Name: Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados Plasmodium Esporozoítos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a isolar células mielóides de pele e linfonodo de drenagem de camundongos após imunização intradérmica com esporozoítos atenuados de Plasmodium. Este método permite analisar o recrutamento celular e a resposta inflamatória ao parasita.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores agradecem Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge para a leitura crítica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge ajuda para tirar fotos e Pauline Formaglio para o ensino em imagem in vivo da motilidade esporozoítos na pele do rato. Nós também gostaríamos de agradecer Marek Szatanik e do Centro de Produção e Infecção do Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para a criação do mosquito. Este estudo foi apoiado pelo Fundo AXA Pesquisa e fundos do Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Biologia Integrativa de Doenças Infecciosas Emergentes&quot; (conceder nenhuma. ANR-10-LabX-62-IBEID).

<html> Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê do Instituto Pasteur e pelo Comitê local de Ética em Experimentação Animal (Comitê de Ética IDF-Paris 1, Paris, França; número do contrato: 2012-0015) e realizado de acordo com as diretrizes e regulamentos aplicáveis. 1. Materiais e Reagentes <ol><li> Use feminino mosquitos Anopheles stephensi (estirpe Sda500) que se alimentam de ratos infectados 3-5 dias após a emergência e traseira, como descrito anteriormente 21. </li><li> Utilização parasitas Plasmodium berghei ANKA clone expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP) sob o controlo constitutivo do proteína de choque térmico 70 (HSP70) promotor. Isso produz fluorescência brilhante durante todo o ciclo de vida do parasita 22. </li><li> Use feminino camundongos C57BL / 6JRj (7 semanas de idade). Nota: Todos os reagentes usados ​​no protocolo descrito estão listados na T capazes de materiais / equipamentos. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radiation-atenuada Isolamento de esporozoítos de Mosquito glândulas salivares <ol><li> Entre 18-25 dias após a refeição de sangue infecciosa, recolher e frio anestesiar mosquitos em um tubo de 15 ml em gelo, como descrito anteriormente 21. transferi-las cuidadosamente sobre uma placa de Petri por inversão do tubo. Manter os insetos no gelo e expor os mosquitos a uma dose de 12 krad de irradiação x γ- ou. </li><li> Isolar atenuadas esporozoítos das glândulas salivares de mosquitos irradiados como previamente descrito 21. Recolhe glândulas salivares infectadas em um pequeno volume (cerca de 15 uL) de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) em gelo e suavemente esmagar-los a libertar os esporozoítos. NOTA: A injecção de uma suspensão de parasita altamente concentrada num pequeno volume de ser crítica, é, portanto, essencial para colher um número suficiente de glândulas salivares de um elevado número de mosquitos bem infectadas pré-seleccionados, como evidenciado pela sua expressão robusta deverde-fluorescência. </li><li> Filtra-se a suspensão dos esporozóitos através de um tampão filtro de células 35 um adaptado para uma adesão de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo de baixo, a fim de eliminar os aglomerados e os restos do mosquito. </li><li> Contar o número total de esporozóitos isolados como previamente descrito 21 e ajustar a concentração da suspensão de parasita com DPBS frio 1x obter esporozóitos 83.000 / uL. Armazenar os parasitas no gelo, continuando os próximos passos. </li><li> Recolhe-se o número equivalente de glândulas salivares de mosquitos infectados que serão utilizadas como controlo negativo e processam a amostra, tal como descrito nas etapas 2.2 e 2.3. Dilui-se a amostra, tal como indicado acima, para obter a concentração semelhante de extractos de glândula salivar na suspensão. NOTA: Os esporozoítos pode ser armazenado em gelo durante um máximo de 2 horas. No entanto, de preferência eles são injectados dentro de uma hora após o esmagamento, as glândulas salivares. </li></ol> 3. Injecção de esporozóitos no Dérmico Layer da Orelha <ol><li> Anestesiar os animais por injecção intraperitoneal de cetamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) mistura. Espere 5-8 min para o mouse para estar em um estado de inconsciência e aplicar pomada oftálmica para os olhos para evitar a secagem da córnea. Avaliar a profundidade da anestesia através da realização de um aperto do dedo do pé suave em ambos os pés traseiros. NOTA: A dose de anestesia dura menos de 20 minutos, de modo que os próximos passos deve ser feito rapidamente. </li><li> Estabilizar