Name: analisando In Vivo Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a analisar migração celular in vivo combinando transplante celular e imagem time-lapse em embriões de Danio rerio. Este método permite estudar funções gênicas em biologia do desenvolvimento.

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Agradecemos a F. Bouallague e ao biotério IBENS pelo excelente cuidado com o peixe-zebra. A investigação relatada nesta publicação foi apoiada pela Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, bolsas N° SFI20111203770 e N° PJA 20131200143.

Nota: A Figura 1 apresenta o esquema do protocolo. 1. Preparação das agulhas para injeção e Transplante Nota: As agulhas podem ser preparados em qualquer momento e armazenado. Mantê-los em uma placa de Petri, em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme para proteger da poeira. <ol><li> Para agulhas de injeção, puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,58 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta (ver lista de materiais). Prefere agulhas curtas e finas (parte afunilada de cerca de 5 mm), como eles são mais eficientes para perfurar o córion. Nota: As agulhas de injecção são de uso único. </li><li> Agulhas para Transplante de Células <ol><li> Puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,78 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta. </li><li> vocêcantar uma microforge (ver lista de materiais), corte a ponta da agulha no ponto em que o diâmetro interno é de 35 uM (um pouco mais do que o diâmetro das células a serem transplantadas). </li><li> Bevel a extremidade cortada do capilar com um microgrinder (ver lista de materiais) com um ângulo de 45 °. </li><li> Opcionalmente, puxar uma barbela sobre a extremidade da agulha utilizando um microforge. Para isso, tocar o filamento quente com a ponta do bisel e rapidamente o puxar para fora, criando uma farpa que pode ajudar a penetração do embrião. </li><li> Montar a agulha num suporte de agulha ligada a uma seringa. Usando a seringa, lavar o interior da agulha três vezes com ácido fluorídrico a 2% para eliminar os resíduos de vidro, e em seguida enxaguar três vezes com acetona. Cuidado: o ácido fluorídrico é tóxico, manipular sob o capô, com luvas. Nota: As agulhas de transplantação de células pode ser utilizado várias vezes. </li></ol></li></ol> 2. Preparação daLoiça para injeção e Transplante de Células <ol><li> Calor 50 ml de embrião médio 11, que contém 0,5 g de agarose, num forno de microondas durante 1 minuto na potência máxima para obter 1% de agarose em forma de embriões. Arrefece-se a gel de agarose a cerca de 60 ° C e verter 50 ml em uma placa de Petri de 90 mm. Coloque na superfície do gel de um molde especialmente projetado (ver lista de materiais), ou com linhas para o prato de injecção ou com poços para o prato transplante de células. <ol><li> Observe o flutuador mofo no agarose, se a agarose não é muito quente. Depois o gel de agarose é definido, remover o molde com uma pinça (Figura 2A - B). Nota: os pratos podem ser armazenadas a 4 ° C, até algumas semanas. Mantê-los em uma caixa molhada fechada, para evitar a secagem. </li></ol></li><li> Colocar a cápsula num incubador de 28 ° C 30 min antes da utilização. </li></ol> 3. Recolha de embriões e Injection <ol><li> Injecção Preparação de Solução Nota: domínio de ligação à actinada levedura proteína 140 (SPA-140) tal como Lifeact obrigado a mCherry se liga à actina (referido como ABP140-mCherry) é usado para visualizar actina polimerizada no interior da célula, a fim de analisar a actividade protuberante. Adicione outro composto a testar a função de um gene candidato (por exemplo, ARNm de construção negativo dominante ou constitutivamente activa, ou oligonucleótidos morfolino). Para avaliar as funções de SIN1 como descrito nos resultados (Figura 3), foram utilizados oligonucleótidos morfolino. Como um controlo, foi utilizado um morfolino idêntico ao morfolino SIN1 mas durante 5 nucleótidos distribuídos ao longo da sequência de modo a que este morfolino controlo não coincidir com o ARN alvo. <ol><li> SIN1 Thaw e morpholinos de controlo de 5 de incompatibilidade (2 solução de ações mm) e ABP140-mCherry mRNAs no gelo. Adicionar 375 ng de mRNAs (75 ng / mL final) e 0,75 mL de quer morfolino controle SIN1 ou 5-incompatibilidade (0,3 mM final) em tampão Danieau (NaCl 58 mM, 0,7 mMKCl, 0,4 mM de MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO3) 2, 5,0 mM de HEPES pH 7,6), para alcançar