Name: Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células progenitoras de oligodendrócitos de ratos e quantificar a oligodendrogênese in vitro. Este método avança pesquisas em lesões da medula espinhal e doenças desmielinizantes.

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<ol><li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li>
<li>Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
<li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+glial+cells%3A+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropath+Exp+Neur%22%5BJournal%5D)">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li>
<li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li>
<li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li>
<li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+deficient+mice%3A+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li>
<li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+%28Jimpy%3B+quaking%3B+Trembler%3B+shiverer+and+its+mld+allele%29+obtained+by+zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li>
<li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+thyroid+hormone+%CE%B2+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li>
<li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li>
<li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui apresentado descreve um método rápido e fiável para o isolamento e quantificação de rato OPCs no oligodendrogenesis vitro em resposta a factores experimentais. Usando selecção positiva, altos rendimentos de OPCs viáveis ​​e puros são usados ​​diretamente para fins experimentais. Este método simplifica o isolamento, cultivo, e passos de diferenciação em um quadro de tempo de 1 semana, e as células fixas pode ser convenientemente armazenada a 4 ° C, durante várias semanas, sem qualquer p...

condução do nervo eficiente no sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) requer a mielinização dos axónios por oligodendrócitos. Durante o desenvolvimento, oligodendrócitos surgem a partir de um conjunto de células progenitoras de oligodendrócito (OPCs) que estão pensados ​​para migrar das zonas do ventrículo do cérebro anterior e do tubo neural em desenvolvimento 1. Depois de OPCs migração diferenciar em oligodendrócitos, maduros myelinating que não só facilitar a propagação do impulso eficiente, mas também fornecer axônios com suporte trófico 2. O adulto CNS mantém uma população abundante de OPCs que estão dispersos em toda a matéria cinzenta e branca que compreende cerca de 5-8% de todas as células 3. Após um insulto desmielinizante, OPCs migram para o local da lesão, proliferar, diferenciar e para substituir as bainhas de mielina perdidas ou danificadas em axónios expostas. No entanto, em algumas configurações de doença / lesão, este processo é encontrado para ser ineficiente ou pode falhar completamente 4. Enquantodesmielinização crónica é pensado para aumentar a carga de doença, oligodendrogenesis eficiente e remielinização pode aliviar os sintomas 5. Tem sido, portanto, de interesse para o estudo OPCs in vitro para determinar o efeito dos factores experimentais sobre oligodendrogenesis. Visão sobre as diferentes fases de diferenciação de oligodendrócitos tem sido possível pela identificação de marcadores de células específicas do estágio. A auto-renovação de células progenitoras iniciais são definidas pela sua expressão de plaquetas derivadas de receptores de factor de crescimento alfa (PDGFRα), antigénio neuronal / glia 2 (NG2) e A2B5 6-8. Como OPCs iniciar o seu programa de diferenciação e retirar-se do ciclo celular, eles regular negativamente a expressão destes marcadores e começam a expressar proteínas indicativas de premyelinating incluindo oligodendrócitos cíclica-fosfodiesterase de nucleótidos 3&#39;-(CNPase) e O4. Finalmente, a sua diferenciação em oligodendroc mais maduroytes é caracterizada pela expressão de proteínas associadas à mielina, incluindo a glicoproteína associada à mielina (MAG), proteína proteolipidica (PLP), e proteína básica de mielina (MBP). MBP é uma proteína de membrana periférica intracelular e um grande componente da bainha de mielina. Camundongos sem MBP desenvolver um fenótipo grave em que a mielinização do SNC é significativamente diminuir, levando a tremores, convulsões e morte precoce 9,10. Este papel importante de MBP na mielinização tem levado ao seu uso como um marcador de diferenciação de oligodendrócitos in vitro e in vivo 11. Quantificação da MBP pode ser conseguido usando várias metodologias diferentes. A análise de Western blot e RT-PCR para permitir que a quantificação dos níveis de MBP sob diferentes regimes de tratamento. Imunocitoquímica é uma abordagem qualitativa comum que também pode ser quantitativa, quando são usados ​​métodos de microscopia baseado em câmera. Embora estes sistemas sejam fiáveis ​​e fundamentalo estudo da diferenciação de oligodendrócitos, cada um tem as suas próprias desvantagens que limitam a sua utilização na triagem de drogas. Em primeiro lugar, a quantidade de OPCs primárias que são necessários para RT-PCR e análise por Western blot reduz o número de variáveis ​​que podem ser examinados simultaneamente. Embora a exigência celular para imunocitoquímica é muito menor, um tempo considerável deve ser dedicado a cada experiência, se a quantificação é o objetivo. Numerosos imagens devem ser capturados e, em seguida quantificado para facilitar a análise experimental. Estas advertências tornam-se obstáculos importantes a considerar para estudos que requerem avaliação de alto rendimento. Descrevemos aqui um método que utiliza os aspectos fundamentais de tanto a imunocitoquímica e metodologias de Western blot para quantificação de mielina, enquanto reduz significativamente tanto o número de células necessário para completar o tempo e a análise quantitativa.

