Name: Tratar ratos SCA1 com solúvel em água compostos não especificamente impulsionar a função mitocondrial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a avaliar compostos solúveis em água para tratar ataxia espinocerebelar tipo 1 em camundongos. Este método utiliza ácido succínico via água de beber para melhorar função mitocondrial e comportamento cerebelar.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Harry Orr, da Universidade de Minnesota, por seu generoso presente de camundongos transgênicos. Também gostaríamos de agradecer aos seguintes ex-alunos do Skidmore College por seu trabalho realizando os experimentos anteriores: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson e Cheyanne Slocum. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Skidmore College por financiar o desenvolvimento desses métodos.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Se estes métodos são usados, conforme descrito, eles são capazes de detectar e aliviar a disfunção mitocondrial mediada por fosforilação oxidativa em modelos de ratos doenças neurodegenerativas cerebelares. Os ensaios bioquímicos e comportamentais combinados são métodos multifacetadas para determinar a extensão da contribuição mitocondrial para cerebelar patologia doença neurodegenerativa. Ao tratar ratos com ácido succínico para estimular o metabolismo e aumentar a função mitocondrial, somos capazes de mostrar um resga...

As mitocôndrias são os principais produtores de trifosfato de adenosina (ATP), uma co-enzima essencial para a energia celular, com a maioria do ATP mitocondrial produzido através da fosforilação oxidativa (FOX) usando a cadeia de transporte de electrões. O cérebro, dadas as suas elevadas exigências metabólicas e sua dependência de fosforilação oxidativa para alimentar a atividade neural, é altamente suscetível a disfunção mitocondrial. Como resultado, disfunção mitocondrial é accionado durante o processo de envelhecimento 1 e está implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, 2, 3, 4. Portanto, segue-se que as mitocôndrias são alvos terapêuticos atractivos para a neurodegeneração. Neste protocolo, adotamos o uso de ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) como uma doença neurodegenerativa modelo para o estudo das mitocôndriasl disfunção e ao desenvolvimento de terapias alvo-mitocondriais. SCA1 é causada por uma mutação de poliglutamina (poliQ) expansão repetida no produto do gene ataxin-1 que desencadeia a progressiva degeneração dos neurónios de Purkinje do cerebelo e neurónios de outras regiões do cérebro. A linha transgénica rato usado aqui (designado como o rato SCA1), que expressa uma ataxin-1 transgene poliQ-mutante sob o controlo de um promotor específico de células de Purkinje, permite a análise orientada de o componente das células de Purkinje de SCA1 5. Ratos SCA1 sofrer degeneração das células de Purkinje gradual e desenvolver marcha atáxica 6. disfunção complexo mitocondrial e eficácia do tratamento alvejado-mitocondrial pode ser avaliada com uma bateria de ensaios moleculares e comportamentais. Disfunção complexo mitocondrial é medida ex vivo através de ensaios de respiração que detectam o consumo de oxigénio no tecido cerebelar alterada ema presença de substratos cadeia de transporte de elétrons e inibidores 7. Os ensaios de respiração foram previamente utilizadas com tecido permeabilizada, isolados mitocondriais, e tecido inteiro 7, 8, 9. Eles permitem a avaliação direta da função mitocondrial ao contrário dos métodos de recolha de dados morfológicos, como a microscopia eletrônica de transmissão ou imunofluorescência. O uso de tecido todo em vez de isolado mitocôndrias impede a seleção tendenciosa de mitocôndrias saudáveis que podem ocorrer durante o processo de isolamento 7. Quando adaptadas ao protocolo como mostrado, o ensaio a respiração é um valioso método para a detecção de disfunção mitocondrial em estados de doenças neurodegenerativas do cerebelo. activadores não específica de metabolismo pode ser usada para inferir a disfunção mitocondrial em modelos de ratinhos transgénicos de diseas neurodegenerativasE e auxílio no desenvolvimento de novas terapias. A quercetina, coenzima Q10 e creatina têm sido mostrados para melhorar a patologia neurodegenerativa doença em doentes e em modelos animais de doença neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Aqui nós apresentamos um novo activador metabólico, ácido succínico, para estimular o metabolismo e aumentar a função mitocondrial na doença neurodegenerativa. Para assegurar que o activador é de atravessar a barreira hemato-encefálica, a HPLC foi utilizada para detectar a entrega ao tecido neural em ratinhos tratados 17. Para avaliar os efeitos terapêuticos dos compostos solúveis em água metabolicamente alvo, tais como ácido succínico, uma bateria de paradigmas comportamentais e estudos imunopatológicos pode ser usado. due para os défices de coordenação motora encontradas na doença neurodegenerativa cerebelar, o ensaio de pista pegada, ensaio de feixe e ensaio da haste rotativa aceleração são usados para detectar salvamento de patologia comportamental 6, 18, 19. Estas medidas são completadas com a avaliação imunopatológico da citoarquitetura cerebelar, avaliando a espessura molecular camada (definido como o comprimento do mandril Purkinje dendrítica celular) e contagens de células de Purkinje soma dentro de um lóbulo definida de tecido cerebelar 6, 20, 21. Aqui apresentamos vários métodos neuropatológicas e comportamentais para a detecção e tratamento da disfunção mitocondrial com compostos solúveis em água metabolicamente alvo. Nós usamos a análise ex vivo da respiração mitocondrial para analisar a disfunção mitocondrial na tran SCA1rato sgenic. Além disso, mostra-se que os sintomas da doença e patologia são melhoradas pelo impulsionador ácido succínico mitocondrial solúvel em água, implicando ainda a disfunção mitocondrial na progressão da doença SCA1.