o pavilhão auricular do mouse fixando o lado ventral com fita adesiva transparente previamente colocado sob um microscópio estereoscópico (Figura 1A). Pressione suavemente o ouvido para evitar danos da vasculatura. </li><li> Coloque uma agulha chanfrada 10 ul seringa / 35 indicador com 0,6 l de parasitas novamente suspensas 10. </li><li> Entregar a suspensão dos esporozóitos em 4 locais de injecção (0,15 mL por local) através da inserção cuidadosamente a agulha no lado dorsal da orelha (Figura 1A), por baixo da epiderme, com ao bisel para cima, tendo o cuidado de evitar quaisquer vasos sanguíneos. Permitir que a agulha permanece na derme para poucos segundos para evitar o refluxo do injectant antes de o remover. Observar uma pápula característico em cada local de injecção no final do procedimento (Figura 1B e 1C). </li><li> Após a injecção, remover cuidadosamente o ouvido a partir da fita. </li><li> Injectar a orelha contralateral com a mesma dose de parasitas, seguindo a 3,2-3,4 passos. </li><li> Injectar duas ratinhos adicional, quer com 0,6 ul de 1x DPBS ou 0,6 ul de 1x DPBS + extracto de glândulas salivares de mosquitos infectados, a fim de avaliar a resposta inflamatória mediada pela injecção sozinho e a deposição de material de mosquito na derme. </li><li> Monitorar a recuperação do rato da anestesia antes de colocá-lo de volta na gaiola. NOTA: A deposição esporozoíto adequada na pele pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência (Figura 2A e 2B), Sendo o rato preparado como descrito previsously 23. </li></ol> 4. Pele e Dissection Drenagem Linfonodo <ol><li> Prepare meio padrão (SM) como se segue: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) + 25 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) suplementado com 400 U / ml de colagenase e 50 ug / ml de desoxiribonuclease (DNase) . </li><li> Prepare duas 6 placas de cultura de tecidos bem fundo plano no gelo com 4,5 ml SM + 70 coador mm de células por poço para amostras DLN (Placa A) e 4,5 ml SM per bem para amostras de pele (Placa B). </li><li> No ponto de tempo desejado após a inoculação do esporozoíto, anestesiar profundamente o rato através de injecção intraperitoneal de cetamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) mistura prévia deslocamento cervical. Verifique se o mouse demonstra sinais de morte clínica e começar a dissecção imediatamente. NOTA: A cinética do recrutamento de células mielóides podem ser examinados em diferentes momentos após injexão (isto é, 2 horas, 4 horas e 24 horas como anteriormente descrito 14). </li><li> Desinfectar a orelha inoculado e a região pescoço correspondente com etanol a 70% para reduzir a possibilidade de contaminação. </li><li> Com uma tesoura e uma pinça estéril, assepticamente dissecar o proximal DLN auricular sem recolher a gordura ao redor. Realizar uma primeira incisão no sulco jugulo-carotidian e remover os pêlos do campo operacional. Esticar a incisão com uma pinça 2 para expor o DLN que aparece acinzentada em comparação com o tecido circundante. </li><li> Comprima os tecidos conjuntivos cuidadosamente na parte superior do DLN com uma pinça para facilitar a sua remoção. Extrai-se a DLN colocando uma pinça debaixo do tecido linfóide (Figura 3A e 3B). Coloque o DLN em um poço contendo filtro de células 4,5 ml SM + 70 mm (Placa A). </li><li> Efectuar a totalidade da orelha inoculadas utilizando uma tesoura afiada e fórceps estéreis (Figura 4A). Separcomeu os aspectos dorsal e ventral da orelha por beliscar e espaçamento para além do corte termina com duas pinças (Figura 4B - 4E). Coloque-os em um poço contendo 4,5 ml SM (Placa B) certificando-se de ambos os tecidos são completamente imerso no meio. NOTA: De modo a melhorar a fiabilidade do experimento e aumentar o número de células de interesse, piscina 2 injectado orelhas ou 2 dLNs a partir do mesmo ratinho por amostra. </li><li> Colheita e processo em paralelo as orelhas e dLNs de camundongos inoculados com qualquer 1x DPBS ou extratos de glândulas salivares. Incluem 2 amostras adicionais de ouvido e nódulos linfáticos colhidos de um rato ingênuo para controles de compensação coloração negativa e individuais. </li></ol> 5. cela de isolamento a partir de gânglios linfáticos <ol><li> Incubar os gânglios linfáticos (placa A) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 15 minutos, sob agitação suave. Adicionar ácido etilenodiaminotetracético 10 mM final (EDTA) por poço para neutralizar colagenase e DNase actividades. Execute os próximos passos no gelo. </li><li> Dissociar nódulos linfáticos usando a extremidade de topo de um êmbolo de seringa de 5 ml. Imprensa em movimentos circulares contra a peneira até que tudo o que