Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar células progenitoras de oligodendrócitos de ratos e quantificar a oligodendrogênese em resposta a fatores experimentais. A oligodendrogênese eficiente é o objetivo terapêutico em várias áreas de pesquisa, incluindo lesão medular, hipóxia neonatal e doenças desmielinizantes, como mielite transversa e esclerose múltipla. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina um protocolo para o isolamento de um grande número de OPCs com um método rápido e confiável para determinar a oligodendrogênese em várias condições experimentais simultaneamente.

Para iniciar este procedimento, esterilize todo o equipamento de dissecção usando um esterilizador de esferas aquecido. Em seguida, adicione 15 a 20 mililitros de PBS a um tubo cônico de 50 mililitros. Coloque o tubo cônico no gelo e use-o para segurar o tecido do córtex em cubos durante a dissecção.

Em seguida, adicione PBS frio a uma placa de Petri de 10 centímetros que será usada para dissecação sob o microscópio de luz. Depois de sacrificar os filhotes de rato, corte a pele atrás das orelhas ao longo da linha média usando uma tesoura pequena. E retire as abas da pele para trás.

Em seguida, corte o crânio ao longo da linha média do tronco cerebral até os olhos. E tome cuidado para não cortar muito fundo para preservar a estrutura do córtex subjacente. Depois disso, faça dois cortes laterais inferiores ao cerebelo, inserindo uma pequena tesoura cirúrgica no forame magno.

Faça um corte adicional entre os olhos anterior aos bulbos olfatórios. Descasque cuidadosamente cada metade do crânio para trás. Remova todo o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros cheia de PBS frio.

Sob um microscópio de luz de dissecação, remova os bulbos olfatórios e o cerebelo com uma pinça cirúrgica fina. Vire o cérebro para que a superfície ventral fique visível. Em seguida, usando uma pinça reta fina, faça uma dissecção romba colocando as pontas das pinças fechadas entre o córtex e o hipotálamo a uma profundidade de cerca de dois terços do cérebro.

Abra a pinça quando estiver no lugar e repita o procedimento para o outro hemisfério. Depois disso, provoque o córtex das regiões do hipotálamo e do mesencéfalo. Remova o hipotálamo, o tálamo e o mesencéfalo segurando o mesencéfalo em sua superfície posterior e descascando-o em direção à extremidade anterior do cérebro.

Posteriormente, corte as conexões anteriores. Usando uma pinça de dissecção dobrada fina, remova o hipocampo e corte sua conexão com o córtex. Em seguida, remova o estriado restante raspando-o do córtex subjacente em um movimento diagonal para fora.

Limpe os vasos sanguíneos e as meninges da superfície ventral do córtex. Em seguida, vire o cérebro para que a superfície dorsal fique visível. Descasque as meninges do córtex subjacente, onde o bulbo olfatório está localizado.

Repita os procedimentos para um total de três a quatro filhotes de ratos. E coloque todos os córtices dissecados em uma placa de Petri. Pique-os com uma lâmina de barbear esterilizada até obter pedaços de um milímetro por um milímetro.

Em seguida, colete os lenços enxaguando o prato com PBS antes de colocá-lo de volta no gelo. Agora, usando uma pipeta Pasteur de vidro conectada a um controlador de pipeta, dissocie mecanicamente o tecido pipetando dez a quinze vezes ou até que os pedaços de tecido sejam reduzidos em tamanho e a solução fique turva. Em seguida, retorne a amostra para a incubadora de cultura de tecidos de 37 graus Celsius por 15 minutos com rotação contínua.

Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS a cada amostra e filtre o homogeneizado através de um filtro de poros de 40 micrômetros colocado sobre um tubo de 50 mililitros. Em seguida, enxágue o filtro com mais um a dois mililitros de PBS. Agrupe todas as amostras homogeneizadas em um tubo cônico de 50 mililitros e adquira uma contagem geral de células.

Depois de realizar a contagem de células, dividir o homogeneizado uniformemente nos tubos cônicos de 15 mililitros e centrifugá-los por 10 a 12 minutos a 300 gs. Prepare cada coluna LS adicionando cinco mililitros de buffer de coluna. E colete o fluxo através de um tubo cônico de 15 mililitros.

