analisando In Vivo Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é analisar a função de um gene candidato no controle da migração celular in vivo usando transplante de células combinado com imagens ao vivo no embrião de peixe-zebra. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo da migração celular, como determinar o papel e a importância de novos genes candidatos na migração celular in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela cria embriões em mosaico, o que permite uma boa imagem e adenomiose celular.

Para preparar agulhas de transplante de células, use um extrator de micropipeta para puxar um copo capilar. Em seguida, com uma microforja, corte a ponta da agulha no ponto em que o diâmetro interno é de 35 micrômetros. Usando um micromoedor, chanfre a extremidade cortada do capilar em um ângulo de 45 graus.

Para eliminar resíduos de vidro, insira a agulha em um porta-agulha montado em uma seringa e, em seguida, use ácido fluorídrico a 2% para enxaguar o interior da agulha três vezes, puxando a solução para dentro e para fora. Em seguida, enxágue a agulha com acetona três vezes. Para preparar pratos para injeção ou transplante de células, prepare 1% de agarose aquecendo 50 mililitros de meio embrionário contendo 0,5 gramas de agarose no microondas por um minuto na potência máxima.

Resfrie o gel de agarose a cerca de 60 graus Celsius e despeje todo o volume em uma placa de Petri de 90 milímetros. Insira um molde para criar linhas para injeção ou para criar poços para transplante de células. Quando o gel de agarose estiver definido, use uma pinça para remover o molde.

Para injetar embriões de doadores, sob um estereomicroscópio, use uma pinça para espremer suavemente os embriões transgênicos coletados nas linhas de um prato de injeção cheio de meio embrionário. Com uma pinça, oriente os embriões com as células voltadas para o topo e incube o prato a 28 graus Celsius até que os embriões atinjam o estágio de quatro células. Em seguida, carregue uma agulha de injeção com dois microlitros de uma solução de injeção previamente preparada contendo o domínio de ligação à actina da proteína de ligação à actina de levedura 140 ligada à mcherry.

Em seguida, insira a agulha em um porta-agulha conectado a um micromanipulador e conectado a um transjetor de ar. Abra a agulha usando uma pinça fina para tocar suavemente a ponta da agulha ou beliscando sua extremidade. Em seguida, insira a agulha em uma das quatro células e injete a solução para preencher 70% do volume celular.

Injete 30 embriões de maneira semelhante. Quando os embriões atingirem o estágio de esfera, use uma pipeta de pastagem de plástico para transferir embriões GFP de ganso transgênicos hospedeiros e embriões de doadores previamente injetados em placas de Petri separadas de 35 milímetros revestidas com agarose de um milímetro em meio embrionário e preenchidas com meio embrião de caneta / estreptococo. Usando uma pinça fina, extraia manualmente os embriões de seus córions.

Em seguida, coloque os embriões na incubadora a 28 graus Celsius. Quando os embriões atingirem o estágio de escudo sob um microscópio fluorescente, selecione embriões de doadores que expressem ABP140 mcherry dentro do escudo verde. Usando uma pipeta de pastagem polida a fogo, transfira os embriões hospedeiros para uma fileira de poços na placa de transplante de células preenchida com Pen / Strep EM. Em seguida, coloque os embriões doadores na fileira vizinha.

Em seguida, com um cílio, oriente cuidadosamente os embriões com o escudo para cima. Em seguida, usando um porta-agulha preso a uma seringa, enxágue a ponta da agulha puxando e expelindo o etanol a 70%. Seque a agulha puxando ar para dentro dela.

Quando a agulha estiver seca, insira-a no porta-agulha conectado à seringa Hamilton com o chanfro voltado para cima. Para realizar o transplante de escudo a escudo, entre no escudo de um embrião doador com a agulha de transplante e extraia cerca de 10 a 20 células marcadas com ABP140 mcherry. Evite cuidadosamente tirar gema.

