com dentes, para agarrar a pele e os músculos</td></tr><tr><td>Afastador de Alm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17008-07</td><td>Com dentes rombos, para abrir a cavidade abdominal durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze</td><td>Lohmann & Rauscher</td><td>18504</td><td>7,5 cm x 7,5 cm, deve ser autoclavado antes do uso</td></tr><tr><td>Cotonetes aplicadores com ponta de algodão</td><td>Lohmann & Rauscher</td><td>11970</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Fine-tip foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td>0,4 mm, ponta angular, para dissecar a artéria hepática</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas Fine</td><td>Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Para corte delicado</td></tr><tr><td>Micro-agulha titular</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td>Para ligar a artéria gastroduodenal</td></tr><tr><td>Agulha titular</td><td>Fine Science Tools</td><td>12005-15</td><td>Mandíbulas de carboneto de tungstênio</td></tr><tr><td>7-0 Suturas de Prolene</td><td>Ethicon</td><td>8648H</td><td>Sutura de polipropileno com agulha curva, para ligar a artéria gastroduodenal</td></tr><tr><td>4-0 Suturas Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V3040H</td><td>Com agulha curva acoplada</td></tr><tr><td>Lâmpada de aquecimento infravermelho</td><td>Beurer</td><td>IL11</td><td>Para manter a temperatura corporal no pós-operatório</td></tr></tbody></table>

transarterial administração de oncolíticos vírus para loco-regional terapia de ortotópico hcc em ratos

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma doença com opções de tratamento limitadas e mau prognóstico. Nos últimos anos, as viroterapias oncolíticas provaram ser ferramentas potencialmente poderosas para combater a malignidade. Devido ao suprimento sanguíneo duplo exclusivo no fígado, é possível aplicar terapias localmente aos tumores hepáticos ortotópicos, que são predominantemente alimentados pelo fluxo sanguíneo arterial. Demonstramos anteriormente que a entrega arterial hepática de vírus oncolíticos resulta em eficiência de transdução segura e eficiente de lesões multifocais de CHC, resultando em prolongamento significativo da sobrevida em ratos imunocompetentes. Este procedimento imita de perto a aplicação da embolização transarterial em pacientes, que é o tratamento paliativo padrão fornecido a muitos pacientes com CHC. A capacidade de administrar terapias tumorais através da artéria hepática em ratos permite um modelo pré-clínico altamente sofisticado para avaliar novos vetores virais em desenvolvimento. Aqui descrevemos o protocolo detalhado de microdissecção da artéria hepática para infusão de vetores de vírus oncolíticos para tratar o CHC ortotópico.

Com a experiência, uma taxa de sucesso de quase 100% (o que significa que a artéria foi dissecada com sucesso e injectada, e o animal sobreviveu cirurgia) pode ser alcançado. No entanto, o estado de saúde do rato antes da cirurgia (grau de carga do tumor, a função hepática de base, etc) irá, obviamente, ter um papel no resultado da intervenção cirúrgica. Após a cirurgia, os ratos podem ser esperados para detectar a perda de peso transiente e uma ligeira elevação, transitória das...

As viroterapias oncolíticas estão em desenvolvimento como novas terapêuticas para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC). Aqui descrevemos um método para terapia locorregional do CHC via administração arterial hepática do vírus oncolítico.

Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

O objetivo geral dessa intervenção cirúrgica é administrar terapia com vírus oncolítico por via locorregional por meio da artéria hepática para lesões de carcinoma hepatocelular ortotópico ou CHC. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos vírus oncolíticos, como qual é a eficácia da terapia aplicada locorregionalmente no tratamento do CHC ortotópico? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a administração de altas titulações de vírus oncolítico em múltiplas lesões de CHC.Uma limitação da administração intratumoral ou sistêmica. Esta técnica imita a aplicação da quimioembolização transarterial. O padrão de tratamento para muitos pacientes com HCC, permitindo uma excelente transposição de dados pré-clínicos.Antes de iniciar a cirurgia, coloque os equipamentos de proteção individual apropriados e desinfete a área cirúrgica e os equipamentos com etanol 70%. Dilua o vírus até a concentração apropriada, de acordo com a toxicidade do vírus e a suscetibilidade da linhagem de rato utilizada. Em seguida, preencha previamente seringas de um mililitro com o vírus diluído e equipe as seringas com agulhas de calibre 30, tomando cuidado para remover quai

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