<table><tbody><tr><td>Materiais de dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca2+ e Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm Placas de Petri de Poliestireno</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção de Luz</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>Dissociação Materiais</td>Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissociação de Tecido Neural Rotador de Tubo de Dissociação (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Kit de Dissociação Enzimática</td></tr><tr><td>PBS com Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>40 &mu; Filtro de Células M</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>A2B5 Coluna de Purificação&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5 Microesferas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td> Colunas LS de <td>Anticorpo A2B5 Ligado</td></tr><tr><td>a</td> Contas <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Colunas de Seleção Magnética</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS com Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>Materiais de Cultura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Triiodotironina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Sal de fumarato de clemastina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Sal de hemifumarato de quetiapina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng / ml</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>de selenito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng / ml</td></tr><tr><td>de hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng / ml</td></tr><tr><td>d-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>de insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>de Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Elementos Traços B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Visiplate preto de 24 poços com tampa</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Grau de cultura</td></tr> <tr><td>de tecidos<forte>Imunocitoquímica e Quantificação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Normal Soro de Cabra</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5% de sucesso</td></tr><tr><td>camundongo monoclonal anti-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1.000 Diluição</td></tr><tr><td>coelho policlonal anti-Actina</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Diluição</td></tr><tr><td>coelho policlonal anti-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1.000 Diluição</td></tr><tr><td>cabra anti-camundongo 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Diluição</td></tr><tr><td>cabra anti-coelho 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-rato para cabras</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-coelho para cabras</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Prolongar o anti-desbotamento Gold com DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS com Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Sistema de Imagem Infravermelho</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de culturas de rat oligodendrocyte progenitoras e quantificação de oligodendrogenesis usando scanning fluorescência dual-infravermelho

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

A oligodendrogênese eficiente é o objetivo terapêutico de várias áreas de pesquisa, incluindo lesão medular, hipóxia neonatal e doenças desmielinizantes, como esclerose múltipla e mielite transversa. A mielinização é necessária não apenas para facilitar a rápida propagação do impulso dentro do sistema nervoso central, mas também para fornecer suporte trófico aos axônios subjacentes. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) podem ser estudadas in vitro para ajudar a identificar fatores que podem promover ou inibir a diferenciação de oligodendrócitos. Até o momento, muitos dos métodos disponíveis para avaliar esse processo exigiram um grande número de células, limitando assim o número de condições que podem ser investigadas a qualquer momento, ou métodos de quantificação trabalhosos. Aqui, descrevemos um protocolo para o isolamento de um grande número de OPCs altamente puros, juntamente com um método rápido e confiável para determinar a oligodendrogênese de várias condições simultaneamente. As OPCs são isoladas de córtices de ratos neonatais P5-P7 e cultivadas in vitro por três dias antes da diferenciação. Quatro dias após a diferenciação, a oligodendrogênese é avaliada usando um ensaio de varredura de fluorescência de infravermelho duplo para determinar a expressão da proteína mielina.

OPCs A2B5-positivas são isoladas através de selecção celular positiva usando um sistema de separação coluna magnética. Antes do procedimento de isolamento, o cérebro inteiro é removido filhotes de ratos que estão entre P5 e P7. Uma vez que todo o cérebro é separado com sucesso a partir do crânio, as lâmpadas olfactivo e no cerebelo são removidos com pinças cirúrgicas finas (Figura 1A). A fim de isolar o tecido cortical cerebral do hipotálamo, tálamo e mesencéfalo são exc...

Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar células progenitoras de oligodendrócitos de rato e quantificar a oligodendrogênese em resposta a fatores experimentais. A oligodendrogênese eficiente é o objetivo terapêutico em diversas áreas de pesquisa, incluindo lesão medular, hipóxia neonatal e doenças desmielinizantes como mielite transversa e esclerose múltipla. A principal vantagem desta técnica é que ela combina um protocolo para o isolamento de grandes quantidades de COPs com um método rápido e confiável para determinar a oligodendrogênese em múltiplas condições experimentais simultaneamente.Para iniciar este procedimento, esterilize todo o equipamento de dissecação utilizando um esterilizador de contas aquecido. Em seguida, adicione 15 a 20 mililitros de PBS a um tubo cônico de 50 mililitros. Coloque o tubo cônico sobre gelo e utilize-o para manter o tecido cortical picado durante a dissecação.Em seguida, adicione PBS frio a uma placa de Petri de 10 centímetros que será usada para a dissecação sob o microscópio óptico. Após sacrificar os filhotes de rato, corte a pele atrás das orelhas ao longo da linha média usando uma tesoura pequena e puxe as abas da pele para trás.Em seguida, corte o crânio ao longo da linha média, do bulbo raquidiano até os olhos. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, a fim de preservar a estrutura do córtex subjacente. Depois disso, faça dois cortes laterais inferiores ao cerebelo inserindo pequenas tesouras cirúrgicas no forame magno.Realize um corte adicional entre os olhos, anterior aos bulbos olfativos. Retire cuidadosamente cada metade do crânio. Remova todo o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros cheia com PBS frio.Sob um microscópio estereoscópico, remova os bulbos olfativos e o cerebelo com pinças cirúrgicas finas. Vire o cérebro de modo que a superfície ventral fique visível. Em seguida, utilizando pinças retas finas, realize uma dissecação romba colocando as pontas fechadas das pinças entre o córtex e o hipotálamo até uma profundidade de aproximadamente dois terços do cérebro.Abra a pin&ccedil;a assim que estiverem posicionadas, depois repita o procedimento para o outro hemisf&eacute;rio. Em seguida, separe cuidadosamente o c&oacute;rtex das regi&otilde;es hipotal&acirc;mica e do mesenc&eacute;falo. Remova o hipot&aacute;lamo, t&aacute;lamo e mesenc&eacute;falo segurando o mesenc&eacute;falo em sua superf&iacute;cie posterior e puxando-o em dire&ccedil;&atilde;o &agrave; extremidade anterior do c&eacute;rebro.Posteriormente, seccione as conexões anteriores. Usando pin&ccedil;as de disseca&ccedil;&atilde;o finas e curvadas, remova o hipocampo e seccione sua conex&atilde;o com o c&oacute;rtex. Em seguida, remova o estriado remanescente raspando-o do c&oacute;rtex subjacente com um movimento diagonal para fora.Remova os vasos sanguíneos e as meninges da superfície ventral do córtex. Em seguida, vire o cérebro de modo que a superfície dorsal fique visível. Remova as meninges do córtex subjacente onde está localizado o bulbo olfatório.Repita os procedimentos para um total de três a quatro filhotes de rato. Coloque todas as cortesias dissecadas em uma placa de Petri. Corte-as com uma lâmina de barbear esterilizada até obter pedaços de um milímetro por um milímetro.Em seguida, colete os tecidos lavando a placa com PBS antes de colocá-la novamente no gelo. Agora, utilizando uma pipeta de vidro de Pasteur acoplada a um controlador de pipeta, dissocie mecanicamente o tecido pipetando de dez a quinze vezes ou até que os fragmentos de tecido diminuam de tamanho e a solução torne-se turva. Em seguida, retorne a amostra ao incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por 15 minutos com rotação contínua.Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS a cada amostra e filtre o homogenato através de um filtro com poros de 40 micrômetros colocado sobre um tubo de 50 mililitros. Então, lave o filtro com um a dois mililitros adicionais de PBS. Reúna todas as amostras de homogenato em um único tubo cônico de 50 mililitros e obtenha uma contagem celular total.Após realizar a contagem celular, divida o homogenato igualmente em tubos cónicos de 15 mililitros e centrifugue por 10 a 12 minutos a 300 ×g. Prime cada coluna LS adicionando cinco mililitros de tampão da coluna. E colete o fluxo passante em um tubo cónico de 15 mililitros.Uma vez que o tampão da coluna tenha passado completamente pela câmara superior, aplique 1000 microlitros da suspensão celular em cada coluna e permita que as células passem por gravidade. Em seguida, remova cada coluna e coloque-a em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de tampão da coluna e empurre rapidamente o tampão através da coluna para desalojar as células ligadas e liberá-las da coluna.Para semear as células, dilua-as em meio de proliferação de OPC até obter 60.000 células por mililitro. Pipete 500 microlitros de células ao longo da lateral de cada poço de uma placa de 24 poços com fundo transparente e bordas pretas. Misture as células agitando a placa horizontalmente, utilizando um movimento em forma de oito.Neste procedimento, coloque uma ponteira de pipeta de 200 microlitros sobre uma pipeta de vidro de Pasteur para garantir que o poço não seja danificado durante a aspiração. Em seguida, aspire o meio dos poços de cultura um grupo de tratamento por vez para evitar o ressecamento das células. Depois disso, adicione lentamente 500 microlitros da mistura mestra de tratamento ao longo da parede do poço utilizando uma pipeta de um mililitro.Incube as culturas e realize uma troca completa do meio com meio de tratamento fresco a cada dois ou três dias. Ao final do período de tratamento desejado, aspire o meio. Adicione lentamente 400 microlitros de PFA ao lado do poço para fixar as células.E incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente. Após 20 minutos, aspire o PFA e adicione lentamente 500 microlitros de D-PBS estéril para lavar as células. Repita a lavagem mais duas vezes e não aspire a lavagem final.Agora, leve a placa à temperatura ambiente, aspire os poços e adicione 250 microlitros de D-PBS contendo cinco por cento de NGS e 0,1 por cento de Triton X-100. Incube a placa à temperatura ambiente por uma hora com agitação orbital suave. Prepare a solução de incubação primária diluindo o anticorpo monoclonal de camundongo anti-MBP e o anticorpo policlonal de coelho anti-olig2 em D-PBS contendo cinco por cento de NGS.Em seguida, incubar os anticorpos primários a quatro graus Celsius durante a noite por 16 a 18 horas com agitação orbital suave. Enquanto lava a placa, preparar a solução de incubação secundária diluindo os anticorpos anti-rato 680 e anti-coelho 800 em D-PBS contendo cinco por cento de NGS. A seguir, aspirar a lavagem final e adicionar 250 microlitros da solução de incubação secundária.Proteja a placa da luz e incube-a à temperatura ambiente por uma hora com agitação orbital suave. Em seguida, escaneie a placa utilizando um sistema de imagem capaz de detectar emissões de fluorescência em 700 nanômetros e 800 nanômetros. Como ponto inicial, ajuste o deslocamento focal para três e as sensibilidades para um ponto cinco para MBP, cinco ponto zero para actina e três ponto cinco para olig2.Ajuste os valores de sensibilidade conforme necessário para evitar a superexposição do sinal. Neste esquema, o ensaio DIFS começa com OPCs de rato positivos para A2B5 recém-isolados, semeados em frascos de cultura revestidos com PLL. Essas culturas são proliferadas por três dias na presença de 20 nanogramas por mililitro de PDGFAA e, em seguida, tratadas com fatores experimentais em meio fresco, livre de PDGF, no dia zero.O meio de tratamento é completamente renovado no segundo dia. E as células são fixadas com paraformaldeído a 4% no quarto dia. Aqui, a imunocitoquímica para olig2 e MBP foi realizada nas culturas representativas no dia zero e no dia quatro, utilizando Dapi como contracorante nuclear.Essas culturas exibem coloração constitutiva para o marcador pan-lineagem de oligodendrócito, Olig2, nos dias zero e quatro. Enquanto a coloração para o marcador de oligodendrócito maduro MBP foi evidente apenas no dia quatro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar, cultivar e diferenciar OPCs de rato positivos para A2B5, a fim de quantificar o efeito de fatores experimentais sobre a oligodendrogênese.A identificação de fatores que promovem a oligodendrogênese é de particular relevância para o estudo de doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla. Uma vez dominadas, as técnicas descritas aqui podem ajudar a identificar tais fatores e, em última instância, desenvolver terapias melhores.

