Name: Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda um método rápido de intubação traqueal em camundongos para administração de reagentes em pesquisa pulmonar. Esta técnica reprodutível não requer equipamentos especializados e minimiza danos aos tecidos circundantes.

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Os autores agradecem Brian Johnson da Histologia e imagem Núcleo da Universidade de Washington para obter ajuda com a coloração tricromo e análise. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL098067 e HL089455.

Os Comitês Institucionais de Animais Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Washington e Cedars-Sinai Medical Center aprovaram o animal de trabalho necessário para estes estudos. 1. Preparação <ol><li> Esterilizar ambas as pinças de extremidade embotada e o autoclave através de depressor. </li><li> Usando uma câmara de segurança biológica, prepare um estoque de trabalho de BLM em PBS a partir do pó liofilizado. Sonicar a solução durante 10 min a 35 kHz a assegurar uma mistura uniforme. Nota: Um volume total de entre 30 e 45 uL é recomendado para evitar a variação de pipetagem na extremidade baixa, e asfixia com volumes maiores. </li><li> Prepare um espaço de trabalho limpo, que inclui cerca de 1 m 2 para o procedimento em si, bem como locais designados para gaiolas antes e após o procedimento. </li><li> Fixar a placa de base do procedimento para o banco imediatamente em frente do investigador por a disposição de 2 ou 3 tiras de fita laboratório através da base e Sublinharying banco. Veja a Figura 1 para mais especificações sobre a criação de um conselho. </li><li> Amarre um único comprimento de tamanho 4.0 fio de sutura entre os dois parafusos de posicionamento da placa de procedimento. </li><li> Gerar um espirómetro improvisada, removendo e rejeitando o êmbolo a partir de três seringas de 1 ml, e depositar 60 ul de PBS para o topo de cada barril, para formar uma vedação hermética. Fixar o cubo do cateter livremente para uma das seringas e colocá-lo para um lado do tabuleiro. </li><li> Aspirar 300 ul de ar para uma seringa de 1 mL e colocá-lo para um lado do tabuleiro. </li><li> Cortar uma peça adicional de fita de aproximadamente 6 polegadas de comprimento e lugar para um lado. Isso será usado para prender o animal para o conselho na etapa 2.4. </li><li> Configurar uma câmara de isoflurano. Fixe O 2, isoflurano, e de vácuo para as portas apropriadas, tanto a câmara de exposição e o vácuo de apuramento. Em alternativa, administrar um anestésico de isoflurano-compatível biológicagabinete de segurança. </li></ol> 2. intubação <ol><li> Anestesiar o rato com isoflurano na câmara até que ela perde a consciência e respiração retarda a uma taxa adequada. Uma exposição típico inclui 4% de isoflurano e 2% de O 2 durante 3 a 4 minutos, e o resultado ideal é de 2 a 2,5 min da sedação. Isto corresponde a uma taxa de respiração de uma respiração cada 2 segundos. </li><li> Enquanto espera para a sedação para, em conjunto, aspirado entre 30 e 45 l de BLM em uma pipeta e lugar para um lado. </li><li> Quando estiver pronto, suspender o mouse sedado por seus incisivos superiores do fio ligado aos parafusos de posicionamento da plataforma procedimento. Certifique-se de que o dorso do animal fica plana contra a superfície da plataforma. </li><li> Tendo o cuidado de não restringir a ventilação, colocar um pedaço de fita livremente entre a parte inferior (caudal) da porção interior da cavidade torácica, logo acima do diafragma. A colocação deve ser apertado o suficiente para manter o alinhamento adequado durante o procedure, mas não tão apertado que restringe a respiração. </li><li> Ligue o iluminador para entre 80% e 100% de intensidade e orientar o pescoço de ganso de modo que é de 1 a 2 cm da superfície da pele, próximo do plexo solar. Verificar periodicamente a ponta do pescoço de ganso de calor para garantir que ele não ferir o rato. </li><li> De pé por trás da plataforma, use as estéreis, pinças fim brusco para localizar a língua. Ser cuidadoso para evitar os incisivos inferiores, suavemente aderência e desenhar a lingueta para fora da cavidade oral. </li><li> Usando a mão restante, insira o depressor e usá-lo para achatar a língua contra o assoalho da cavidade oral. Solte a pinça, mas deixe o depressor no lugar para as próximas duas etapas. </li><li> Orientar a luz de modo que a traqueia é visível, orientando o pescoço de ganso proximalmente a partir do nível do plexo solar até atingir o nível dos brônquios mainstem. Nota: A traqueia pode ser facilmente distinguidos pela acção da respiração, WHICH faz com que a luz emitida a flutuar em intensidade. Quando correctamente posicionada, esta estrutura será visível no plano axial de um pino localizado centralmente de luz com luz ambiente mínima na própria cavidade oral. </li><li> Ângulo da seringa para que ele segue o caminho natural da traqueia, e abaixe a ponta do cateter 22-G, com a seringa anexo contendo a gota, em linha reta para o lúmen. A bolha PBS começará a subir e descer com cada respiração em cima colocação bem sucedida. Nota: Esta acção pode ser retardado por vários segundos, como resultado da sedação profunda. </li><li> Alimentar o cateter em um adicional de 5 mm. Retire a espátula. </li><li> Deslocar a seringa ao lado oposto, e agarrando o hub, remova cuidadosamente a seringa. </li><li> Depósito entre 30 e 45 ul de BLM no centro do interior do cubo de cateter, anexar a segunda seringa e dispensar 300 ul de ar para dentro do cubo. </li><li> Substitua o segundoSeringa com o primeiro contendo a bolha de PBS. A bolha vai continuar a subir e descer se o procedimento foi realizado com sucesso. </li></ol> Cuidado 3. pós-procedimento <ol><li> Retirar o cateter e fita, e colocar o animal em um lugar quente e seco até que ele recupera a consciência - geralmente dentro de um par de minutos. </li></ol>