resta é tecidos conjuntivos brancos. </li><li> Lavar o filtro de células duas vezes com 500 ul de 1x DPBS + 2% de soro fetal de bovino (FBS) + EDTA a 2 mM. Transferir todo o volume do poço em um tubo de 15 ml. </li><li> Enxaguar o poço duas vezes com 500 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA e transferir o volume dentro do tubo de 15 ml. Mantenha os tubos em gelo. </li></ol> 6. cela de isolamento da pele da orelha <ol><li> Incubar os folhetos da orelha (Placa B) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 h sob agitação suave. NOTA: Após 20 min de incubação, cortar os folhetos de ouvido com uma tesoura em pedaços pequenos para facilitar a digestão do tecido e colocar a amostra de volta na incubadora para os restantes 40 min. As células individuais podem ser observadas no meio no final do tempo de incubação. </li><li> Adicionar final 10 mM<html> EDTA por cavidade para neutralizar as actividades de colagenase e DNAse. Execute os próximos passos no gelo. </li><li> Transferir os fragmentos de tecido da orelha e todo o volume do meio em um novo poço contendo um filtro celular de 70 um utilizando uma pipeta de 1 ml. Corte de 2 a 3 mm da extremidade da ponta para recolher os fragmentos de tecido da orelha mais facilmente. </li><li> Dissociar fragmentos de tecido do ouvido usando a extremidade de topo de um êmbolo de seringa de 5 ml. Imprensa em movimentos circulares contra a peneira até que tudo o que resta é tecidos conjuntivos brancos. </li><li> Lavar os filtros de células duas vezes com 500 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA. </li><li> Transferir todo o volume do poço para um tubo de 50 ml, através de um filtro celular de 70 uM. </li><li> Enxaguar o poço com 500 ul de 1x SBF DPBS + 2% + EDTA a 2 mM e transferir o volume dentro do tubo de 50 ml. Mantenha o tubo em gelo. NOTA: As diferentes etapas para isolar células totais a partir da pele e tecidos DLN estão resumidos na Figura 5. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Contagem e Viabilidade de células coletadas <ol><li> Centrifugar a pele e amostras DLN durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Suavemente ressuspender o sedimento com 300 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA. </li><li> Recolhe um pequeno volume de cada amostra para contar o número total de células isoladas a partir da pele e DLN utilizando um hemocitómetro. Adicionar 0,04% de azul de tripano para determinar a viabilidade celular. </li></ol> 8. Bloqueio de Non antígeno-específica Binding <ol><li> Adicionam-se 10 ug / ml de anticorpo não marcado de CD16 / CD32-Fc bloco. Incubar 20 min a 4 ° C (pode ir mais longe). </li><li> Adicionar 2 ml de 1x SBF frio DPBS + 2% + EDTA a 2 mM. Centrifugar a amostra durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Suavemente ressuspender o sedimento com 300 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA e manter as amostras em gelo. </li></ol> 9. manchar a pele e células Linfonodo Mielóides <ol><li> Incubar ski anteriormente bloqueadan e células com o Live / Dead rastreador (ou seja, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole ou DAPI), anticorpos específicos anti-CD45 e anti-CD11b DLN isolado. NOTAS: A fim de enriquecer as subpopulações de células mielóides de interesse, especialmente os mais raros, CD45 + células e linfócitos podem ser, respectivamente, purificada a partir da pele ou empobrecido do DLN por esférulas magnéticas separação de células facilitador. Uma vez que a maior parte das células isoladas a partir da DLN são CD45 +, o uso de anti-CD45 não é obrigatória. Outros marcadores podem ser incluídos para identificar subpopulações de células mielóides de interesse pela estratégia positiva ou negativa-gating. Neste protocolo, as células mielóides recrutados na DLN foram enriquecidos pela exclusão de células CD8a + (o compartimento de células T inteira pode ser alvo de usar anti-CD3 anticorpo específico). </li><li> Incubar 30 min a 4 ° C no escuro. Adicionar 500 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA, centrifugar a amostra de 5 min a 450 xg, a 4 ° C e desprezar o Supernatant. Repita o passo de lavagem duas vezes. </li><li> Ressuspender as amostras com 300 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA. Transferir todo o volume num tubo de FACS através de um filtro celular de 35 uM. Lavar o filtro com 100 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA. </li><li> Execute as células coradas em um citômetro de fluxo. Portão vivem células individuais (DAPI -, FSC-W) para excluir as células mortas e dobletes. Plot CD45 + CD11b + eventos para a pele (Figura 6A) e CD8a (CD45 +) - CD11b + eventos para o DLN (Figura 6B). </li></ol>

