Name: Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a projetar e empacotar vírus CRISPR/Cas9 de alto título para edição genômica direcionada no cérebro de camundongos adultos usando injeção estereotáxica. Este método permite estudar funções gênicas em distúrbios neurológicos sem criar animais geneticamente modificados.

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Este trabalho foi apoiado pela Ninh conceder R01MH097949 ea Autism Speaks Pilot Grant 7359 para BWL eo Norris Cotton Cancer Center óptico de imagem Instrumentação Shared Grant P30CA023108.

<ol><li>Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077(2011).</li>
<li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method">http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method</a> (2015).</li>
<li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30(2014).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Existem alguns passos críticos que são importantes para o empacotamento viral bem sucedida. saúde celular é fundamental antes e durante a transfecção, as células saudáveis ​​irá reduzir muito a quantidade de vírus produzida. Se a transfecção e embalagens são bem sucedidos, em seguida, 100% das células devem expressar o fluoróforo e as células devem formar um sincício funcional. No passo 3.2.4, tocando o tubo é necessário para a transfecção de título elevado de forma eficiente, e o pH da solução salina tamponada com HEPES deve ser exacta. Os maxi-preps que produzem os plasmídeos necessários para embalagem viral deve ser extremamente puro. Até este ponto, é útil para o etanol precipitar a eluição DNA final e re-suspensão em tampão Tris-EDTA. É também muito importante para reduzir a quantidade de soro de 2% ou menos, em que os meios de comunicação a cafeína é adicionado a no Dia 6 (passo 3.4) antes da recolha viral. Se o soro não é reduzida, em seguida o vírus purificado final irá conter uma quantidade indesejável de prot soroein. O uso de polietileno glicol 6000, quando precipitar as partículas virais exclui a necessidade de ultracentrifugação. É também importante notar que as CRISPR contendo vírus Cas9 tipicamente têm um título de cerca de 10 vezes menos do que os vírus que contêm exclusivamente um fluoróforo. Para a cirurgia estereotáxica, o uso de anestesia inalatória permite um controle rápido e preciso ou a consciência do animal em comparação com anestésicos injetáveis ​​e permite que a anestesia sobre uma faixa etária maior. É muito importante para manter os instrumentos cirúrgicos limpos e esterilizados, e segmentação reproduzível requer um posicionamento preciso da cabeça. Certifique-se de que não há lançamento ou de rolamento da cabeça no instrumento estereotáxico e que o crânio sente firmemente no lugar. Pode ser útil para permitir o crânio para secar, a fim de encontrar as suturas para determinar as coordenadas estereotáxicas. Além disso, a taxa e o volume de cada estereotáxico coordenar deve ser determinada empiricamente. Esta técnica é limitativo na medida em que a propagação de um retrovírus ou lenti- é restrito, especialmente quando comparado com os vírus adeno-associados (AAV) .Portanto, estes vírus são valiosos quando infectam uma região do cérebro discreta, mas não para a infecção geral associado com AAV utilizado para análise comportamental em animais. O uso de cafeína no presente protocolo aumenta consideravelmente o título destes vírus, mas ainda não são tão elevados como os titulos conseguidos no empacotamento de AAV. Além disso, a integração estável apenas uma vantagem da expressão fluoróforo, como CRISPR / Cas9 forma edições genómicas estáveis ​​mesmo quando transitoriamente transfectadas e é possível que em curso expressão do Cas9 sgRNA e podem, eventualmente, produzir efeitos fora do alvo. A expressão transiente do sistema / Cas9 CRISPR com AAV é suficiente para produzir alterações genómicas que se propagam ao longo de divisões celulares, no entanto, não irá ser mantida expressão fluoróforo. Criação de lenti- e retrovírus utilizando o sistema CRISPR / Cas9 irá conferir a capacidade de ter como alvo qualquer novo gene em uma ampla variedade de organismos. A eficiência de edição gene parece ser dependente da sequência do ARN alvo a guia de clivagem Cas9. Foi determinado empiricamente que entre 10% e 80% dos clones contêm indels após sequenciação infectadas células Neuro2A. É atualmente desconhecido se freqüências InDel calculados em células Neuro2A refletem