Uma vez que o tampão da coluna tenha passado completamente pela câmara superior, aplique 1000 microlitros da suspensão celular em cada coluna e deixe as células passarem por gravidade. Em seguida, remova cada coluna e coloque-a em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de buffer de coluna e mergulhe o buffer na coluna rapidamente para desalojar as células ligadas e liberá-las da coluna.

Para plaquear as células, dilua-as com meios de proliferação OPC a 60.000 células por mililitro. Pipete 500 microlitros de células ao longo do lado de cada poço de fundo preto e transparente de uma placa de 24 poços. Misture as células agitando a placa horizontalmente, usando um movimento em forma de oito.

Neste procedimento, coloque uma ponta de pipeta de 200 microlitros sobre uma pipeta Pasteur de vidro para garantir que o poço não seja danificado durante a aspiração. Em seguida, aspire o meio dos poços de cultura, um grupo de tratamento de cada vez, para evitar o ressecamento das células. Depois disso, adicione lentamente 500 microlitros de mistura mestre de tratamento ao longo da lateral do poço usando uma pipeta de um mililitro.

Incube as culturas e realize uma troca completa de meios com novos meios de tratamento a cada dois ou três dias. No final do período de tratamento desejado, aspire a mídia. Adicione lentamente 400 microlitros de PFA na lateral do poço para fixar as células.

E incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente. Após 20 minutos, aspire PFA e adicione lentamente 500 microlitros de D-PBS estéril para lavar as células. Repita a lavagem mais duas vezes e não aspire a lavagem final.

Agora, leve a placa à temperatura ambiente, aspire os poços e adicione 250 microlitros de D-PBS contendo cinco por cento de NGS e 0,1 por cento de Triton x-100. Incube a placa em temperatura ambiente por uma hora com agitação orbital suave. Preparar a solução de incubação primária diluindo o anticorpo monoclonal anti-MBP de ratinho e o anticorpo policlonal anti-olig2 de coelho em D-PBS contendo cinco por cento de NGS.

Em seguida, incube os anticorpos primários a quatro graus Celsius durante a noite por 16 a 18 horas com uma leve agitação orbital. Enquanto lava a placa, prepare a solução de incubação secundária diluindo os anticorpos anti-camundongo 680 e anti-coelho 800 em D-PBS contendo cinco por cento de NGS. Em seguida, aspire a lavagem final e adicione 250 microlitros de solução de incubação secundária.

Proteja a placa da luz e incube-a à temperatura ambiente durante uma hora com uma agitação orbital suave. Depois disso, escaneie a placa usando um sistema de imagem capaz de detectar emissões de fluorescência de 700 nanômetros e 800 nanômetros. Como ponto de partida, defina o deslocamento focal para três e as sensibilidades para um vírgula cinco para MBP, cinco vírgula zero para actina e três vírgula cinco para olig2.

Ajuste os valores de sensibilidade conforme necessário para evitar a superexposição do sinal. Neste esquema, o ensaio DIFS começa com OPCs de rato positivos para A2B5 recém-isolados em recipientes de cultura codificados por PLL. Essas culturas são proliferadas por três dias na presença de 20 nanogramas por mililitro de PDGFAA e, em seguida, tratadas com fatores experimentais em meio fresco livre de PDGF no dia zero.

O meio de tratamento é totalmente reabastecido no segundo dia. E as células são fixadas com paraformaldeído a 4% no quarto dia. Aqui, a imunocitoquímica para olig2 e MBP foi realizada nas culturas representativas no dia zero e no quarto dia usando Dapi como contra-coloração nuclear.

Essas culturas exibem coloração constitutiva para o marcador celular da linhagem de oligodendrócitos pan, Olig2, nos dias zero e quatro. Considerando que a coloração para o marcador de oligodendrócitos maduros MBP só foi evidente no quarto dia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar, cultivar e diferenciar OPCs de ratos positivos para A2B5 para quantificar o efeito de fatores experimentais na oligodendrogênese.

A identificação de fatores que promovem a oligodenrogênese é de particular relevância para o estudo de doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla. Uma vez dominadas, as técnicas descritas aqui podem ajudar a identificar esses fatores e, finalmente, desenvolver melhores terapêuticas.