<ol><li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li>
<li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li>
<li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li>
<li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li>
<li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li>
<li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated%2C+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li>
<li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li>
<li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136(2014).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li>
<li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li>
<li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation%3A+clearance+after+immunization%2C+susceptibility+to+primaquine%2C+and+contribution+to+blood-stage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li>
<li>CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).</li>
<li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-node+resident+CD8%CE%B1%2B+dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637(2015).</li>
<li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li>
<li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li>
<li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536(2012).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li>
<li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li>
<li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li>
<li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li>
<li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation%3A+an+open-label+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li>
<li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li>
<li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Na perspectiva de vacinação em larga escala de seres humanos usando uma vacina de esporozoíto da malária conjunto, um dos principais desafios para superar é desenvolver vias e métodos de administração parasita optimizadas para assegurar uma imunização bem sucedida e protecção 24,25. Nos seres humanos, a avaliação da eficácia protectora mediada por parasitas vivos atenuados (LAP) foi realizada seguindo natural mosquito morde 2, bem como intradérmica, subcutânea e 25,26 IV imunizações <sup...

A malária é uma das mais mortais doenças infecciosas no mundo, matando mais de meio milhão de pessoas por ano. A infecção pelo Plasmodium, o agente causador da doença, começa por uma fase de pré-eritrocítico (PE). Durante esta fase, os esporozoitos injectados na pele hospedeiro por um mosquito fêmea Anofelíneos atingir o fígado através da corrente sanguínea e diferenciam hepatócitos no interior para as formas de parasitas que infectam as células vermelhas do sangue e causam os sintomas da doença. Os estágios PE de Plasmodium representar um alvo privilegiado para a vacinação anti-malária. Na verdade, vacinas vivas atenuadas contra essas etapas, tais como radiação atenuada esporozoítos (RAS), parasitas geneticamente presos (GAP) ou quimioprofilaxia e esporozoítos (CPS) demonstraram a sua capacidade para proteger tanto de roedores e hospedeiros humanos 1-9. No modelo de roedores, a maioria dos estudos de vacinação são conduzidas utilizando imunização intravenosa, Que é o padrão ouro em termos de eficácia protetora. No entanto, a descrição de uma etapa da pele e a importância do linfonodo de drenagem associada à pele (DLN) na indução de protecção mudou nossa percepção da fase de PE e enfatizou a importância da via intradérmica da injeção. Imagiologia intravital de P. esporozoítos berghei injectados na pele de roedores tem mostrado que apenas ~ 25% do inoculo atinge o fígado através da corrente sanguínea. Os restantes 75% ~ distribui entre o DLN proximal (~ 15%) e a pele (~ 50%) 10,11, onde uma pequena parte pode transformar e permanecer vivo por semana no interior das células da pele 12,13. Além disso, estudos subsequentes descrito que o estabelecimento de imunidade protetora eficaz após a imunização intradérmica ocorre principalmente na pele ed-Din, onde as células T CD8 + específicas do parasita são ativadas, e apenas marginalmente no baço ou fígado-dLNs 14,15. Enquantoa maioria dos estudos têm-se concentrado sobre a caracterização das células efectoras implicadas no estabelecimento da resposta imunitária protectora, muito menos se conhece sobre o destino de parasitas vivos atenuados injectados para dentro da pele, em especial as suas interacções com o sistema imune inato. Em particular, a caracterização das células apresentadoras de antigénios envolvidos na captação de antigénio parasita, processamento e apresentação a células T CD8 + é de importância crítica, sabendo que a aquisição antigénio PE pode ocorrer tanto na pele e compartimentos DLN. Estudos prévios de imagens intravital descrito um influxo precoce de células positivas brilhantemente fluorescentes Lys-GFP na pele após uma picada de mosquito infecciosa 16 enquanto primeiros interacções entre os esporozóitos e células dendríticas foram observados no DLN 10,17. Mais recentemente, foi relatado que os esporozoitos inoculados na pele por mosquitos aumenta a motilidade de ambas as células T reguladoras dendríticas e na pele deratinhos, enquanto que um número de diminuição de células apresentadoras de antigénio foi observada no DLN 18. Nós teve como objetivo identificar e quantificar mais precisamente os subconjuntos de leucócitos recrutados na pele e DLN correspondentes, bem como aqueles interagindo com o parasita após a injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS 19. Neste contexto, foram isoladas células mielóides (CD45 + CD11b +) de ambos os tecidos e caracterizada subpopulações de interesse pelo multi = fluxo paramétrico citometria. Consistente com a resposta imune descrito no estádio precoce de parasita Leishmania major infecção da pele 20, a resposta do hospedeiro primário de esporozoíto de injecção consiste de um recrutamento sucessiva de neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguido por monócitos inflamatórios (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +), que são identificadas com base na diferenciaramexpressão al dos marcadores de superfície Ly6G e Ly6C. Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mielóides a partir da pele do rato e DLN após injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS extraídos de glândulas salivares do mosquito infectados. injecções intradérmicas reprodutíveis e processamento de tecidos são passos fundamentais para quantificar alterações fenotípicas de infiltração população de células nos tecidos infectados. A abordagem detalhado abaixo proporciona um ensaio fiável para avaliar a resposta inflamatória da pele e para DLN parasita Plasmodium e pode ser alargado a vários sistemas experimentais.