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais...

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar os neurônios ganglionares da retina (RGNs) da retina de um rato e cocultivá-los com células da glia de revestimento olfativo (OEG). Este método permite estudar o potencial neuro-regenerativo dos OEGs após lesão neural.

Cocultura de neurônios ganglionares da retina com glia de revestimento olfativo

O vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) em oligodendrócitos e induzir mielinização em uma co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG). As OPCs são transduzidas com vetores lentivirais que codificam uma proteína sinalizadora que regula a mielinização. Os OPCs transduzidos são co-cultivados com neurônios DRG para avaliar a diferenciação em oligodendrócitos e a mielinização induzida por proteína de sinalização.

Um ensaio de mielinização induzida por transdução in vitro para células precursoras de oligodendrócitos

Fonte: Schott, J. T., }et al. Preparação de culturas progenitoras de oligodendrócitos de ratos e quantificação da oligodendrogênese usando varredura de fluorescência de infravermelho duplo. J. Vis. Exp. (2016).  Este vídeo demonstra o uso de imagens de fluorescência dupla para avaliar a diferenciação de oligodendrócitos de células precursoras (OPCs) isoladas de um cérebro de filhote de rato. O processo inclui fixar as células, rotular marcadores específicos com anticorpos primários e...

Imagem de fluorescência dupla para identificar oligodendrócitos diferenciados

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultura de neurônios ganglionares da retina de ratos axotomizados com glia de revestimento olfativo, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020). Este vídeo demonstra imagens e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares da retina (RGNs) de ratos axotomizados co-cultivados com células da glia olfativas humanas imortalizadas. Os RGNs são imunomarcados, com somas vermelhos e axônios verdes. As imagens foram...

Imagem e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares retinianos de ratos axotomizados

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.

Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

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Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Aprenda a isolar e cultivar células progenitoras de oligodendrócitos de ratos e quantificar a oligodendrogênese in vitro. Este método avança pesquisas em lesões da medula espinhal e doenças desmielinizantes.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

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