aqueles em neurônios. Guia de software de criação de ARN, tal como Benchling agora incluem uma avaliação &quot;on-alvo&quot; que pode ser capaz de prever a eficácia de uma determinada sequência alvo. Até que ponto tais resultados &quot;no alvo&quot; são necessidades confiáveis ​​para ser empiricamente determinados em neurônios e outros tipos celulares como o sistema CRISPR-Cas9 se torne mais amplamente implementadas. produção animal transgénico baseado em lentivírus tem sido variavelmente bem sucedido com relatos de que os transgenes entregou-lentivírus se tornar silenced 11. CRISPR de genes mediada edição de ADN pode ser passada através da linha germinativa para gerar modelos animais completos. Assim, a edição genômica estável pode ser viável, apesar do silenciamento de fluoróforos virais entregue e transgenes Cas9. Isto pode fornecer uma plataforma eficiente para alterações genômicas alvejados. A entrega viral do sistema / Cas9 CRISPR, embora não exija organismos transgénicos, é complementar a estas técnicas. Por exemplo, a injecção de tais partículas virais em um animal transgénico que expressa composto indutivelmente Cre e Cre opto dependente ou quimio-transgenes genética deve facilitar estudos de complexos sobre a relação entre as manipulações genéticas e actividade neuronal. Um segundo exemplo é o de proporcionar estas partículas virais Cas9 / sgRNA em um nocaute condicional numa tentativa para pesquisar as interacções do gene para o gene. Finalmente, uma outra rota emocionante da pesquisa é a triagem de fenótipos e compostos terapêuticos em células do paciente derivada, que podeser utilizados para validar e descobrir redes genéticas que são rompidas em várias doenças.

Para estudar a base da fisiologia normal e patologia da doença, há uma necessidade de manipular com precisão a expressão de genes em organismos modelo. Para os organismos modelo mamífero, isto é, em grande parte centrado sobre a criação e desenvolvimento de ratinhos transgénicos em que um elemento genético de interesse é flanqueado por sítios reconhecidos por uma recombinase. Isto pode resultar em um sítio específico manipulação destes genes flanqueados. Embora esta tenha sido uma estratégia bem sucedida, é tempo e recursos intensivos; por exemplo, a criação de um animal transgénico tripla que expressam um gene floxed, a recombinase Cre e um gene repórter Cre requer múltiplos cruzamentos e validação. Em contraste, a injecção estereotáxica de replicação de partículas virais defeituosas que codificam uma proteína fluorescente e a recombinase num animal gene floxed não requer estratégias de melhoramento 1 genotipagem ou complexo. Além disso, se uma proteína fluorescente e Cre que expressa vírus é co-injectado com um segundo vírus ENCOding uma proteína fluorescente diferente, então isso fornece um controle dentro do tecido para a manipulação genética alvo. Embora esta estratégia ainda exige o uso de animais knock-in, estratégias de ARN baseado viralmente mediadas contornar a necessidade de animais transgénicos. Por exemplo, a injecção estereotáxica de vírus deficientes na replicação que codificam uma proteína fluorescente e um ARN de gancho de cabelo curto (shRNA) pode utilizar endógena máquinas ARNi da célula para resultar em uma redução potente da transcrição de um gene de interesse. No entanto, as estratégias de shRNA produzir genes sutil knock-baixos, muitas vezes resultando em modestos fenótipos celulares 2. Enquanto um knock-down pode ser mais fisiologicamente relevante para a disfunção do gene heterozigótica, a sua robustez diminuiu em comparação com um knock-out não é ideal para a descoberta de novos genes fenotípica. Uma terceira técnica que surgiu recentemente, o CRISPR (cluster regularmente espaçadas Repita Palindromic Short) / Cas9 (CRISPR-associadoproteína 9) do sistema, baseia-se na expressão de tanto um pequeno RNA exógeno e um enzima corte o ADN. O sistema / Cas9 CRISPR foi adaptado a partir do sistema imunitário evoluiu procariotas que um método de identificação externa, invadir o ADN de vírus e orientando-o para a degradação através da enzima Cas9 3,4. Esta técnica poderosa edição genoma pode ser utilizado para a criação de deleções, inserções, segmentados e mutações; e o seguinte protocolo irá descrever como fazer deleções no gene de interesse, a fim de knockout a sua expressão in vivo. A enzima Cas9 deve ser expressa com uma guia de ARN homólogo à região de interesse e contígua com um