Transplante as células para o escudo do embrião hospedeiro e repita a transferência celular até que todos os embriões hospedeiros tenham sido transplantados. Quando o transplante estiver concluído, use uma pipeta de pastagem polida a fogo para remover quaisquer embriões danificados. Incube os embriões transplantados a 28 graus Celsius por cerca de 30 minutos para permitir que eles se recuperem.

Para transplantar células pré-genitoras de placa pré-cordal única após embriões descorionantes, conforme demonstrado anteriormente, use uma pipeta de pastagem polida a fogo para transferir três embriões de doadores para uma placa de transplante de células preenchida com anéis livres de cálcio Pen / Strep. Com uma pinça fina para cada embrião, disseque um explante contendo as células injetadas marcadas com ABP140 mcherry e descarte rapidamente o restante dos embriões. Usando um cílio, mexa suavemente os explantes até que as células se dissociem.

Em seguida, desenhe uma única célula isolada na agulha de transplante e transplante-a para o escudo de um embrião hospedeiro, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Para um controle ideal da aspiração e transplante, mantenha a separação ar/água a cerca de 20 centímetros da extremidade da agulha. Para montar os embriões, encha um frasco com fundo de vidro com um milímetro de 0,2% de agarose quente em EM. Coloque o frasco a 42 graus Celsius em um bloco de calor.

Transfira um embrião selecionado para a solução de agarose e descarte o excesso de meio embrionário da pipeta. Em seguida, desenhe o embrião para a pipeta com agarose e transfira-o para uma câmara de imagem previamente preparada junto com uma gota de agarose. Antes que a agarose seja fixada, use um cílio para orientar o embrião, colocando a placa pré-cordal em perspectiva para cima para imagens com um microscópio vertical ou no fundo de vidro para imagens com um microscópio invertido.

Haverá cerca de 40 segundos para orientar o embrião antes que o gel de agarose endureça, dependendo da temperatura ambiente. Oriente o embrião rapidamente manipulando o blastoderma em vez da gema, que é muito frágil. Depois que todos os embriões estiverem montados e a agarose for definida, use Pen/Strep EM para encher a câmara e evitar que os embriões sequem.

Realize imagens de células vivas e experiências de dinâmica celular de acordo com o protocolo de texto. A técnica demonstrada neste vídeo foi usada para analisar o papel do Sin1, um dos principais componentes do complexo dois do TOR no controle da migração celular in vivo. Este filme mostra a migração de células pré-genitoras de placas pré-cordais transplantadas.

A marcação com actina permite visualizar as saliências citoplasmáticas ricas em actina. Através da análise de frequência e orientação, observou-se que as células do tipo selvagem freqüentemente produzem grandes saliências citoplasmáticas, orientadas na direção do pólo animal e da migração. Como visto nesta figura, a perda de função de Sin1 leva a uma redução drástica no número de saliências e randomização das saliências restantes, demonstrando a importância de Sin1 no controle da formação de protrusões ricas em actina.

Curiosamente, o fenótipo Sin1 pode ser resgatado pela expressão de uma forma constitutivamente ativa de Rac1, sugerindo fortemente que o TOR C2 controla a dinâmica da actina e a formação de protrusão celular através de Rac1. Essa técnica também foi usada para analisar o papel do arpin, um inibidor do complexo ARP2/3 na migração celular. Como mostrado aqui, a perda de função do arpin leva a um aumento na frequência de protrusão, devido à formação de protrusão mais frequente ou a um aumento na estabilidade da protrusão.

A medição do tempo de vida da protrusão na ausência de arpin revelou que a persistência temporal das saliências dobrou, indicando um aumento na estabilidade. Uma vez dominado, o transplante de cerca de 30 embriões pode ser feito em 45 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante ficar de olho no desenvolvimento dos embriões, pois todas as etapas são cronometradas criticamente.

Após este procedimento, outros métodos, como microscopia confocal ao vivo, podem ser realizados para fornecer melhores imagens e abordar questões relacionadas à organização subcelular de elementos citoscópicos, marcadores de polaridade, proteínas de adição ou qualquer outro constituinte celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar transplantes de pré-géneos de placas pré-cordais para analisar o papel de qualquer gene candidato na migração celular in vivo.