um volume total de 5 mL. </li></ol></li><li> de colheita de embriões Nota: para esta montagem experimental ambos os embriões de dadores e de acolhimento são transgênicos, expressando a GFP sob o controle do Goosecoid (GSC) promotor, a fim de visualizar a placa precordial prospectivo 11. <ol><li> Recolha Tg (GSC: GFP) ovos. Colocar cerca de 80 ovos em um prato de 90 milímetros de Petri cheio com o meio de embrião e incubar a 28 ° C. </li></ol></li><li> Injetar embriões doadores <ol><li> Sob um microscópio estereoscópico, esprema delicadamente embriões coletadas com pinça na linhas de um prato de injeção preenchido com meio embrião. Utilizando uma pinça, orientar os embriões com as células em direção ao topo. Colocar o prato de injecção na incubadora a 28 ° C até os embriões terem atingido o estádio de 4 células (1 h após a fertilização). </li><li> Coloque uma agulha de injecção com 2 ul desolução de injecção. Inserir a agulha em um suporte de agulha (ver lista de materiais) que é colocado em um micro-manipulador (ver lista de materiais) e conectado com politetrafluoretileno (PTFE) tubo (ver lista de materiais) para um Transjector ar (ver lista de materiais ). </li><li> Abra o capilar tocando delicadamente a ponta com uma pinça fina. Se necessário, cortar o capilar aberto por beliscar sua extremidade. </li><li> Entre uma das quatro células, com a agulha e injectar a solução no interior da célula, a fim de preencher 70% do volume da célula (2 nl). Injectar 30 embriões. Nota: Obtendo a agulha na célula pode ser difícil, porque a membrana plasmática é macio. Visando a junção entre a célula ea gema facilita a penetração da agulha. </li><li> Coloque os embriões em 28 ° C incubadora até que tenham atingido a fase esfera (4 horas após a fertilização). </li></ol></li></ol> 4. Preparação dos embriões para o celular Transplantatíon <ol><li> Prepare 20 ml de meio de embrião com 200 mL de penicilina / estreptomicina (ver lista de materiais) (Pen / Strep EM). </li><li> Dechorionation dos embriões na fase esfera (4 h após a fertilização) Nota: embriões dechorionated são muito frágeis e vai explodir em caso de contacto com o ar ou plástico. Eles precisam, portanto, ser colocado em pratos revestidos com agarose, e transferido por meio de pipetas de Pasteur de vidro polido ao fogo. <ol><li> Usando uma pipeta de Pasteur de plástico, transferir embriões de acolhimento recolhidos no passo 3.2 e embriões de dadores injetados no passo 3.3 em duas 35 milímetros placas de Petri revestidas com agarose a 1% em meio embrião e preenchidos com Pen / Strep EM. Manter embriões de acolhimento e embriões de dadores em dois pratos separados. </li><li> extrair manualmente os embriões de seus córions com uma pinça fina (ver lista de materiais). </li><li> Coloque os embriões no C incubadora de 28 ° até que tenham atingido a fase escudo (6 horas após a fertilização). </li></ol></li></ol>Transplante 5. celular <ol><li> Organizar os embriões para o transplante de células. <ol><li> Sob um microscópio estereoscópico fluorescente, selecione embriões doadores expressar ABP140-mCherry (vermelho) dentro do escudo (verde). </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões nos poços do prato de transplante de células preenchido com Pen / Strep EM. Coloque os embriões de acolhimento em uma linha e os embriões de dadores na linha limítrofe. </li><li> Usando um cílio, orientar cuidadosamente os embriões com o escudo para cima. Nota: a posição da blindagem pode ser avaliado por expressão da GFP ou anatomicamente. </li></ol></li><li> Transplante System Set-up. Nota: O sistema de transplante é composto por um suporte de agulha (ver lista de materiais) ligado com um tubo de PTFE (veja lista de Materiais) e um conector do tubo (ver lista de materiais) a uma seringa Hamilton equipado com um micro-drive (ver lista de Materiais). O suporte de agulhaestá montado sobre um micromanipulador de 3 vias (ver lista de Materiais). <ol><li> Utilizando um suporte de agulha ligada a uma seringa, a agulha para lavar o transplante de células com 70% de etanol. Seca-se por sucção de ar para dentro da agulha. Não secar por sopro, pois isso pode resultar em pó ficar preso na parte afilada da agulha. </li><li> Inserir a agulha no suporte de agulha ligada à seringa Hamilton, com o bisel para cima. </li></ol></li><li> Shield-to-escudo Transplante de Células <ol><li> Digite o escudo de um embrião doador com a agulha transplante e elaborar cerca de 10-20 células marcadas com