ARN de andaime. Knockout de um gene utilizando esta técnica requer a segmentação Cas9 para uma região específica do genoma, utilizando ARN de orientação sintéticos (sgRNA), e indução de quebras de cadeia dupla (DSB) no sítio de interesse. Estes LAP são então reparado pela maquinaria celular reparação endógena via não homóloga-end juntar (NHEJ) que leanúncio para indels que podem produzir missense ou sem sentido mutações e pode, portanto, criar uma perda de expressão da proteína funcional 5. Uma vez que este sistema produz alterações genómicas, que exige apenas a expressão transiente do Cas9 e sgRNA. No entanto, é desejável que um indicador fluorescente estável para identificar as células e a sua progenia manipuladas deste modo. Lenti- retrovírus e tem a vantagem de integrar de forma estável de ADN de interesse em células hospedeiras que mantêm a expressão de longo prazo e são passados ​​para baixo para as células filhas durante a mitose. Este protocolo descreve a concepção e produção de dois tipos de replicação defeituosa, retrovírus título elevado: o vírus da imunodeficiência humana partículas lentivirais derivados (lentivírus) e aqueles baseados em vírus Maloney da leucemia de murino (retrovírus). Embora ambos estes vírus são capazes de suportar estáveis ​​que expressam transgenes de grandes, as partículas retrovirais só pode integrar-se no genoma dudivisão celular anel com a degradação do envelope nuclear, e, portanto, pode ser usado como uma ferramenta para etiquetar e células data de nascimento 6. Enquanto lentivírus têm uma reputação de ser relativamente baixo título 7, esta metodologia, incluindo o uso de cafeína 8 durante a coleta viral, rotineiramente produz títulos de 10 9 e 10 10 partículas / ml. Outra vantagem de lenti- e retrovírus é a tolerância para muito grandes inserções. O seguinte conjunto de protocolos descreve o procedimento para a concepção de um Lenti ou retrovírus que codifica um repórter fluorescente, sgRNAs, e Cas9 para utilizar o sistema / Cas9 CRISPR para modificar o ADN, bem como expressar uma proteína fluorescente. Rato neurocirurgia estereotáxica é um método valioso para injetar vírus in vivo para estudo da morfologia, função e conectividade dos neurônios infectados. A infecção viral nos neurónios podem ser usadas para manipular os níveis de expressão ao longo de um período prolongado de timE, tal como ao longo do desenvolvimento, e a expressão pode ser controlada com precisão através da utilização de vários sistemas indutíveis drogas e expressão específica orientada Cre. Este protocolo particular explica como injetar um vírus expressando uma sgRNA e Cas9 para nocautear um gene de interesse no cérebro de um rato adulto. Os ratinhos recuperam muito rapidamente a partir deste procedimento e a expressão do transgene viral pode ser visto dentro de pós-injecção de 48 horas. No entanto, a expressão fluoróforo parece aumentar ao longo de semanas, resultando em níveis máximos próximos por 3 semanas pós-infecção. Os ratos que sofrem de injecção estereotáxica viral pode ser utilizada para o comportamento, electrofisiologia, ou estudos morfológicos. No geral, o objectivo destes procedimentos é demonstrar como a nocaute um gene no cérebro do rato adulto usando cirurgia estereotáxica e um vírus expressando um sgRNA específico e Cas9.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Lista de Reagentes de Cultura de Células</td></tr><tr><td>293FT linha celular</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>Para Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP linha celular</td><td>Clontech</td><td>631458</td><td>Para Retrovírus</td></tr><tr><td>Modificação de DMEM de Iscove (IMDM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>IMDM completo com 10% de FBS, 1% de NEAA, 1% de L-Gln e&nbsp; 1% de P / S</td></tr><tr><td>de Soro Fetal Bovino (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais (NEAA)</td> <td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solução de L-Glutamina, 100x (L-Gln)</td> <td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina/Estreptomicina, 100x (P / S)</td> <td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno 10&nbsp; placa cm</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lista de Reagentes de Transfecção</td></tr><tr><td>5&nbsp; ml de tubos de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio Dihidratado (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>Faça uma solução de 2,5 M em ddH2O</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES Tamponado com Solução Salina (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8,2 g NaCl, 5,95&nbsp; g HEPES, 0,106 g Na2HPO4, pH 7,01 (exato!)