<table><tbody><tr><td>Cetamina: Imalgene&reg; 1.000</td><td></td> <td>Merial-50</td> <td>mg/kg: injeção prévia de esporozoíto

125 mg/kg: sacrifício prévio</td></tr><tr><td>Xilazina: Rompun&reg; 2%</td><td>Bayer-5</td><td></td> <td>mg/kg: injeção prévia de esporozoíto

12,5 mg/kg: seringa NanoFil de sacrifício prévio</td></tr><tr><td>+ agulha de calibre 35</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Seringa de insulina Omnican&reg; 50 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medical&nbsp;</td><td>Placa</td> <td>de</td></tr> <tr><td>cultura de tecidos de 6 poços 9151125-MultiwellTM - ndash; Calcinha de fundo plano</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>353046-70</td></tr> <tr><td>e micro; Filtro de célula M&nbsp;</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>Seringa 352350-2</td><td></td></tr> <tr><td>ml</td><td>Terumo</td><td>SS-02S-BLUE</td><td></td></tr> <tr><td>MAXTM 15 ml Tubo cônico de polipropileno</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352097-BLUE</td></tr> <tr><td>MAXTM 50 ml Tubo cônico de polipropileno</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>Tubo</td><td></td></tr> <tr><td>de Fundo Redondo de Poliestireno de 352098-5 ml com 35 &micro; m Tampa de Filtro</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352235-DPBS</tr> <tr><td>1x CaCl2- e MgCl2--free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021-Colagenase</td><td></td></tr> <tr><td>de Clostridium histolyticum, Tipo IV 0.5-5.0 FALGPA unidades/mg sólido&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino, tipo IV;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de sal dissódico EDTA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM ou 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500-HEPES</td><td></td></tr> <tr><td>solução tampão (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Diluição 1:10&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-camundongo CD16 / CD32 (clone 2.4G2)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &micro; g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPureTM grau</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &micro; g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&nbsp; Diluição 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&nbsp; Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&alpha; (Clone 5H10)</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>MCD0830</td><td>&nbsp; Diluição 1:100</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6JRj fêmeas (7 semanas de idade)&nbsp;</td><td>Laboratórios Janvier</td> <td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células mielóides de rato pele e drenagem linfonodo seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; plasmodium</em&gt; esporozoítos

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Infecção da malária começa quando a fase de esporozoíto do Plasmodium é inoculada na pele de um mamífero hospedeiro através de uma picada de mosquito. O parasita altamente móveis não só atinge o fígado para invadir hepatócitos e se transformar em forma de eritrócitos-infeccioso. É também migra para a pele e para o nó de linfa de drenagem proximal do local de injecção, onde pode ser reconhecido e degradado por residente e / ou células mielóides recrutados. Imagens intravital informou o recrutamento precoce de leucócitos positivos brilhantemente fluorescente Lys-GFP na pele e as interações entre os esporozoítos e CD11c + células do linfonodo de drenagem. Nós apresentamos aqui um procedimento eficiente para recuperar, identificar e enumerar as subpopulações de células mielóides que são recrutados para a pele do rato e drenagem dos linfonodos após a injecção intradérmica de doses imunizantes de esporozoítos num modelo murino. Caracterização fenotípica utilizando fluxo multi-paramétrico fornece citometriaum ensaio fiável para avaliar alterações precoces celulares dinâmicas durante a resposta inflamatória à infecção por Plasmodium.

