Name: Isolamento de CD146 + Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a isolar células estromais mesenquimais CD146+ de pulmões de ratos usando digestão enzimática, separação por gradiente de densidade e seleção por adesão plástica. Este método rápido e reprodutível auxilia pesquisas em biologia celular e medicina pulmonar.

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O JJPC é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). O MAM recebe uma bolsa de mérito da Fundação Acadêmica Nacional Alemã - Studienstiftung des Deutschen Volkes e é apoiado por uma bolsa da EFCNI (Fundação Europeia para o Cuidado do Recém-Nascido). A BT é apoiada pelo CIHR, pela Canadian Lung Association, pela Stem Cell Network e pelo Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa (animal ética protocolo Ohri-1696). cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. 1. Isolamento de células estromais mesenquimais do pulmão <ol><li> Preparar a mistura de enzima em um tubo de 50 ml: pesar 30 U protease neutra, 2.500 U de colagenase I e 500 U DNAse I. Estas quantidades suficientes para os pulmões de um rato adulto ou filhote de rato. Preparam-se no dia de isolamento e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Sacrifício filhotes de ratazana no dia 13 através de uma injecção intra-peritoneal de pentobarbital de sódio (0,2 mL, 65 mg / ml). Use o aperto reflexo toe para estabelecer inconsciência. A morte do animal é assegurada através da abertura da caixa, tal como delineado abaixo. </li><li> Higienizar a pele pulverizando o animal com etanol a 70% e cuidadosamente abrir a caixa torácica usando tesouras cirúrgicas, a partir de o diafragma e o corte no sentido do lado rostral, sendo muito cuidado para nãopara danificar os pulmões. Espalhe a caixa torácica aberta usando grampos hemostáticos, ou alternativamente cortar a caixa torácica para fornecer acesso ao tórax. </li><li> Desangrar o animal através da remoção do coração. Para remover o coração, segure o timo e coração com pequenas pinças e cortar estes afastado com uma tesoura cirúrgica. Imediatamente a seguir, absorver o sangue com uma gaze até não haver mais sangue sai da aorta e a artéria pulmonar cortada. </li><li> Remover os pulmões do tórax da seguinte forma: mantenha a traqueia com pequenas pinças, em seguida, atingir a traquéia com uma tesoura cirúrgica no lado rostral. Enquanto puxa o pacote de pulmão para fora do tórax, cortar qualquer tecido conjuntivo no lado dorsal ao longo da caixa torácica para libertar os pulmões. </li><li> Cortar os pulmões a partir da aorta e do esófago por corte ao longo do diafragma com tesouras cirúrgicas. Agora que os pulmões estão completamente livres do tórax remover qualquer sangue restante cuidadosamente com uma gaze. </li><li> Remova a traqueia e os brônquios com surgicos tesoura e transferir cuidadosamente os lobos pulmonares para um tubo de 50 ml contendo citrato-fosfato-dextrose e adenina (CPDA-1) anticoagulante frio de 35 ml de 30% (26,30 g de citrato trissódico di-hidratado, 3,27 g de mono-hidrato de ácido ascórbico, 2,22 g de fosfato monossódico di-hidrogenofosfato, 31,80 g de D-glucose, 0,275 g de adenina em 1 L de H2O purificada; a filtração estéril da solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização) em tampão fosfato salino (PBS) para remover o sangue e detritos. </li><li> Depois de uma lavagem de 5 min em 30% CPDA-1 / PBS, transferir o pulmão para um novo tubo de 50 ml contendo 35 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) (RT), inverter suavemente para remover o citrato. Transferir para um tubo contendo 35 ml de PBS + Sódio-piruvato de Dulbecco + Glicose (DPBS ++) (RT). Cada passo de lavagem deve demorar cerca de 5 min. Nota: DPBS ++ pode ser encomendado no mercado ou a seguinte composição 21: cloreto de cálcio hidratado 132,4 mg, cloreto de magnésio hexa-hidratado 100 mg, cloreto de potássio (anidro) 200 mg, monobásico de fosfato de potássio (anidro) 200 mg de cloreto de sódio (anidro) 8,000 mg, fosfato de sódio dibásico (anidro) 1,144.5 mg, D-glicose 1,000 mg, piruvato de sódio 36 mg em 1 L de H 2 O purificada, pH 7,3. Filtrar em condições estéreis a solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização. </li><li> Dissolve-se a mistura de enzima por adição de 10 ml de DPBS ++ (pré-aquecido a 37 ° C) e invertendo suavemente até se dissolver. </li><li> Transferir os pulmões para um novo tubo de 50 ml e cortar o pulmão na parede do tubo, usando um bisturi, até finamente picados. Adicionar a mistura de enzima ao tecido (10 ml de mistura de enzima / por ratinho adulto / cria de rato do pulmão), fechar o tubo firmemente e incubar a 38 ° C com agitação suave (ou em um misturador térmico, um banho de água em agitação, ou uma água banho com agitação manual regular). A duração depende do