ABP140-mCherry. Cuidadosamente evitar o desenho gema. </li><li> Transplante as células para a blindagem do embrião hospedeiro. Repita até que todos os embriões de acolhimento foram transplantados. </li><li> Remova todos os embriões danificados com uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Colocar os embriões transplantados na incubadora a 28 ° C e deixá-los recuperar durante cerca de 30 min. </li><li> Usando uma agulhatitular ligada a uma seringa, lave a agulha transplante de células com água e colocá-lo de volta em uma placa de Petri em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme. </li></ol></li></ol> 6. (Opcional) Transplante de Células Individual Nota: No embrião, as células aderem umas às outras, de modo que é difícil tirar apenas uma célula em que a agulha transplante. Nós desenvolvemos um protocolo modificado para transplantar facilmente células progenitoras placa precordial individuais. A ideia é a dissociar-se as células antes de transplante. Como as células progenitoras placa precordial isolados tendem a perder a sua identidade, nós geneticamente impor-lhes uma identidade placa precordial prospectivo, pela ativação da via de sinalização Nodal, na ausência do fator de transcrição Sox32. Verificamos que estas células induzidas se comportam como células progenitoras placa precordial endógenos 8. Abaixo estão os passos específicos para realizar transplantes de células individuais. dissocia celularção é conseguida pela colocação em embriões Ringer isenta de cálcio 11, dissecando um explante e mecanicamente agitando-o. <ol><li> No passo 2.1, preparar o prato transplante com 1% de agarose em Ringer livre de cálcio em vez de Embryo Médio. </li><li> No passo 3.1, em adição a ABP140-mCherry ARN e morfolino SIN1, adicionar 3 ng de ARN que codificam para a forma activa do receptor nodal taram-A (0,6 ng / mL final) e 1,25 ul de morfolino contra sox32 (solução mãe a 2 mM, 0,5 mM, consequentemente, final). </li><li> Após o passo 4, a transferência de três embriões doadores selecionados no prato para o transplante de células preenchido com Pen / Strep Ringer livre de cálcio usando uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Com uma pinça fina, dissecar um explante contendo as células injetadas (ABP140-mCherry células marcadas). Eliminar rapidamente o resto dos embriões. </li><li> Com um cílio, agitar suavemente o explante até que as células se dissociam. </li><li> Elaborar uma única célula isolada na agulha transplantee transplantá-la para a blindagem de um embrião hospedeiro. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões numa placa revestida de agarose-preenchido com Pen / Strep EM. Colocar os embriões na incubadora a 28 ° C durante 30 min. </li></ol> 7. Embrião de montagem <ol><li> imagiologia Câmara <ol><li> Método 1: usar uma câmara de imagem composta de uma lâmina de plástico (75 * 25 * 0.5 mm) perfurado com 4 furos (5,5 mm de diâmetro), com bordas de 3 mm em um lado (Figura 2C - D). Cole uma lamela de vidro na parte de trás, com cianoacrilato cola (super cola). Nota: No final do experimento, coloque a câmara na água por uma noite para remover a lamela e se livrar de resíduos de cola com papel de areia. </li><li> Método 2: Usar 35 mm Mattek vidro pratos inferiores (ver lista de materiais) com um buraco de 10 mm. </li></ol></li><li> montagem embrião <ol><li> Encher um frasco de vidro com 1 ml de agarose quente 0,2% em meio embrião.Mantê-la a 42 ° C num bloco de calor. </li><li> Sob o microscópio estereoscópico fluorescente, selecionar um embrião nas quais o Red células transplantadas são parte da placa precordial prospectivo marcados em verde (ou seja, células transplantadas vermelhas estão dentro da placa precordial prospectivo verde, e já começaram a migrar para o pólo animal). </li><li> Transferir um embrião seleccionado para a solução de agarose com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo. Descartar o excesso de meio de embrião a partir da pipeta. Desenhar o embrião na pipeta com agarose, e transferência do embrião na câmara de imagem, depositar uma gota de agarose. Antes de agarose é definido, orientar o embrião com um cílio. Colocar a placa pré-cordal potencial para cima para imagiologia com um microscópio vertical, ou na parte inferior de vidro para imagiologia com um microscópio invertido. Aguardar até que a agarose é definida (cerca de 1 min, dependendo da temperatura ambiente) antes de montar outra embrião no poço seguinte da câmara. Nota: um cha de imagemmber