<table><tbody><tr><td>Difosfato de adenosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Lactobionato de potássio</td><td>Bio-Açúcares</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674<</td><td></td></tr><tr><td>em>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetrametil-p-fenilenodiamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ anticorpo (anti-ataxina-1)</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de calbindina (cabra)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>Animais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camundongos transgênicos de controle</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>camundongos SCA1</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>Camundongos do tipo selvagem</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L micrótomo</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sledge micrótomo</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Microscópio Confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de gelatina de glicerol</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Oxytherm Unidade de Controle de Eletrodo</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E. papel</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP & G</td><td></td><td>entre em contato com o autor correspondente para obter informações</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cell counter plugin (para ImageJ)</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (software rotarod)</td> <td>PPP & G</td><td></td><td>entre em contato com o autor correspondente para obter</td></tr><tr><td>informações Phidget21.dll (necessário para o software rotarod)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

tratar ratos sca1 com solúvel em água compostos não especificamente impulsionar a função mitocondrial

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

disfunção mitocondrial desempenha um papel significativo no processo de envelhecimento e em várias doenças neurodegenerativas, incluindo as ataxias espinocerebelares hereditárias e outras perturbações do movimento marcadas pela degeneração progressiva do cerebelo. O objetivo deste protocolo é avaliar disfunção mitocondrial em ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) e avaliar a eficácia da segmentação farmacológico da respiração metabólica através do ácido succínico composto solúvel em água para retardar a progressão da doença. Esta abordagem é aplicável a outras doenças cerebelares e pode ser adaptado a uma série de terapias solúveis em água. Análise ex vivo da respiração mitocondrial é utilizado para detectar e quantificar as alterações relacionadas com a doença em função mitocondrial. Com a evidência genética (dados não publicados) e as provas proteômica de disfunção mitocondrial no modelo do rato SCA1, podemos avaliar a eficácia do tratamento com o metabólica impulsionador s solúvel em águaácido uccinic por dissolução deste composto directamente na água de beber casa gaiola. A capacidade do fármaco para passar a barreira hemato-encefálica pode ser deduzida utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A eficácia destes compostos pode ser testada usando múltiplos paradigmas comportamentais, incluindo o rotarod aceleração, teste trave de equilíbrio e análise da pegada. integridade citoarquitectónica do cerebelo pode ser avaliada através de imunofluorescência que detectam os núcleos das células de Purkinje e dendritos das células de Purkinje e soma. Estes métodos são técnicas robustas para a determinação da disfunção mitocondrial e a eficácia do tratamento com compostos solúveis em água na doença neurodegenerativa cerebelar.

Através de segmentação farmacológico da mitocôndria cerebelar com ácido succínico somos capazes de prevenir a disfunção mitocondrial em um modelo do rato do cerebelar SCA1 doença neurodegenerativa. O doador de electrões canónica de succinato desidrogenase, ácido succínico, foi dissolvido em água potável casa gaiola de ratos SCA1 durante um mês, com início avaliação comportamental durante a segunda semana de tratamento e a avaliação neuropatológico após o tratamento (Figura</stron...

Apresentamos um protocolo bioquímico e comportamental para avaliar a eficácia de compostos solúveis em água direcionados às mitocôndrias para o tratamento da ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) e outras doenças neurodegenerativas cerebelares.