tipo de tecido: feto tecido 60 min, juvenil / adulto tecido 90-120 min, adulto tecido fibrótico 120-150 min. </li><li> Parar a digestão por quelação os cátions bivalentes wom 200 ul de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. a filtração estéril da solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização). </li><li> Adicionar 20 ml de soro de bovino fetal a 5% (FBS) / PBS e passar toda a suspensão através de peneira de 100 uM de células para um novo tubo de 50 ml. Lavar o filtro e tubo de células com 10 ml de 5% de FBS / PBS, levando o volume total a 40 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g, temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante (pellet deve ser claramente visível), ressuspender em 40 ml de 5% FBS / PBS e repita o passo centrifugação 1,13. </li><li> Ressuspender em 4 ml de 5% de FBS / PBS (RT) e a camada cuidadosamente sobre 3 ml de meio de gradiente de densidade (1,073 g / cm3) em um tubo de 15 ml de 14. Para obter uma boa interfase, é crucial que as camadas da suspensão única célula ocorre em um ângulo de °&gt; 45 a uma velocidade muito baixa. </li><li> Centrifugar 20 min a 900 xg, meio (5/10) de aceleração, desaceleração sem, 19 ° C. </li><li> Recolher as células presentes na emterphase e ressuspender-los em 10 ml de PBS estéril. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml pré-aquecido meio completado cultura G-MSC (meio mínimo essencial de Eagle, modificação alfa (aMEM), suplementada com 2 mmol de L-glutamina por 500 ml de aMEM, 20% vol / vol de FBS e 1% em vol / vol de penicilina / estreptomicina / anfotericina B. </li><li> Repita etapa de centrifugação 1,18. Subsequentemente, remover o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meio de cultura fresco pré-aquecido. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado e placa a uma densidade elevada, uma vez que a maioria das células, nesta fase, não são aderentes plástico. A densidade de revestimento exacto depende da espécie e idade dos animais, por exemplo, as células de um pulmão de ratinho adulto são semeadas a 10 5 células / cm2, enquanto que as células de um pulmão cria de rato é suficientemente densa para uma densidade de sementeira de 1-2 x 10 4 células / cm2 </sup&gt;. Use 0,2 ml de L-MSC meio de cultura / cm 2. </li><li> Culturas de L-MSC numa atmosfera humidificada de 5% de O 2, 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> Mudança de meio 24 horas após a inoculação inicial, e, posteriormente, a cada 3 dias após a lavagem uma vez com PBS. As células devem ser cultivadas até 80-90% de confluência, o que leva 3-5 dias, em média, dependendo do animal de origem. confluência superior irá promover a diferenciação em fibroblastos. </li></ol> 2. Seleção de Células CD146 + Lung estromais mesenquimais <ol><li> O revestimento de esferas magnéticas com anticorpo secundário <ol><li> O revestimento dos grânulos magnéticos com anticorpo secundário biotinilado, à razão de 10 ug de anticorpo secundário / contas magnéticas em 100 ul de fundo redondo estéreis criotubo de 2 ml em condições estéreis. Use anticorpo secundário 10 ul por esperados células 0,5 x 10 6, e utilizar um mínimo de 100 ul de contas magnéticas e anticorpo ug 10. Nota: O rácio de umtibodies usados ​​por volume de contas podem ser diferentes entre os fabricantes, por favor consulte as instruções do fabricante para as contas de escolha. Para este protocolo, consulte a tabela 1 para as contas e anticorpos que foram utilizados na otimização deste protocolo. </li><li> Incubar numa misturadora rotativa amostra durante 30 minutos a 30 rotações / min (rpm), a temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as contas em 1,5 ml estéril 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS e transferir para um tubo redondo de 3 ml de fundo (tubo de citometria de fluxo). Lavar o frasco de congelação com um adicional de 1,5 mL de 0,1% BSA / PBS e transferir para o tubo 3 ml. </li><li> Colocar o tubo em um íman apropriado e esperar 2 min, até que todos os grânulos estão ligados à parede posterior do tubo e a solução permanece límpida. Retirar do escoamento em repetir a lavagem com 3 mL de 0,1% BSA / PBS duas vezes. </li><li> Ressuspender as esferas em 3 mL de 0,1% BSA / PBS e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Utilizar no prazo de 5 dias. </li></ol></li><li> Etiquetas de CD146 + L-MSCs<ol><li> Colher as células mesenquimais após a lavagem com PBS utilizando uma solução não-tripsina suave. Nota: os volumes dependem do tamanho do frasco de cultura (0,2 ml / cm 2 ou meio PBS). <ol><li> Remover o meio de cultura e lavar as células três vezes com PBS estéril. </li><li> Adicionar o volume apropriado de solução não-tripsina suave (ver Tabela 1). Incubar a 37 ° C na incubadora até as células terem individual, com cerca de 