contendo 4 poços permite a montagem de até 4 embriões. </li><li> Quando a agarose é definido, encher a câmara com Pen / Strep EM para evitar a secagem. </li></ol></li></ol> 8. Imagens ao vivo <ol><li> Use um 40X de imersão em água da lente de longo alcance. Use filtros adequados para a imagem GFP e mCherry (para GFP: excitação BP 470/40, divisor de feixe FT 510, e emissão BP 540/50; para mCherry: excitação BP 578/21, divisor de feixe FT 596 e LP emissão de 641 / 75). Ajuste a duração da exposição, a fim de otimizar a dinâmica de imagem. </li><li> Para imagem todas as células na placa, adquirir z pilhas, começando alguns microns uma por cima da placa pré-cordal prospectivo (em ectoderme) e terminando uma alguns microns abaixo da placa pré-cordal prospectivo (na gema). Usar um passo de Z-2 uM. Para otimizar a velocidade de aquisição, mudar as cores entre Z-stacks, em vez de entre os quadros. Nota: Isto pode levar a pequenas diferenças entre as imagens vermelhas e verdes, mas não é um problema, já que nenhum co preciso-localization entre os sinais de verde e vermelho é necessária. Para reduzir ainda mais o tempo de imagem e exposição à luz, verde pode ser adquirida apenas uma vez a cada 5 pontos no tempo, o que é suficiente para identificar as células progenitoras placa precordial. </li><li> Usando essas configurações, a imagem até 4 embriões dentro do intervalo de tempo de dois minutos que é necessário analisar a frequência protrusão e orientação. Para a análise do ciclo de vida protrusão, reduzir o intervalo de tempo para 30 segundos para obter maior resolução de tempo. Imagem de 60% a 80% epiboly epiboly. </li></ol> Análise 9. Dynamics celular <ol><li> Carregar imagens 4D em ImageJ Nota: Dependendo do software utilizado para a aquisição, as imagens são armazenadas em formatos diferentes (um arquivo por imagem, um arquivo por z-stack, um arquivo para todo o experimento). Alguns Plugins ImageJ estão disponíveis on-line para abrir pilhas 4D. Nossos dados são armazenados como um arquivo por z-stack. Uma vez que o conjunto de dados pode ser grande, pode ser conveniente para abrir apenas uma parte dele (cerca de time pontos, ou uma sub do z-stack, ou 8-bit convertido imagens ...). Nós usamos uma custom-made ImageJ plugin para fazê-lo, o que nós ficaríamos felizes para distribuir a pedido. </li><li> Análise da Orientação e Freqüência de saliências celulares <ol><li> Use imagens GFP para determinar a direção principal da migração placa precordial prospectivo. Leve isso como uma referência para as medições angulares saliências celulares. Girar a pilha, de modo que este sentido de referência é paralelo a um dos lados da imagem. </li><li> Siga uma célula. Ferramenta Selecionar ângulo. Para cada quadro e cada protuberância, utilizar a ferramenta ângulo para medir o ângulo entre a saliência e a direcção de referência (Figura 3A). Use o comando Analisar / Medir para armazenar o valor (ou pressione M no teclado). Salvar os resultados como um arquivo txt. Repita com a próxima célula. </li><li> Importe os dados para distribuição ângulo trama R e como histogramas. Use o teste de Kolmogorov-Smirnov (ks.test em R) para comparar diferentes condições. Nota: A ferramenta ângulo fornece valores compreendidos entre 0 ° e 180 °, permitindo a utilização de testes estatísticos clássicos e os testes não circulares. </li><li> Com este conjunto de dados, calcular a frequência de emissão, conforme o número de protuberâncias por célula por minuto. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições. </li></ol></li><li> Análise do celular Saliências Lifetime <ol><li> Para cada célula e cada saliência, medida duração saliência (número de quadros durante o qual a saliência está presente X intervalo de tempo entre os quadros). </li><li> Importe os dados para R. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições. Nota: Outras características de migração pode ser interessante analisar, a fim de caracterizar a migração celular. Estes incluem faixas de células, para velocidade, direção e medidas de persistência, ou morfologia celular. Alguns aplicativos de software comerciais estão disponíveis para medir estas características, mas um grande número de apli software open-sourcecátions e plugins ImageJ também estão disponíveis, como, por exemplo, adaptar-se a analisar morfodinâmica 12, diper olhar para trajetórias celulares e persistência direcional 13, CellTrack para rastrear limites da célula durante a migração 14. </li></ol></li></ol>