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<li>Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-mediated+intratracheal+%28IMIT%29+instillation%3A+a+noninvasive%2C+lung-specific+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system.</a> J Vis Exp. , e52261(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nos casos em que aerossolização é impraticável devido à disponibilidade limitada de reagentes, de segurança, ou de custos, a administração traqueal directa é um método superior para a entrega de agentes exógenos aos pulmões 16 transtraqueal instilação tem sido amplamente utilizada para realizar isto.; No entanto, como acontece com qualquer intervenção cirúrgica, ele também carrega consigo o potencial de complicações causadas pelo procedimento em si, e não necessariamente o agente a ser instilado. 13</sup...

Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, 1 modelos murino continuam a ser de valor inestimável para a modelagem de biologia humana e patogênese da doença. 2 Do ponto de vista pecuária, os ratos são fáceis de manusear, tem um tempo de reprodução baixa, um tempo de vida acelerado, e são relativamente baratos para abrigar. Com o desenvolvimento de diversas estirpes genéticas e estratégias (por ex., Condicionais knock-outs, ratinhos repórter, abordagens de rastreio de linhagem, etc.), bem como a grande variedade de reagentes disponíveis (por exemplo., Anticorpos, proteínas recombinantes, inibidores, etc.), os ratos se tornaram um organismo essencial modelo de vertebrados para descobrir processos de homeostase e de doenças humanas 3. Os ratos têm sido especialmente valiosa para estudar as condições pulmonares, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e fibrose pulmonar. 4 LPA em seres humanos pode ser causado por trauma, lesão, ou septicemia e é caracterizada por células epiteliais evazamento endotelial (isto é., edema), inflamação e fibrose nascente. Em muitos pacientes, ALI progride para sua forma grave, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), que muitas vezes resulta em fibrose e morte por insuficiência respiratória. 5,6 fibrose pulmonar é uma patologia progressiva, fatal caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular , digite mais notavelmente I colágeno, levando a função pulmonar prejudicada. 7,8 a administração de bleomicina (BLM) é o modelo mais amplamente utilizado e melhor caracterizado para induzir ALI e fibrose em animais experimentais. 9 Apesar de fibrose pulmonar BLM-induzida em roedores faz não recapitular plenamente os fenótipos fibróticas humanos, 10 estudos com ratos com este modelo levaram à descoberta de muitos fatores importantes que influenciam o aparecimento e progressão da doença 11. Enquanto o mecanismo exacto (s) por detrás fibrogénese induzida por BLM são desconhecidas, a lesão iniciarPensa-se que surgir a partir de rupturas dos filamentos de DNA dependente de contacto nas células epiteliais que revestem as vias aéreas condutoras e alvéolos e, em particular, tipo 1 pneumócitos. 12 A necessidade de contacto directo entre BLM eo epitélio pulmonar destaca a importância de uma rota de entrega robusta , e estas preocupações são também pertinentes para uma vasta gama de tratamentos direccionado para as vias respiratórias distais, incluindo proteínas recombinantes, anticorpos, siRNA, vírus, bactérias, partículas, e mais. Aspiração orofaríngea (OPA) tem sido amplamente utilizado para este fim 13, mas um grande inconveniente de uma OPA é que alguma porção do agente fornecido pode ser engolida para o tracto gastrointestinal, conduzindo assim a imprecisão na dose administrada. Outra abordagem amplamente utilizada é a instilação transtraqueal, que envolve traqueostomia sob anestesia forte para expor a traqueia e a instilação de um agente directamente no tracto respiratório. 