10 min quando se utiliza a solução na Tabela 1. </li><li> Inactivar a enzima através da adição de meio de cultura L-MSC, e centrifuga-se durante 5 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Remover o sobrenadante, as células ressuspender em 0,1% BSA / PBS e contagem das células com um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Nota: O volume de 0,1% de BSA / PBS depende do tamanho do frasco de cultura: alvo de 5 ou 10 mL de 0,1% BSA / PBS. </li><li> Repita o passo 2.2.2 e ressuspender o montante dedicado de células em 3 ml de 0,1% BSA / PBS (blocos unlocais de ligação específicos e mantém as células vivas). Manter as células no gelo. </li><li> Preparar um tubo redondo 3 ml de fundo com o anticorpo anti-CD146 primário, e manter em gelo. Nota: A concentração de anticorpo primário que é adicionado com a quantidade específica de células depende do anticorpo que é usado. Para um anticorpo anti-CD146 de rato sugeriram ver Tabela 1. </li><li> Adicionar o volume total de células a partir do passo 2.2.3 do tubo com o anticorpo primário. Fechar firmemente e incubar 30 min num misturador de amostras de rotação a 15 rpm, 4 ° C. </li><li> Centrifugar as células durante 5 min a 500 xg, 4 ° C, remover sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 3 mL de 0,1% BSA / PBS. etapa de centrifugação de repetição. </li><li> Ressuspender as células em solução de 3 ml contendo esferas revestidas de anticorpo secundário que foi preparado de acordo com as instruções na Secção 2.1 e incubar 30 min num misturador de amostras de rotação a 15 rpm, 4 ° C. </li></ol></li><li> Seleccionar CD146 + L-MSC<ol><li> Coloque o tubo que contém o marcado CD146 + L-MSCs no ímã. As células positivas vai ser desenhada para a parte de trás do tubo. Sem mover o tubo ou tocar as contas, recolher o sobrenadante com as células negativas lentamente com uma pipeta de Pasteur estéril (estes podem ser recolhidas ou descartadas com base no design experimental). </li><li> Remover o tubo do íman e ressuspender as células em 3 ml de 10% de BSA / PBS. Repita o procedimento de selecção descrito no passo 2.3.1. mais quatro vezes (passos Σ 5 seleção). </li><li> Ressuspender o CD146 + L-MSCs em meio de cultura L-MSC pré-aquecida e retornar para o íman. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender em meio de cultura L-MSC e placa num frasco de cultura de tamanho apropriado (0,2 ml / cm 2). Como uma regra de ouro, células da placa no mesmo frasco de cultura de tamanho a partir do qual as células foram retiradas antes do grânulo-selecção. O número de CD146 + L-MSC, e, portanto, a densidade de revestimento, serádepender da idade, espécie e da estirpe do animal de origem. Sempre apontar para uma densidade de revestimento de ~ 5000 células / cm2. Nota: As contas não vai perturbar o crescimento celular e irá gradualmente desaparecer à medida que as células proliferam. </li></ol></li></ol> 3. Células de congelação <ol><li> Utilizar os seguintes tipos de congelação: solução pentastarch 60% (10% pentastarch em 0,9% de NaCl), FBS a 20%, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) 22. Nota: Se nem todos os ingredientes estão disponíveis, uma solução contendo 5% de DMSO, 30% de FBS e 65% aMEM é uma boa alternativa. </li><li> Ressuspender as células em 0,5 X 10 6 células / ml, da alíquota para criotubos de 1 ml de cada vez e congelar O / N à temperatura de -80 ° C utilizando um recipiente de congelação. </li><li> Transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido no dia seguinte. </li></ol> 4. Células descongelamento <ol><li> Descongelar uma ampola de células num banho de água a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em 10 mlmeio de cultura pré-aquecido e centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura de 10 mL. Semear as células em uma cultura de células tampa ventilada frascos tratados a 5000 células / cm2 em 0,2 ml de meio / cm2 (por exemplo, 15 mL para um frasco de 75 2 cm). </li><li> Células de cultura em 5% de O2, 5% de CO2, até 80-90% confluentes para a colheita e / ou o uso experimental. O excesso de confluência irá induzir a diferenciação. Quando semeando a 5000 células / cm 2, G-MSC irá chegar a 80-90% de confluência dentro de 3-4 dias de cultura. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O isolamento e cultura de principal L-MSCs apresenta uma oportunidade para entender melhor a sua função ea sua interacção com outras populações de células em um nível celular, e seu papel no desenvolvimento do pulmão, a saúde ea doença. Isto é especialmente importante porque a falta de um marcador único específica destas células faz com que seja quase impossível para estudar estas células in situ. Tal como acontece com todas as populações de células primárias, deve-se ter em mente que estas células são mais pro...