Recentemente, demonstramos que a injeção de agulha de seringa de imunizantes doses de P. berghei esporozoítos na pele do rato induz uma contratação sucessiva de neutrófilos seguidos pelos monócitos inflamatórias na pele e DLN 19. A Secção protocolo descrito acima detalha o procedimento utilizado para isolar com sucesso células mielóides ao vivo de ambos os tecidos após injecções múltiplas de grande número de esporozoítos na derme da orelha (Figuras 1 ...

Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mieloides da pele de camundongos e drenar linfonodos após injeção intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. A citometria de fluxo das células coletadas fornece um ensaio confiável para caracterizar a resposta inflamatória da pele e dos linfonodos de drenagem ao parasita.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

O objetivo geral deste conjunto de procedimentos é imunizar camundongos com parasitas de plasmodium atenuados por radiação, a fim de facilitar a análise do recrutamento de células mieloides na pele do camundongo e nos linfonodos drenantes. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da malária, como quais são os atores celulares envolvidos na resposta imune inata a parasitas vivos atenuados.Entre 18 e 25 dias após a refeição sanguínea infectante, colete e anestesie em frio os mosquitos infectados em um tubo de 15 mililitros sobre gelo. Em seguida, inverta cuidadosamente o tubo sobre uma placa de Petri mantida em gelo e exponha os insetos a uma dose de 12 quilorads de irradiação gama ou raios X. Colete as glândulas salivares dos mosquitos irradiados em 15 microlitros de DPBS sobre gelo.Em seguida, esmague suavemente as glândulas para liberar os esporozoítos. A injeção de uma suspensão altamente concentrada de parasitas em um pequeno volume é essencial, portanto, é importante colher um número suficiente de glândulas salivares de mosquitos bem infectados, conforme indicado pela expressão robusta de fluorescência verde. Re-suspenda a suspensão de parasitas antes

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar a migração de células dendríticas após infecção da pata com Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG em camundongos. Após a infecção bacteriana, as células DC da pele ativadas são marcadas com um corante de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína permeável a células (CFSE). Após um intervalo adequado para a migração da DC para o linfonodo de drenagem poplítea, as células do linfonodo são isoladas e submetidas à...

Um ensaio baseado em CFSE para monitorar a migração de células dendríticas da pele para linfonodos de drenagem em camundongos infectados

Este vídeo demonstra um ensaio para imunizar um modelo de camundongo com esporozoítos vivos atenuados. Os esporozoítos de Plasmodium atenuados por radiação são injetados no lado dorsal da orelha do camundongo. Após injeções em vários locais em ambas as orelhas, o camundongo pode se recuperar.

Imunização intradérmica com esporozoítos vivos atenuados em modelo de camundongo

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

A pele abriga uma complexa rede de células imunológicas. Descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos, de diferentes partes do corpo do animal, a fim de obter uma suspensão unicelular e analisar as diferentes populações de leucócitos residentes na pele por citometria de fluxo.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Este protocolo descreve a digestão enzimática da pele de camundongo em meio rico em nutrientes, seguida de separação gradiente para isolar leucócitos.  As células assim derivadas podem ser usadas para diversas aplicações a jusante. Esta é uma alternativa eficaz, econômica e aprimorada às máquinas de dissociação de tecidos e aos protocolos de digestão de tecidos mais severos baseados em tripsina e dispase.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Um ensaio em camundongos para rastrear a migração celular da pele para o linfonodo de drenagem é descrito, o que permite a caracterização das células dendríticas da pele mobilizadas para o linfonodo após infecção do pata com Bacilo Calmette-Guérin.

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a isolar células mielóides de pele e linfonodo de drenagem de camundongos após imunização intradérmica com esporozoítos atenuados de Plasmodium. Este método permite analisar o recrutamento celular e a resposta inflamatória ao parasita.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados Plasmodium Esporozoítos (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados

Explorar mais vídeos