14 No entanto, tal não só podeum procedimento ser indesejável devido ao seu invasividade, mas também consome tempo, exige um pouco de formação, e provoca uma lesão potente ao tracto respiratório têm sido desenvolvidos. 15,16 Vários protocolos que envolvem a administração directa de agentes para o traqueia, sem a necessidade de intervenção cirúrgica, 16,17,18,19,20 tempos de recuperação, mas estes métodos envolvem estendidos causada pelos anestésicos potentes, o uso de equipamento caro (isto é., otoscope / laringoscopio, disponíveis comercialmente placas de procedimento, de fibra óptica fios, etc.), um excesso de manipulação na cavidade oral, e a incerteza sobre a dosagem. Este artigo descreve um método relativamente fácil de administração por entubação que permite que um investigador de forma rápida, barata, e infundir de forma fiável um reagente para o pulmão de murino com o risco reduzido de danos residuais para os tecidos circundantes.

<table><tbody><tr><td>Bleomicina para injeção, 30 unidades/frasco</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>103720</td><td>Para melhores resultados, o BLM deve ser suspenso em PBS, alíquota, e armazenado como alíquotas liofilizadas de uso único</td></tr><tr>Pinça <td></td><td></td><td></td>de<td>ponta romba</td></tr><tr><td>Abaixador de língua (ou seja, eletrodo de lâmina Valleylab dobrado, 2,4")&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>E1551G</td><td>Antes de usar, crie uma curvatura de 45 graus a 1,5 cm da ponta da lâmina. Um depressor adequado também pode ser criado a partir de qualquer implemento de metal de dimensões semelhantes.</td></tr><tr><td>Cateter Exel Safelet 22G X 1"</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Tuberculina Descartável de 1 ml com ponta deslizante (200/sp, 1600/ca)</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml Pipettor e Pontas</td><td></td><td></td><td></td>de Filtro</tr><tr><td>Fiber-Lite Illuminator. Modelo 181-1: Modelo 180 acoplado com iluminador Dual Gooseneck padrão</td><td>Dolan Jenner Industries, Inc.</td><td>181-1</td><td>Iluminadores LED de saída inferior não são recomendados, pois não iluminam suficientemente a traqueia.</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td><td>de intubação</td><td>Veja o diagrama 1.</td></tr><tr><td>Fita de Etiqueta Colorida: 0.5&nbsp; em. Largo</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-15A</td><td></td></tr><tr><td>Oxigênio&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>O produto deve ser estéril</td></tr><tr><td>Carretel de sutura trançada preta de seda não estéril, 91,4 m, tamanho 4-0</td><td>Aparelho Harvard</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia de mesa Isoflurano</td><td>Highland Medical Equipment</td><td></td><td>http://www.highlandmedical.net/</td></tr> <tr><td>Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber</td><td>MIP / Anesthesia Technologies</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>FORANE (isoflurano, USP) Líquido Para Inalação 100 mL&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sistema de Patologia Digital Nanozoomer</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgM ELISA Quantification Kit&nbsp;</td><td>Laboratórios Bethyl</td><td>E90-101</td><td></td></tr></tbody></table>