células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Durante o desenvolvimento, incluindo o pulmão, o mesênquima é uma importante fonte de sinais de desenvolvimento, e as MSCs residentes é um candidato provável para estar no centro desta. Além disso, estão surgindo evidências de que MSCs residentes são perturbados em doenças de adultos, incluindo o cancro 1,2 e fibrose 3. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células 4. Células-tronco antigénio-1 (Sca-1) foi identificada em ratos como um marcador para uma variedade de células estaminais do tecido, e pode ser utilizado para o isolamento de MSCs de L-5, mas tem infelizmentenão conhecido orthologs em outras espécies 6. Os investigadores relataram uma variedade de diferentes métodos de isolamento para o isolamento de L-MSCs a partir de qualquer tecido ou fluido pulmonar. Estes variam de células activadas por fluorescência (FACS) modos baseados selecionando para CD31 - / CD45 - / CD90 + células 7, CD31 - / CD45 - / molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) - / Sca-1 + células 8, a resistência a múltiplos fármacos transportador ATP cassete de ligação G (ABCG2) células positivas 9 ou Hoechst 33342 dye efluxo 10, a aderência ao plástico 11,12 e migração para fora do tecido picada 13. As vantagens do método aqui apresentado são várias vezes. Usando uma digestão enzimática suave e em gradiente de densidade 14, obtém-se todas as células da gama de densidades que incluem MSC, mas excluem células epiteliais ou endoteliais. O passo subsequente aderência ao plástico assegura que apenas o mesenchcélulas ymal aderir e ficar em cultura, eliminando leucócitos. Mais importante, no entanto, o passo de selecção CD146 + permite a eliminação de fibroblastos, uma vez que estas células não expressam CD146. Expressão da molécula de adesão celular CD146 é positivamente correlacionada com multipotency, e por isso é um bom marcador para eliminar os fibroblastos a partir de uma população de células mesenquimais 15-19. Esta é uma vantagem sobre o uso de CD90 como um marcador de selecção, uma vez que não só é expressa no MSC, mas também em lipofibroblasts 5,20. Neste protocolo, escolheu explicitamente uma selecção esfera magnética, uma vez que é mais suave sobre as células, e todo o processo pode ser realizado em condições estéreis. Outra vantagem importante do método de isolamento, em oposição ao método de crescimento, é de que é relativamente rápido, 6-10 dias, em oposição a um mês ou mais para o método de desdobramento. Três a cinco dias após o isolamento inicial da população mesenquimal está pronto para CD146 + sele<html> cção; depois de mais de três a cinco dias, as células CD146 + está pronto para ser usado nas experiências, ou pode ser congelado para posterior utilização. O tempo de diminuição de cultura, melhora a qualidade das células como as MSCs transdiferenciar em direcção fibroblastos em cultura ex vivo prolongada 19. Por último, devido à natureza do protocolo, é possível aplicar este método para outras espécies simplesmente escolhendo anticorpos adequados, ou mesmo com outros sistemas de órgãos, ajustando a escolha de enzimas de digestão e tempo de incubação. Um protocolo detalhado deste método de isolamento é dada a seguir, e uma vista geral esquemática do isolamento e subsequente selecção da sub-população CD146 + é fornecida na Figura 1A e 1B, respectivamente. Além disso, os detalhes são incluídos para Passaging, congelamento e descongelamento estas células. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Visão esquemática do isolamento de células pulmonares mesenquimais (A) e CD146 + subsequente selecção de células (B) min = minuto.; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; 2 nd Ab = anticorpo secundário; a-CD146 Ab = anticorpo anti-CD146 primário; células negativas -ve = células CD146; + ve células positivas células = CD146. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Protease Neutra</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 > C até o uso</td></tr><tr><td>Colagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 & C até o uso</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 &deg; C até o uso</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico (Euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin,</td> <td>Irlanda-Use</td> <td>0,2 ml para filhotes de ratos entre 20-30 g; animais maiores podem precisar de mais.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS + piruvato de sódio + glicose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Muito importante usar este tipo de D-PBS, pois o cálcio e o magnésio presentes neste D-PBS facilitam a digestão enzimática</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Mídia de gradiente de densidade. Para obter uma boa interfase, é crucial que a estratificação da suspensão unicelular ocorra a uma >45> ângulo em velocidade muito baixa, e que a centrifugação subsequente seja feita a 19 °C.</td></tr><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiótico-Antimicótico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicilina/Estreptomicina/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Grânulos magnéticos</td></tr><tr><td>biotinilados policlonais coelho-anti-rato IgG Dako</td><td>, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Anticorpo secundário biotinilado que corresponde ao anticorpo anti-rato CD146 descrito abaixo</td></tr><tr><td>Ímã DynaMag5</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Ímã recomendado para uso com Dynabeads. NOTA: o ímã deve ser escolhido com base no fabricante' s instruções das contas magnéticas de sua escolha.</td></tr><tr><td>TrypLE express&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Alternativa suave sem tripsina, use 1 ml de TrypLE express/25 cm2 de área de superfície. Após o descolamento, 10 ml de meio de cultura L-MSC são suficientes para inativar 3 ml</td></tr><tr><td>de anticorpo TrypLE anti-rat CD146</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12.5 &mu; l por 0,5 x 106</td></tr><tr><td>células Pentaspan (solução de pentaamido)</td><td>Bristol-Myers Squibb</td> <td>Canadá-Pode</td> <td>ser obtido através de serviços locais de doação de sangue ou departamentos de hematologia. Alternativamente, pode-se usar a solução de pentaamido PSI 20% (Preservation Solutions, PST001) diluída 1:1 com NaCl a 0,9%.</td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento Mr. Frosty</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Melhora a viabilidade ao congelar L-MSCs durante a noite a -80 &deg; O</td></tr></tbody></table>