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<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo apresenta uma forma fácil para estudar o papel de um gene candidato na migração de células in vivo, através da combinação da criação de embriões quiméricos que utilizam o transplante de células com imagens ao vivo. Criação de embriões mosaico O estudo da dinâmica de uma célula requer a visualização do seu contorno para analisar extensões citoplasmáticas. Isto pode ser conseguido por marcação das células isoladas numa outra forma não marcad...

Em organismos multicelulares, a migração celular é essencial tanto para o desenvolvimento do embrião em que assegura a organização de células em tecidos e órgãos, e para a vida adulta, em que participa a homeostase do tecido (cicatrização de ferimentos) e imunidade. Em adição a estas funções fisiológicas, a migração de células, também está envolvido em diversas situações patológicas, incluindo, em particular, a metástase do cancro. A migração celular foi analisado in vitro ao longo de décadas, proporcionando uma compreensão global dos mecanismos moleculares que garantem movimentos celulares em superfícies planas. In vivo no entanto, as células são confrontados por um ambiente mais complexo. É claramente apareceu nos últimos anos que a migração dentro de um organismo pode ser influenciada por estímulos externos, tais como a matriz extracelular, as células ou quimioquinas segregadas orientadores migração vizinha, e que os mecanismos de condução migração de células pode variar do que foi descrito &lt;em&gt; in vitro 1,2. Os mecanismos que garantam na migração celular vivo têm recebido menos atenção até agora, principalmente por causa do aumento da dificuldade técnica, em comparação com estudos in vitro. In vivo análise da migração celular em particular requer acesso óptico direto para as células migram, técnicas para marcar células únicas em a fim de ver a sua dinâmica e morfologia, assim como o ganho ou a perda de função de abordagens para testar o papel dos genes candidatos. Até agora, apenas alguns sistemas modelo que albergam estas características têm sido utilizadas para dissecar na migração celular in vivo 3. Recentemente, utilizou a migração da placa pré-cordal prospectivo em embriões de peixe-zebra iniciais como um novo sistema modelo conveniente para avaliar a função de genes candidatos para controlar a migração celular in vivo em 4,5. placa pré-cordal prospectivo (também conhecido como mesendoderm anterior) é um grupo de formação de células no início de Gastrulation no lado dorsal do embrião. Durante a gastrulação este grupo migra em conjunto em direcção ao polo animal do embrião 6-8, para formar a placa pré-cordal, um espessamento mesendodermal, anterior ao da notocorda e da placa neural subjacente. A parte anterior da placa precordial dará origem à glândula incubação, enquanto a sua parte posterior provavelmente contribui para a cabeça mesoderme 9. Graças ao desenvolvimento externo e clareza óptica do embrião de peixe, a migração de células pode ser facilmente e directamente observado nesta estrutura. O transplante celular é uma técnica muito potente que permite a criação rápida e fácil de embriões de mosaico 10. Expressando marcadores fluorescentes do citoesqueleto em células transplantadas resultados na marcação de células isoladas, a morfologia e a dinâmica das quais pode ser facilmente observado. Combinando isso a perda ou ganho de função se aproxima permite a análise de funções das células-autônoma de uma latagene didata. O protocolo apresentado descreve como avaliamos a função do componente SIN1 TORC2 no controle da migração celular e actina dinâmica in vivo 5. Mas, como mencionado nos resultados discutidos e ainda mais, que poderia ser utilizado para analisar a implicação potencial de qualquer gene candidato para controlar a migração celular in vivo.