</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; Unidade de filtro de seringa M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0,45 &micro; Unidade de filtro de seringa M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Seringa de 60 cc L/L</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Cônico</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>polietilenoglicol&nbsp; &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo Doador</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP, coelho, conjugado 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes de Cirurgia Estereotáxica</td></tr><tr><td>Vet-Syringe vet use T.B. Seringa apenas 1 cc Luer slip T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Bisturi de Aço Inoxidável, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>pomada artificial para lágrimas</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>solução salina normal&nbsp;</td>Aplicadores <td>com ponta de</td> algodão DYND500MLSH <td></td><td>Med-Vet International</td></tr><tr><td></td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica tripla&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; Agulhas Soft Pack 25 g x 5/8"</td><td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suturas de seda</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

concepção, embalagem, entrega e de alto título crispr retro e lentivírus via estereotáxica injection

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Lentivírus ou retrovírus defeituosos de replicação são capazes de integrar de forma estável transgenes no genoma de uma célula hospedeira infectada. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para codificar proteínas fluorescentes, controladores optogenéticos ou quimiogenéticos da atividade celular ou expressão heteróloga de genes humanos em organismos modelo. Esses vírus também foram usados com sucesso para entregar recombinases a locais-alvo relevantes em animais transgênicos, ou mesmo entregar pequenos grampos ou micro RNAs para manipular a expressão gênica. Embora essas técnicas tenham sido frutíferas, elas dependem de animais transgênicos (recombinases) ou frequentemente carecem de alta eficácia e especificidade (shRNA/miRNA). Em contraste, o sistema CRISPR / Cas usa uma nuclease Cas exógena que tem como alvo locais específicos no genoma de um organismo por meio de um RNA guia exógeno para induzir quebras de fita dupla no DNA. Essas quebras são então reparadas por junção de extremidade não homóloga (NHEJ), produzindo mutações de inserção e deleção (indel) que podem resultar em mutações deletérias de sentido incorreto ou sem sentido. Este manuscrito fornece métodos detalhados para o projeto, produção, injeção e validação de partículas de vírus de lenti/retro que podem transduzir neurônios de forma estável para expressar um repórter fluorescente, Cas9, e sgRNAs para nocautear genes em um organismo modelo.

Seguindo o &quot;Protocolo para a concepção de um Guia Strand (sgRNA) para CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, são inseridos os oligos alvo uma sequência particular no vector PXL clonagem a jusante do promotor hU6 e a jusante de um andaime de ARN guia utilizando os locais de clonagem Bbsl (Figura 1, passo 1). Este sgRNA é então excisada do PXL e inserido na coluna vertebral pRubi utilizando os locais PacI e BstBI (Figura 1, Passo 2). Finalmente, um outro sgRNA clonado PXL pode ser colocado a jusante do primeiro guia em pRubi-Guide1 (Figura 1, Passo 3), tendo como alvo uma outra área do gene e aumentar as chances de um nocaute via NHEJ. Verificação das construções de correcção deve ser determinada por análise da sequência. Uma vez que esta construção é feito, que pode ser empacotado em um vírus seguindo o &quot;Protocolo para Retro / Lentivirus produção- Método CaPO4&quot;. embalagem bem sucedida é confirmada pela infecção de vírus em células HEK293, a fim de titular a vIrus. Se não houver nenhuma expressão fluoróforo então provavelmente houve um erro durante o acondicionamento do vírus. A Figura 2 é um resultado representativo de 2, um retrovírus que expressa GFP e a outra expressando mCherry, co-injectados no giro dentado de rato neonatal (7 dias de idade) e fotografada 