isolamento de cd146<sup&gt; +</sup&gt; células residente lung estromais mesenquimais de rato pulmões

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Além disso, é provável que têm um papel no desenvolvimento normal do órgão, e foram papéis na doença, particularmente aqueles com uma natureza fibrótica atribuída. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células. A técnica de isolamento descritas aqui se aplica múltiplas características de MSCs residentes de pulmão (L-MSCs). No momento do sacrifício dos ratos, os pulmões são removidos e enxaguados várias vezes para remover o sangue. Após dissociação mecânica por bisturi, os pulmões são digeridos durante 2-3 hr usando uma mistura de colagenase de tipo I, tipo protease neutra e ADNase I. A obtainesuspensão de células única d é subsequentemente lavado e colocado em camadas sobre média densidade gradiente (densidade 1,073 g / ml). Após centrifugação, as células da interfase foram lavadas e plaqueadas em frascos tratados de cultura. As células são cultivadas durante 4-7 dias em fisiológico 5% de O2, 5% Condições de CO 2. Para esgotar fibroblastos (CD146 -) e para assegurar uma população de apenas, a selecção positiva de L-MSCs (CD146 +) para células CD146 + é realizado por meio de selecção esférulas magnéticas. Em resumo, este processo produz uma população de forma fiável primária G-MSC para posterior estudo e manipulação in vitro. Devido à natureza do protocolo, que pode facilmente ser convertidos a outros modelos animais experimentais.