<table><tbody><tr><td>Capilares de vidro (diâmetro externo 1,0 mm, diâmetro interno 0,58&nbsp; mm)</td> <td>Aparelho Harvard</td><td>300085</td><td>capilares de vidro de espessura padrão</td></tr><tr><td>(diâmetro externo 1,0 mm, diâmetro interno 0,78 mm)</td> <td>Aparelho Harvard</td><td>300085</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td> de parede fina <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&nbsp; 000&nbsp; unidades penicilina e 10&nbsp; mg estreptomicina por ml</td></tr><tr><td>pinças finas</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>pratos de fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Transjetor de ar</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Micromoedor</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador (para injeção)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador (para transplante de células)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulador</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Seringa</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 720</td><td></td></tr><tr><td>Molde de transplante</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Conector de tubo Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tubo de PTFE Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando<em&gt; in vivo</em&gt; migração celular usando transplantes de células e de imagem time-lapse em embriões zebrafish

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

A migração celular é fundamental para muitas condições fisiológicas e patológicas, incluindo metástase de câncer. As bases celulares e moleculares da migração celular foram minuciosamente analisadas in vitro. No entanto, a migração celular in vivo difere de alguma forma da migração in vitro e tem se mostrado mais difícil de analisar, sendo menos acessível à observação direta e manipulação. Este protocolo usa a migração da placa pré-cordal prospectiva no embrião inicial do peixe-zebra como um sistema modelo para estudar a função dos genes candidatos na migração celular. Os progenitores da placa pré-cordal formam um grupo de células que, durante a gastrulação, sofre uma migração direcionada do organizador embrionário para o pólo animal do embrião. O protocolo proposto usa transplante de células para criar embriões em mosaico. Isso oferece as vantagens combinadas de rotular células isoladas, o que é fundamental para uma boa imagem, e de limitar o ganho / perda de efeitos de função para as células observadas, garantindo assim efeitos autônomos da célula. Descrevemos aqui como avaliamos a função do componente TORC2 Sin1 na migração celular, mas o protocolo pode ser usado para analisar a função de qualquer gene candidato no controle da migração celular in vivo.

A técnica apresentada foi utilizado para analisar o papel da SIN1, um dos principais componentes do Tor complexa 2 (TORC2), no controle da migração celular vivo. O uso do transplante de células permite marcação de células isoladas e análise dos efeitos em células-autônoma. Filme S1 mostra a migração de células progenitoras da placa pré-cordal transplantados. rotulagem actina com ABP140 permite a visualização fácil de saliências citoplasmáticos ricas em actina. Nós medim...