21 dias pós-injecção. A marcação de neurónios com mCherry ou GFP permite a avaliação morfológica de várias manipulações genéticas no mesmo tecido, em que um vírus podem expressar um CRISPR / Cas9 mediada KO e a outra um vírus de controlo, que expressam apenas um fluoróforo. injecção estereotáxica permite selectividade anatómica precisa, como demonstrado pela infecção discreta das coordenadas destinadas, no giro dentado. Ao analisar secções do cérebro para a infecção, é importante para manter o tecido circundante até que seja determinado que a região anatómica correcta foi infectado. Se não houver nenhum sinal de infecção, então é possível que a injecção ocorreu em um uma região vizinhad pode ser identificado nas secções vizinhas. Também pode ser útil para localizar o percurso da agulha para encontrar a região exacta de injecção. Vírus pseudotipados VSVG raramente se espalha para fora das margens do giro dentado, quando injectado in vivo, e tendem a espalhar-se as células infectar eixo rostral / caudal ao longo de todo o giro denteado, tal como analisado por reconstrução 3D (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Figura 1:. Estratégia de clonagem para o plasmídeo pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR retroviral Esta estratégia é idêntico para os plasmídeos lentivirais baseados-FU. oligos sgRNA são recozidos e inserido PXL utilizando os locais de clonagem BSBI. Após sequenciação para assegurar que o sgRNA é inserido com sucesso em PXL, digerir o plasmídeo com BstBI e PacI. A inserção que é deixado cair fora (caixa preta) é então clonado na parte traseira b viralum (preto linhas pontilhadas) pRubi-Guide1 CRISPR. Um segundo sgRNA também pode ser inserido PXL e digerido usando a enzima PacI. Este é então clonado no vector CRISPR pRubi-Guide1 (vermelho linhas pontilhadas), utilizando o local PacI. O plasmídeo resultante, em seguida, contém ambos os fios de guia, bem como os elementos virais necessárias, promotores e fluoróforos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Figura 2:. Retroviral de injecção do giro dentado do rato Os retrovírus que expressam mCherry (vermelho) ou GFP (verde) foram injectados no giro dentado de um ratinho P7. 21 dias mais tarde, os ratinhos foram perfundidos e os cérebros seccionados e corados para GFP e mCherry. (A) Uma imagem fluorescente de campo amplo 5X mostra o PRECISÃO da injeção giro denteado e a especificidade da rotulagem dentados neurônios giro granulares. A morfologia do hipocampo pode ser visto através do DAPI (azul) coloração. Barra de escala mede 200 um. (B) Uma imagem fluorescente 10X de campo amplo demonstra que estes lentivírus alto título infectar um grande número de células cuja morfologia pode ser acessado via expressão fluoróforo. Barra de escala mede 100 mm. (C) Os vírus expressando GFP ou mCherry foram co-injectado no giro dentado. Utilizando um sistema de retrovírus, pode-se usar um vírus para fazer uma manipulação genética marcada por GFP e outra manipulação marcado por mCherry, e depois avaliar as mudanças individuais ou aditivos devido a cada vírus. Barra de escala mede 10 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Figura 3:. Propagação anatômica de injecção lentiviral coinjection estereotáxica<html> de um vírus GFP-shPten e um controle de vírus mCherry no cérebro de um adulto Pten loxP / rato + resultou num propagação virai ao longo do eixo rostral toda / caudal do giro dentado do hipocampo. Isto é mostrado de uma reconstrução 3D da extensão da injecção em que fechada contornos da propagação virai foram traçados ao longo de 21 secções em série (z = 50 um / secção), usando software de reconstrução. Os traçados de contorno foram então alinhados para gerar as imagens 3D para quantificação volume. Propagação viral total é mostrado em verde (volume = 54.730.800 mm 3) e disseminação localizada-denteado é mostrado em roxo (volume = 27.275.200 mm 3). O vírus propaga-se ao longo do percurso da agulha e do corpo caloso, na intersecção da pista de agulha além de preencher o eixo rostral / caudal do giro dentado. Barra de escala mede 200 um. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Suplementar vídeo 1. Projeto de sgRNAs para clonar no backbone retroviral e lentiviral. Neste exemplo de design RNA guia sintética (sgRNA), a sequência genômica de CHD8 mouse é baixado do NCBI. O códon de iniciação e da estrutura exão são então visualizados em Vector NTI. Isso nos permite copiar a região genômica em torno do primeiro exão de codificação e entrar nesta seqüência em Benchling. Benchling nos permite visualizar todos os sgRNAs potenciais na região. Além disso, depois de indicar a região genômica temos entrada, Benchling vai nos mostrar as pontuações on-alvo e fora do alvo para cada RNA guia. O usuário pode então selecionar a RNA guia com as maiores pontuações dentro e fora do alvo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a>