Duas das características físicas mais fiáveis ​​de MSC, densidade e aderência ao plástico, são usadas na primeira parte deste protocolo para obter a fracção de células mesenquimais do pulmão que contém L-MSCs. Embora a interfase em gradiente de densidade incluem monócitos e macrófagos, além de células mesenquimais do pulmão, a aderência ao plástico seguido de 3-5 dias de cultura garante que apenas as células mesenquimais do pulmão permanecem. Na verdade, esta população de células express...

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar in vitro células estromais mesenquimais residentes positivas para CD146, ou CEMs, isoladas do pulmão de rato, utilizando uma combinação de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, aderência ao plástico e separação por microesferas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de doenças pulmonares sobre como as CEMs pulmonares são afetadas na doença e como contribuem para a modulação imune e a reparação tecidual. As principais vantagens desta técnica são sua rapidez, reprodutibilidade e fácil aplicabilidade a diferentes espécies de animais experimentais ou tecidos.Os primeiros passos do procedimento serão demonstrados por Arul Vadivel, um pesquisador associado do meu laboratório. Para remover o pulmão da cavidade torácica, segure a traqueia com pin&ccedil;as pequenas e use tesoura cir&uacute;rgica para separar a traqueia no lado rostral. Em seguida, enquanto puxa suavemente o conjunto pulmonar para fora da cavidade tor&aacute;cica, corte os tecidos conjuntivos presentes no lado dorsal ao longo da caixa tor&aacute;cica.Corte ao longo do diafragma para separar os pulmões da aorta e do esôfago, e use gaze para remover suavemente qualquer sangue remanescente do tecido pulmonar. Com tesoura, remova a traqueia e os brônquios e coloque cuidadosamente os lobos pulmonares em um tubo de 50 mililitros contendo 35 mililitros de anticoagulante CPDA frio e PBS para remover o sangue e os detritos. Após cinco minutos, transfira os pulmões para um novo tubo de 50 mililitros contendo 35 mililitros de PBS estéril à temperatura ambiente.E inverta suavemente para remover o citrato. Após cinco minutos, lave os pulmões em um novo tubo de 50 mililitros contendo 35 mililitros de PBS de Dulbecco estéril à temperatura ambiente, suplementado com piruvato de sódio e glicose, e inverta suavemente. Em seguida, transfira os pulmões para outro tubo de 50 mililitros e use um bisturi para picar finamente o tecido contra a parede do tubo.É muito importante cortar o tecido em pedaços muito pequenos para garantir um rendimento máximo de células. E trabalhar rapidamente para assegurar uma viabilidade celular robusta. Quando todo o tecido tiver sido picado, adicione a enzima recém-preparada ao tubo e feche bem a tampa.Em seguida, incubar os fragmentos de tecido a 38 graus Celsius com agitação suave pelo período de digestão apropriado. Ao final da incubação, interromper a digestão com 200 microlitros de EDTA estéril filtrado. Adicionar 20 mililitros de PBS suplementado com soro bovino fetal ao homogeneizado de tecido e passar toda a suspensão por uma peneira celular de 100 mícrons para um novo tubo de 50 mililitros.Em seguida, lave o tubo de digestão e a peneira celular com 10 mililitros de FBS/PBS e aspire a lavagem com uma amostra filtrada. Após centrifugar as células duas vezes, reconstitua o segundo pellet em quatro mililitros de FBS/PBS à temperatura ambiente. E, lentamente, sobreponha as células em três mililitros de meio de gradiente de densidade em um ângulo maior que 45 graus.Pressionando em um ângulo maior que 45 graus entre a suspensão celular e o meio de gradiente de densidade, evita-se que forças de cisalhamento misturem as células com o meio de gradiente, permitindo a formação das camadas; caso ocorra mistura, não haverá gradiente de densidade. Separe as células por centrifugação e colete a interfase. Em seguida, lave as MSCs pulmonares em 10 mililitros de PBS estéril e ressuspenda o pellet em meio de cultura completo para MSCs pulmonares pré-aquecido para semeadura.Para isolar a população de células positivas para CD146, primeiro recubra as microesferas magnéticas com 10 microgramas de anticorpo secundário biotinilado por 100 microlitros de microesferas magnéticas, em um vial criogênico estéril de fundo redondo de dois mililitros sob condições estéreis. Incube as microesferas e o anticorpo em um agitador rotativo por 30 minutos à temperatura ambiente e 30 RPM. Em seguida, ressuspenda as microesferas conjugadas ao anticorpo em 1,5 mililitro de PBS suplementado com BSA e transfira as microesferas para um tubo de citometria de fluxo de fundo redondo de três mililitros.Lave o frasco criogênico com mais 1,5 mililitro de BSA/PBS e aspire a lavagem junto com as esferas. Coloque o tubo em um ímã apropriado por dois minutos, até que todas as esferas aderem à parede traseira do tubo e a solução