um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em ratos

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, os modelos de camundongos continuam a ser uma ferramenta essencial para o estudo da doença pulmonar humana. A toxicidade da bleomicina é um modelo comumente usado para estudar lesão pulmonar aguda e fibrose, e vários métodos foram desenvolvidos para administrar bleomicina (e outros agentes tóxicos) nos pulmões. No entanto, muitas dessas abordagens, como a instilação transtraqueal, têm desvantagens inerentes, incluindo a necessidade de anestésicos fortes e cirurgia de sobrevivência. Este artigo relata um método rápido e reprodutível de intubação intratraqueal que envolve anestesia inalatória leve, visualização da traqueia e o uso de um espirômetro substituto para confirmar a exposição. Como prova de conceito, camundongos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade receberam 2,0 U/kg de bleomicina ou um volume equivalente de PBS, e os desfechos de dano e fibróticos foram medidos após a exposição. Este procedimento permite que os pesquisadores tratem uma grande coorte de camundongos em um período relativamente curto, com poucas despesas e cuidados mínimos pós-procedimento.

Ratos entubados foram monitorados diariamente para perda de peso e angústia, e sacrificados 4, 10 ou 17 dias depois através de injecção intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Lavado broncoalveolar (LBA) foi coletado em três lavagens de PBS como descrito em outra parte 21 , e o pulmão direito foi fixado em 10% de formalina, embebidos em parafina, e coradas com tricrómio de Masson pela Universidade de Washington Histologia e imagem de núcleo ...

Este artigo apresenta um método rápido e simples para a administração de bleomicina diretamente na traquéia do mouse através de intubação. As principais vantagens deste método é que ele é altamente reprodutível, fácil de dominar, e não requer equipamento especializado ou tempos de recuperação longos.

Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma administração rápida, fácil e confiável de reagentes nos pulmões de camundongos por meio de intubação. O método também limita o risco de danos residuais aos tecidos circundantes e é de baixo custo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia pulmonar básica e mecanismos de doenças.Como lesão pulmonar aguda e fibrogênese. As principais vantagens dessa técnica são sua alta reprodutibilidade, facilidade de domínio, não exigir equipamentos especializados nem tempos prolongados de recuperação. O procedimento deve ser realizado utilizando ferramentas esterilizadas.Autoclave ambos os pin&ccedil;as de ponta romba e o depressor. Em uma cabine esterilizada, prepare um estoque de trabalho do reagente para administra&ccedil;&atilde;o por meio da entuba&ccedil;&atilde;o. Recomenda-se um volume de b&oacute;lus entre 30 e 45 microlitros.Sonicar a solução durante 10 minutos a 35 quilohertz para garantir uma mistura homogênea. Agora, prepare o local de trabalho. Destine pelo menos um metro quadrado de espaço para o próprio local de trabalho.Além de locais distintos para os animais tanto antes quanto após o procedimento. Agora, prepare uma placa de procedimento. Este modelo personalizado é cortado em uma chapa de alumínio e reforçado por um suporte em T.Placas comerciais semelhantes também estão disponíveis. Usando algumas tiras de fita adesiva, fixe a base da placa de procedimento à bancada, de modo que fique diretamente à frente do experimentador. Em seguida, amarre um pedaço de fio 4.0 entre os dois parafusos de posicionamento da placa de procedimento.Em seguida, monte um espirômetro. Remova os êmbolos de três seringas de um mililitro. Em seguida, carregue até 60 microlitros de PBS na parte superior de cada corpo de seringa.Fixe de forma frouxa uma dessas três seringas ao conector de um cateter. Durante o uso, o ar proveniente da traqueia fará com que o PBS no corpo da seringa suba e desça. Coloque isso ao lado da mesa de procedimentos.Coloque as outras duas seringas adicionais ao alcance para servir como reservas. Em seguida, aspire 300 microlitros de ar em uma quarta seringa e coloque-a ao lado da tábua. Prepare também alguns pedaços de fita com cerca de 15 centímetros de comprimento para fixar o animal na tábua.Em seguida, monte uma câmara de isoflurano, se necessário. Conecte as linhas de oxigênio, isoflurano e vácuo às portas apropriadas da câmara e do sistema de exaustão. Comece anestesiando o camundongo.É importante que fatores como a idade, o peso e a saúde do animal podem modificar a resposta aos anestésicos; portanto, cada laboratório deve otimizar a exposição à isofluorana de acordo com suas próprias necessidades. Enquanto espera, carregue o bolo do reagente em uma ponteira de pipeta e reserve. Quando o camundongo estiver sedado, suspenda-o pelos seus incisivos superiores no fio da plataforma de procedimento, com o dorso do animal apoiado planamente contra a superfície da plataforma.Agora, tomando cuidado para não restringir a ventilação, prenda com fita adesiva de forma frouxa a porção inferior da cavidade torácica, logo acima do diafragma, à plataforma, para manter o alinhamento do animal durante o procedimento. Em seguida, ajuste o iluminador com tubo flexível entre 80 e 100%. Posicione a luz a um ou dois centímetros da superfície da pele próxima ao plexo solar e verifique regularmente se a pele não está superaquecendo. Por trás da plataforma, utilize uma pinça de ponta romba para localizar a língua.Em seguida, tomando cuidado para evitar os incisivos inferiores, segure suavemente a língua e puxe-a para fora da cavidade oral. Enquanto segura a língua, aplainá-la com o depressor na mão não dominante, permitindo que a pinça solte. Agora, guie o gooseneck aproximadamente do plexo solar até os brônquios principais para iluminar a traqueia.A traqueia também pode ser facilmente distinguida pelo movimento da respiração, que fará com que a intensidade da luz flutue ao sair da traqueia. Quando posicionada corretamente, a traqueia pode ser vista como um filete central de luz, com pouca luz ambiente na própria cavidade oral. O cateter não deve entrar na cavidade oral até que a visualização da traqueia esteja ideal.A traqueia não pode ser visualizada por meio da manipulação da fonte de luz ou do depressor. Os pesquisadores devem soltar a língua e tentar novamente o procedimento. Em seguida, incline a seringa para seguir o trajeto natural da traqueia.E abaixe a ponta do cateter de 22 calibres, com a seringa acoplada contendo o PBS, diretamente para dentro da luz. Agora, avance o cateter por mais cinco milímetros e remova o depressor lingual. Se posicionado corretamente, a bolha de PBS no corpo da seringa começará a subir e descer a cada respiração.Seja paciente ao procurar por este indicador, pois tanto a sedação profunda quanto a leve podem modificar a frequência da respiração. Em seguida, transfira a seringa para a mão não dominante. Enquanto segura o conector, remova suavemente a seringa, deixando o cateter no lugar.Com a mão dominante, deposite diretamente no centro do conector do cateter o bolo preparado do reagente. Em seguida, acople a segunda seringa com 300 microlitros de ar e injete o ar no conector. Isso ajudará a garantir que o bolo seja bem distribuído nos pulmões.Agora, remova a seringa e substitua-a por uma seringa contendo a bolha de PBS. A bolha continuará a subir e descer se o procedimento tiver sido realizado com sucesso. Agora, remova o cateter e a fita.E coloque o animal em um local seco e aquecido até que recupere a consciência. Normalmente dentro de alguns minutos. Os camundongos intubados foram monitorados diariamente quanto à perda de peso.Os camundongos foram coletados aos quatro, 10 e 17 dias após a intubação intratraqueal com bleomicina. A lavagem broncoalveolar foi coletada desses pulmões e analisada. Níveis elevados de IgM demonstraram um aumento significativo dependente do tempo na permeabilidade pulmonar, indicativo de disfunção da barreira epitelial e/ou endotelial.Os pulmões direitos foram fixados e corados com tricrômio de Masson. A resposta fibrogênica, um marcador bem estabelecido do conteúdo total de colágeno, foi quantificada. As seções de histologia evidenciaram espessamento dependente do tratamento no interstício pulmonar e aumentos nas lesões fibrosas.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de um minuto, se adequadamente executada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a manipulação dos tecidos moles ao redor da traqueia não é necessária nem recomendada. Além disso, pode comprometer tanto a saúde do animal quanto a integridade do experimento.

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