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir que pesquisadores projetem e embalam vírus que expressam uma proteína fluorescente, CAS9 e sgRNAs, e em seguida os injetem estereotaxicamente no cérebro do camundongo.Este método pode ajudar a responder perguntas específicas na área de neurociência, como o papel de genes que estão na base de distúrbios neurológicos e neurodesenvolvimentais. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de manipular genes específicos sem o processo demorado e que consome muitos recursos de criação de animais geneticamente modificados.Antes de preparar as células, utilize um site para gerar uma fita guia de 20 nucleotídeos ou um sgRNA que será usado para projetar oligos de fita simples. Após encomendar os oligos e utilizá-los para criar um plasmídeo final conforme descrito no protocolo textual, prossiga pipetando todas as células descongeladas de um criotubo para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 2 mililitros de IMDM completo equilibrado com CO2 pré-aquecido. Em seguida, centrifugue as células por cinco minutos a 500 vezes g. Depois disso, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 10 mililitros de IMDM completo. Plaque as células em uma placa de cultura celular de 10 cm e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono. 24 horas após o plaqueamento, troque o meio aspirando o meio existente e adicionando 10 mililitros de IMDM pré-aquecido. Divida as células quando estiverem confluentes. Para dividir as células, aspire o meio e lave a placa com 5 mililitros de PBS. Em seguida, adicione 1 mililitro de tripsina 0,25% à placa e incube a 37 graus Celsius até que as células se desprendam da placa.Em seguida, adicione 0,5 mililitros de IMDM para neutralizar a reação da tripsina e pipete as células para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes g durante cinco minutos. Re-suspenda as células em um mililitro de IMDM e dilua 10 microlitros de células em 90 microlitros de PBS.Conte as células utilizando um hemocitômetro ou um contador automático de células e replante as células com IMDM completo. No quinto dia, troque o meio duas horas antes da transfeção e certifique-se de que haja exatamente 10 mililitros de meio na placa de 10 centímetros. Em seguida, prepare os reagentes de transfeção para dois recipientes utilizando dois tubos de poliestireno redondos de 5 mililitros. Identifique o primeiro tubo como DNA e o segundo tubo como HBS 2X. Ajuste, então, a concentração de DNA para 1 micrograma por microlitro em Tris EDTA com pH 7,4. Para preparar os reagentes de transfeção para lentivírus e retrovírus, adicione lentamente os componentes necessários ao tubo rotulado DNA, batendo continuamente no tubo para misturar. Em seguida, adicione um mililitro de HBS 2X ao tubo rotulado 2X HBS. Depois, acrescente lentamente um mililitro do conteúdo do tubo DNA ao tubo 2X HBS, uma gota de cada vez. Bata continuamente no tubo 2X HBS e observe o precipitado de fosfato de cálcio formado após cada gota, para garantir a formação bem-sucedida dos complexos de transfeção. Incube então o tubo no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, adicione um mililitro do reagente de transfeção em gotas lentas a cada placa celular de 10 centímetros e incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. Substitua o meio no sexto dia.No sétimo dia, transfira o meio contendo partículas virais com uma pipeta serológica de 10 mililitros para um tubo cônico de 50 mililitros antes de armazená-lo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione oito mililitros do meio com 0,5% de FBS a cada placa de células.No oitavo dia, colete o meio celular contendo partículas virais e combine-o com a colheita do dia anterior no tubo cônico de 50 mililitros.Nesta etapa, centrifugue o sobrenatante viral a 2000 vezes g durante 10 minutos. Em seguida, purifique o meio viral filtrando-o através de um filtro de seringa com baixa ligação a proteínas de 0,45 micrômetro. A