Combinando transplante de células, marcação do citoesqueleto e abordagens de perda/ganho de função, este protocolo descreve como a placa pré-cordal prospectiva de peixe-zebra migratória pode ser usada para analisar a função de um gene candidato na migração celular in vivo.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a função de um gene candidato no controle da migração celular in vivo utilizando transplante celular combinado com imagem em tempo real no embrião de peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da migração celular, como determinar o papel e a importância de novos genes candidatos na migração celular in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela produz embriões em mosaico, o que permite uma boa visualização e análise da adenomiose celular.Para preparar as agulhas para transplante celular, utilize um puxador de micropipetas para puxar uma capilar de vidro. Em seguida, com um microforjador, corte a ponta da agulha no ponto em que o diâmetro interno for de 35 micrômetros. Usando um microesmeril, faça um bisel na extremidade cortada da capilar com um ângulo de 45 graus.Para eliminar resíduos de vidro, insira a agulha em um suporte para agulhas montado em uma seringa e, em seguida, use ácido fluorídrico 2% para enxaguar o interior da agulha três vezes, aspirando e expelindo a solução. Em seguida, enxágue a agulha com acetona três vezes. Para preparar as placas para injeção ou transplante celular, prepare agarose 1% aquecendo 50 mililitros de meio para embrião contendo 0,5 gramas de agarose em forno de micro-ondas por um minuto em potência máxima.Resfrie o gel de agarose até cerca de 60 graus Celsius e despeje todo o volume em uma placa de Petri de 90 milímetros. Insira um molde para criar linhas de injeção ou poços para transplante celular. Quando o gel de agarose estiver solidificado, use pinça para remover o molde.Para injetar embriões doadores, sob um microscópio estereoscópico, use pin&ccedil;as para comprimir suavemente os embri&otilde;es transg&ecirc;nicos coletados nas linhas de uma placa de inje&ccedil;&atilde;o preenchida com meio para embri&otilde;es. Com as pin&ccedil;as, oriente os embri&otilde;es com as c&eacute;lulas voltadas para cima e, em seguida, incube a placa a 28 graus Celsius at&eacute; que os embri&otilde;es alcancem o est&aacute;gio de quatro c&eacute;lulas. Em seguida, carregue uma agulha de inje&ccedil;&atilde;o com dois microlitros de uma solu&ccedil;&atilde;o de inje&ccedil;&atilde;o previamente preparada contendo o dom&iacute;nio ligador de actina da prote&iacute;na ligadora de actina de levedura 140 ligada ao mcherry.Em seguida, insira a agulha em um porta-agulhas acoplado a um micromanipulador e conectado a um injetor de ar. Abra a agulha usando pinça fina para tocar suavemente a ponta da agulha ou apertando sua extremidade. Em seguida, insira a agulha em uma das quatro células e injete a solução até preencher 70% do volume celular.Injete 30 embriões de maneira semelhante. Quando os embriões atingirem o estágio de esfera, use uma pipeta Pasteur de plástico para transferir os embriões transgênicos hospedeiros goosecoid GFP e os embriões doadores previamente injetados para placas de Petri separadas de 35 milímetros, revestidas com um milímetro de agarose em meio para embriões e preenchidas com meio para embriões contendo Pen/Strep. Usando pinças finas, extraia manualmente os embriões de suas corionas.Em seguida, coloque os embriões na incubadora a 28 graus Celsius. Quando os embriões atingirem o estágio de escudo sob um microscópio fluorescente, selecione os embriões doadores que expressem ABP140 mcherry dentro do escudo verde. Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transfira os embriões receptores para uma fileira de poços na placa de transplante celular preenchida com EM contendo Pen/Strep. Em seguida, coloque os embriões doadores na fileira vizinha.Em seguida, com um cílio, oriente cuidadosamente os embriões com o escudo voltado para cima. Depois, usando um porta-agulha acoplado a uma seringa, enxágue a ponta da agulha aspirando e expelindo etanol 70%. Seque a agulha aspirando ar para dentro dela.Quando a agulha estiver seca, insira-a no porta-agulhas conectado à seringa Hamilton com o bisel voltado para cima. Para realizar o transplante de escudo para escudo, introduza a agulha de transplante no escudo de um embrião doador e aspire cerca de 10 a 20 células marcadas com ABP140 mcherry. Evite cuidadosamente aspirar a gema.Transplante as células para o escudo do embrião hospedeiro e repita a transferência celular até que todos os embriões hospedeiros tenham sido transplantados. Quando o transplante estiver completo, utilize uma pipeta Pasteur polida ao fogo para remover quaisquer embriões danificados. Incube os embriões transplantados a 28 graus Celsius por cerca de 30 minutos para permitir que se recuperem.Para transplantar células individuais de precursores da placa pré-notocordal após a descorionação de embriões, conforme demonstrado anteriormente, utilize uma pipeta de Pasteur polida ao fogo para transferir três embriões doadores para um recipiente de transplante celular contendo solução de Ringer sem cálcio com Pen/Strep. Com pinças finas, dissecar para cada embrião um explante contendo as células marcadas com ABP140 mCherry injetadas e descartar rapidamente o restante dos embriões. Usando um cílio, agitar suavemente os explantes até que