Tratar ratos SCA1 com solúvel em água compostos não especificamente impulsionar a função mitocondrial

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

O objetivo geral deste experimento é observar e quantificar os efeitos terapêuticos dos ativadores mitocondriais solúveis em água no comportamento e tecido cerebelar em camundongos com ataxia cerebelar espinhal tipo um. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de ataxia cerebelar espinhal, como os déficits mitocondriais contribuem para a patologia da doença e podem ser impedidos por um ativador mitocondrial solúvel em água. A principal vantagem dessa técnica é que o ácido succínico é um composto solúvel em água barato aprovado pela FDA que pode ser entregue diretamente no cérebro através da água potável.As implicações dessa técnica podem se estender a uma terapia de outras doenças neurodegenerativas porque déficits nos complexos de fosforilação oxidativa mitocondrial são encontrados em várias doenças neurodegenerativas, incluindo Alzheimer e doença de Huntington. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a configuração inicial dos paradigmas comportamentais que podem ter que ser ajustados para alcançar resultados consistentes. A demonstração visual desse método é benéfica porque as etapas comportamentais podem ser difíceis de reproduzir a partir de uma seção de método escrita, mas são fáceis de replicar com o auxílio de uma gravação visual.Para iniciar este procedimento, coloque a pista em um leve ângulo para cima em direção à caixa inicial, forrada com roupas de cama e comida de recompensa. Em seguida, forre uma folha de papel branco na passarela. Deixe o mouse se aclimatar à caixa inicial por cinco minutos.Em seguida, pegue um único assunto e pinte as patas traseiras esquerda e direita com tinta à base de água não tóxica azul e vermelha, respectivamente. Depois, coloque o assunto no início da pista e deixe-o caminhar até a caixa inicial. Assim que o sujeito chegar à caixa inicial, feche o alçapão e deixe-o permanecer dentro da caixa inicial por um minuto antes de retornar à respectiva gaiola inicial.Em seguida, limpe a pista e a caixa inicial com 30% de etanol e substitua a roupa de cama, a comida de recompensa e o papel da pista para o próximo teste. Ao mesmo tempo, colete o papel da pista após o experimento e inspecione o teste. Um teste de pegada bem-sucedido é definido como um mínimo de cinco pegadas sequenciais nas quais o sujeito caminha em direção à caixa de ouro sem se virar ou parar.Agora configure o aparelho de feixe de acordo com as especificações cruzadas da barra com seis feixes diferentes. Em uma extremidade da viga, coloque uma caixa doméstica escura com comida de recompensa. Para treinar assuntos no feixe, monte o aparelho com o feixe três.Coloque suavemente o assunto na extremidade do feixe oposto à caixa inicial. E permita que ele atravesse a viga. Permita que cada sujeito faça até três tentativas de dois minutos para obter uma corrida bem-sucedida.Que é definido como cruzar a viga e entrar na caixa inicial em dois minutos. No quarto dia de treinamento de feixe, monte o aparelho com o feixe um. E configure a caixa inicial.Coloque uma câmera de vídeo na frente do aparelho e verifique se o aparelho de feixe completo pode ser claramente capturado em vídeo. Permita que o mouse atravesse o feixe, filmando cada tentativa e registrando o número de tentativas bem-sucedidas por sujeito por feixe. Nesta etapa, aclimate os sujeitos ao reservatório da pista por 10 minutos antes do início do teste.Durante este período de aclimatação, prepare o aparelho rotarod limpando cada pista do aparelho com 30% de etanol. Em seguida, abra o software rotarod. Defina as configurações de partida para quatro RPM, as configurações de aceleração para cinco minutos e as configurações de velocidade final para 40 RPM para fornecer uma aceleração constante de quatro a 40 RPM durante um período de cinco minutos.Após o período de aclimatação, coloque os assuntos na haste rotativa em suas respectivas pistas enquanto a haste está girando a quatro RPM. Assim que todos os sujeitos estiverem em suas respectivas pistas, comece o primeiro teste. Registre a latência para cair usando o software do instrumento.Um temporizador secundário pode ser empregado como backup. Após a conclusão do teste, permita que cada sujeito descanse em seus respectivos reservatórios de pista por 10 minutos antes do próximo teste para evitar fadiga. Neste procedimento, conecte a tubulação da caixa de controle de temperatura de um micrótomo de trenó do palco a uma