seguir, adicione a solução de polietilenoglicol 6000 5X ao meio. Inverta o tubo várias vezes para homogeneizar. Incube então a mistura viral a quatro graus Celsius por pelo menos 12 horas.No nono dia, centrifugue a mistura viral a 2500 vezes G durante 45 minutos. Após 45 minutos, descarte o sobrenadante e gire novamente por dois minutos. Em seguida, remova o sobrenadante novamente. Posteriormente, re-suspenda o pellet adicionando 320 microlitros de PBS estéril e incube no agitador à temperatura ambiente por 30 minutos. No dia seguinte, alíquotas do vírus devem ser congeladas a menos 80 graus Celsius. Para iniciar este procedimento, realize a depilação da cabeça de um camundongo anestesiado a fim de preparar o local da injeção. Direcione 4% de isoflurano para o cone nasal. Em seguida, posicione o camundongo no aparelho estereotáxico. Insira a barra de mordida em sua boca até que os dentes se encaixem na ranhura antes de fixar as hastes auriculares. Certifique-se de que o corpo do animal esteja sobre o tapete aquecido e que o nariz esteja posicionado dentro do cone nasal.Em seguida, confirme a anestesia aplicando uma pressão no pé. Então, aplique lágrimas artificiais para lubrificar os olhos. Posteriormente, passe povidona-iodo e lidocaína no couro cabeludo raspado.Agora, faça uma pequena incisão ao longo da linha média do couro cabeludo. Seque o crânio com um cotonete e aplique peróxido de hidrogênio para ajudar a visualizar o bregma. Usando um microscópio estereoscópico, localize o bregma no crânio e posicione a broca acima dele.Defina as coordenadas estereotáxicas digitais dos planos X, Y e Z como zero. Para garantir que a cabeça esteja nivelada no eixo Y rostrocaudal, posicione a broca sobre o ponto lambda e nivele a cabeça de modo que a coordenada Z seja aproximadamente igual a zero em bregma e lambda. Para assegurar que a cabeça esteja nivelada ao longo do eixo X, posicione a broca no ponto médio entre bregma e lambda e meça as coordenadas Z a um milímetro do ponto médio em ambos os lados, garantindo que sejam iguais.A seguir, reduza o isoflurano para 2% antes de posicionar a broca sobre as coordenadas desejadas e perfure cuidadosamente o crânio. Após fazer todos os furos, fixe a seringa contendo o vírus no instrumento estereotáxico. Centralize a seringa sobre o furo e ajuste a coordenada Z na superfície do crânio como zero. Abaixe lentamente a seringa até a profundidade Z mais profunda e inicie a injeção a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto utilizando um injetor estereotáxico. Após a conclusão da injeção na profundidade Z mais profunda, aguarde um minuto antes de elevá-la até a próxima coordenada e reinicie a injeção. Continue esse padrão até que todas as coordenadas Z de injeção tenham sido injetadas.Após a última injeção, aguarde dois minutos antes de remover a seringa. Em seguida, retire o camundongo do aparelho estereotáxico e feche o couro cabeludo com pontos. Aplique lidocaína e creme antibacteriano no local cirúrgico e administre medicação analgésica antes de transferir o animal para uma câmara de recuperação aquecida.Esta imagem fluorescente de campo amplo 10X demonstrou que retrovírus de alto título infectam um grande número de células, cuja morfologia pode ser avaliada por meio da expressão de fluoróforos. Neste exemplo, vírus expressando GFP ou mCherry foram coinjetados no giro denteado. Utilizando um sistema de retrovírus, pode-se usar um vírus para realizar uma manipulação genética marcada por GFP e outra manipulação marcada por mCherry, e então avaliar as alterações individuais ou aditivas decorrentes de cada vírus.Esta é uma reconstrução tridimensional da extensão da injeção na qual contornos fechados da disseminação viral foram traçados ao longo de 21 seções seriadas. Os traçados dos contornos foram então alinhados para gerar imagens tridimensionais para a quantificação do volume. A disseminação viral total é mostrada em verde e a disseminação localizada no giro denteado é mostrada em roxo. Esta imagem mostra o vírus se espalhando ao longo do trajeto da agulha e do corpo caloso, além de preencher o eixo rostral-caudal do giro denteado.Após a injeção viral in vivo, utilizamos outros métodos, como histologia, eletrofisiologia ou microscopia live twofold, para estudar as consequências da manipulação genética no desenvolvimento neuronal.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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