as células se dissociem.Em seguida, aspire uma única célula isolada na agulha de transplante e transplante-a para o escudo de um embrião hospedeiro, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Para um controle ideal da aspiração e do transplante, mantenha a separação ar/água a cerca de 20 centímetros da extremidade da agulha. Para montar os embriões, encha um frasco com fundo de vidro com um milímetro de agarose quente a 0,2% em EM. Coloque o frasco a 42 graus Celsius em um bloco de aquecimento.Transfira um embrião selecionado para a solução de agarose e descarte o meio em excesso do embrião da pipeta. Em seguida, aspire o embrião com a agarose para dentro da pipeta e transfira-o para uma câmara de imagem previamente preparada, juntamente com uma gota de agarose. Antes da solidificação da agarose, utilize um cílio para orientar o embrião, posicionando a placa pré-notocordal voltada para cima, caso a imagem seja obtida com um microscópio ereto, ou sobre o fundo de vidro, no caso de um microscópio invertido.Levará cerca de 40 segundos para orientar o embrião antes que o gel de agarose solidifique, dependendo da temperatura ambiente. Oriente o embrião rapidamente manipulando o blastoderma, e não a gema, que é muito frágil. Depois que todos os embriões forem montados e o agarose tiver solidificado, use o meio EM com Pen/Strep para preencher a câmara e evitar que os embriões sequem.Realize a imagem de células vivas e experimentos de dinâmica celular de acordo com o protocolo descrito no texto. A técnica demonstrada neste vídeo foi utilizada para analisar o papel da proteína Sin1, um dos componentes principais do complexo TOR dois, no controle da migração celular in vivo. Este filme mostra a migração de células precursoras da placa pré-notocordal transplantadas.A marcação da actina permite visualizar protrusões citoplasmáticas ricas em actina. Por meio da análise de frequência e orientação, observou-se que células selvagens produzem frequentemente grandes protrusões citoplasmáticas, orientadas na direção do polo animal e da migração. Como visto nesta figura, a perda de função de Sin1 leva a uma drástica redução no número de protrusões e à aleatorização das protrusões remanescentes, demonstrando a importância de Sin1 no controle da formação de protrusões ricas em actina.Curiosamente, o fenótipo Sin1 pode ser resgatado pela expressão de uma forma constitutivamente ativa de Rac1, sugerindo fortemente que o TORC2 controla a dinâmica do actina e a formação de protrusões celulares por meio de Rac1. Esta técnica também foi utilizada para analisar o papel da arpin, um inibidor do complexo ARP2/3, na migração celular. Como mostrado aqui, a perda de função da arpin leva a um aumento na frequência de protrusões, devido a uma formação mais frequente de protrusões ou a um aumento na estabilidade das protrusões.A medição da duração da protrusão na ausência de arpin revelou que a persistência temporal das protrusões dobrou, indicando um aumento na estabilidade. Uma vez dominado, o transplante de cerca de 30 embriões pode ser realizado em 45 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante observar o desenvolvimento dos embriões, já que todas as etapas são criticamente dependentes do tempo.Após este procedimento, outros métodos como microscopia confocal em tempo real podem ser realizados para obter imagens melhores e responder perguntas sobre a organização subcelular de elementos do citoesqueleto, marcadores de polaridade, proteínas adicionais ou qualquer outro constituinte celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar transplantes de precursores da placa pré-cordal para analisar o papel de qualquer gene candidato na migração celular in vivo.

analyzing-vivo-cell-migration-using-cell-transplantations-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Zebrafish transplante de células permite a combinação de genética e da embriologia para gerar quimeras tecidos específicos. Este vídeo demonstra gástrula encenado transplantes de células que têm permitido o nosso laboratório para investigar o papel das populações astroglial e pistas de orientação específica durante a formação da comissura no prosencéfalo.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Este vídeo descreve um método de microinjeção para entrega de células de câncer de mama no espaço perivitelino de embriões transgênicos de peixe-zebra. Após a incubação, visualizamos o embrião sob um microscópio fluorescente para observar a invasão, disseminação e metástase das células cancerígenas.

zPDX-Análise de Invasividade: Investigando o Comportamento Invasivo de Células Cancerígenas Metastáticas em Xenoenxertos de Embrião de Peixe-Zebra

Fonte: Williams, A. L., et al. Imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de células migratórias da crista neural em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra um protocolo de imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra em tempo real com alta resolução.

Visualizando a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra usando imagens de lapso de tempo multifóton

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

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acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

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Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

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