torneira de pia.Use a caixa de controle de temperatura para resfriar o micrótomo stage a 28 graus Celsius. Em seguida, ajuste o botão de espessura de corte para 50 micrômetros. Em seguida, passe uma porção do tamanho de uma moeda de dez centavos da solução OTC no palco.Antes que o OTC congele, use uma pinça para posicionar o hemisfério de modo que a superfície de corte sagital médio fique voltada para baixo na camada OTC. Oriente o tecido de forma rápida e suave para que a ponta lateral do hemisfério aponte para a lâmina. Superior ao palco.Trabalhando em camadas, adicione OTC adicional ao redor do tecido e deixe o OTC congelar totalmente antes de adicionar a próxima camada. Em seguida, adicione uma fina camada de OTC em cima do tecido e congele-o. Em seguida, corte o tecido com o mesmo peso corporal distribuído na lâmina de corte.Colete as seções usando um pincel de artista plástico. E coloque-os em uma placa de poço apropriadamente rotulada contendo um XPBS. Entre as seções, redefina a espessura de corte para 50 micrômetros, se necessário.Após o seccionamento, substitua o PBS em cada poço da placa por solução de ureia. E coloque o prato no gelo. Quando estiver pronto, transfira a placa para um bloco de aquecimento ajustado para a temperatura de ebulição para ferver as seções em solução de ureia, a fim de desmascarar os epítopos para imunomarcação.Entre cada etapa de ebulição, resfrie a placa contendo as seções de tecido no gelo. Após a fervura, lave as secções três vezes, substituindo a solução presente por um XPBS e agitando as secções durante 10 minutos. Em seguida, bloqueie as seções com solução de soro de burro, incubando-as em soro por uma hora com agitação suave em temperatura ambiente.As seções agora podem ser manchadas. Uma vez rotuladas, monte as seções em lâminas revestidas com gelatina a 2% com meio de montagem para reduzir o fotobranqueamento. Cubra a lamínula e seque durante a noite a quatro graus Celsius.Em seguida, sele as lamínulas com esmalte e guarde a quatro graus Celsius. Usando um microscópio confocal de varredura, localize a fissura primária do cerebelo sob a luz do campo brilhante. A etapa mais crítica do ensaio amino é localizar com precisão o tecido cerebelar nos módulos cinco e seis A que flanqueiam a fissura primária.A análise de padrões de coloração e lóbulos inconsistentes garantirá a variabilidade do seu resultado. Com uma objetiva de 10X, escaneie e excite sequencialmente os canais DAPI, Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594. Usando um laser de diodo de 405 nanômetros, um laser de gás argônio de 488 nanômetros e um laser de diodo de 559 nanômetros, respectivamente, em conjunto com um divisor de feixe dicróico de 488559 nanômetros.Em seguida, separe e colete a luz emitida usando divisores de feixe SDM 490 e SDM 560 e um filtro passa-banda BA 575675, respectivamente. O ácido succínico foi dissolvido na água potável da gaiola doméstica de camundongos SCA1 por quatro semanas a partir das 17 semanas de idade. Os camundongos SCA1 começam a exibir o fenótipo de ataxia às cinco semanas de idade.As avaliações comportamentais foram realizadas durante o período de tratamento da seguinte forma. Ensaio de pegada durante a semana 17. Ensaio de feixe durante a semana 18 e aceleração da haste rotativa durante a semana 19.Com 20 semanas de idade, os camundongos foram sacrificados e o tecido cerebelar foi colhido para ensaios de patologia aminológica, HPLC e ensaios de respiração. Aqui estão os dados representativos do ensaio de pegada mostrando uma porta do tipo selvagem tratada com veículo, uma porta SCA1 tratada com veículo e uma porta SCA1 tratada com ácido succínico. Aqui, os dados de análise de feixe mostram a melhoria no desempenho do feixe de camundongos SCA1 com tratamento com ácido succínico.O tratamento com ácido succínico melhora significativamente o desempenho acelerado do rotarod de camundongos SCA1, conforme mostrado pelo aumento da latência para queda. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aplicar a técnica de forma consistente a cada sujeito em várias tentativas. Após este procedimento, outros métodos, como a respiração mitocondrial, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a respiração por meio de complexos de fosforilação oxidativa individuais melhorados após a administração de ácido succínico.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar ensaios comportamentais e neuropatológicos. Que avaliam a melhora do comportamento cerebelar e da citoarquitetura.

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