fique clara. Em seguida, remova o sobrenadante e lave as esferas mais duas vezes com três mililitros de BSA/PBS.Lave as CMM três vezes com PBS sem suplementação. Após a última lavagem, trate as células com uma solução suave sem tripsina por 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando todas as células tiverem se destacado, adicione meio de cultura fresco para CMM pulmonares e centrifugue as células.Resuspenda o pellet em PBS com BSA e conte as células. Em seguida, transfira as células para um tubo de três mililitros contendo anticorpo primário CD146, tampe o tubo e incube as células em um agitador rotativo a 15 RPM e quatro graus Celsius. Ao final da incubação, lave as células duas vezes em três mililitros de PBS com BSA, ressuspendendo o segundo pellet em três mililitros de microesferas conjugadas com anticorpo secundário.Após 30 minutos no misturador rotativo a quatro graus Celsius, coloque o tubo no ímã e use uma pipeta de Pasteur estéril para remover lentamente e com cuidado as células negativas. Em seguida, com o tubo retirado do ímã, ressuspenda as células em três mililitros de PBS suplementado com BSA e repita o processo de seleção mais quatro vezes. Após a última remoção de células negativas, lave os MSCs pulmonares positivos para CD146 em meio de cultura pré-aquecido.Por fim, ressuspenda as células conjugadas com microesferas em meio fresco de cultura de células estromais mesenquimais pulmonares e plaque 5.000 células por centímetro quadrado em um frasco de cultura de tamanho apropriado. A aderência ao plástico seguida por três a cinco dias de cultura enriquece a população da fração interfacial da separação por gradiente de densidade para células MSC pulmonares positivas para CD90, CD73 e CD146.Além disso, essas células são capazes de uma eficiência de unidade formadora de colônia de cerca de 30%, muito maior do que a geralmente relatada para medula óssea ou outros subconjuntos de CMM que se diferenciam ao longo das três linhagens clássicas de CMM. A seleção positiva da subpopulação positiva para CD146 aparentemente resulta em uma população celular altamente enriquecida em CMM pulmonares, como demonstrado por um percentual mais elevado de células que expressam marcadores superficiais associados a CMM. Essas células também demonstram um potencial formador de colônias consideravelmente maior e uma resposta mais forte à diferenciação, particularmente nas células da linhagem condrogênica, em comparação com a população total de células mesenquimais obtida antes da seleção para CD146.É importante destacar que essas MSCs pulmonares formam pouquíssimos adipócitos verdadeiros, exibindo um número muito maior de células com formato fusiforme preenchidas com pequenas vesículas lipídicas, o que pode refletir a linhagem de lipofibroblastos, crucial tanto para o desenvolvimento pulmonar quanto para o suporte das células alveolares tipo II. Uma vez dominada, esta técnica pode gerar MSCs pulmonares positivas para CD146 em seis a dez dias, embora o rendimento dependa da idade e da espécie do animal. Ao realizar este procedimento, é fundamental trabalhar rapidamente para preservar a viabilidade celular.Após este procedimento, outros métodos, como a reação mista de linfócitos ou ensaios de cicatrização de feridas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a eficiência das CMMs na inibição da proliferação de linfócitos T e no suporte à cicatrização de feridas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar CMMs pulmonares positivas para CD146 utilizando digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, aderência ao plástico e separação por microesferas.

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Biology

Biologia

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

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Neste artigo, células endoteliais primárias do pulmão foram isoladas e cultivadas de camundongos neonatais.

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Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

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O protocolo descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar células contendo retinóides de populações de células pulmonares altamente heterogêneas, fazendo uso de autofluorescência retinóide específica e empregando classificação de células ativadas por fluorescência.

Isolamento de células contendo retinóides pulmonares por classificação de células

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

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Aprenda a isolar células estromais mesenquimais CD146+ de pulmões de ratos usando digestão enzimática, separação por gradiente de densidade e seleção por adesão plástica. Este método rápido e reprodutível auxilia pesquisas em biologia celular e medicina pulmonar.

Isolamento de CD146

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