Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados Plasmodium Esporozoítos

O objetivo geral deste conjunto de procedimentos é imunizar camundongos com parasitas plasmodium atenuados por radiação. Para facilitar a análise do recrutamento de células mieloides na pele do camundongo e drenando os gânglios linfáticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da malária, como quais são os atores celulares envolvidos na resposta imunológica inata a parasitas vivos atenuados.

Entre 18-25 dias após a refeição de sangue infecções, colete e anestesie a frio os mosquitos infectados em um tubo de 15 mililitros no gelo. Em seguida, inverta cuidadosamente o tubo em uma placa de Petri no gelo e exponha os insetos a uma dose de 12 kilorad de irradiação gama ou X. Colete as glândulas salivares do mosquito irradiadas em 15 microlitros de DPBS no gelo.

E então, esmague suavemente as glândulas para liberar os esporozoítos. A injeção de uma suspensão de parasita altamente concentrada em um pequeno volume é crítica, por isso é importante colher um número suficiente de glândulas salivares de mosquitos bem infectados, conforme evidenciado pela expressão robusta de fluorescência verde. Ressuspenda a suspensão do parasita antes da filtração através de um filtro de 35 micrômetros adaptado a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Usando uma câmara de contagem de microscópio, conte o número total de esporozoítos isolados e ajuste a suspensão do parasita para uma concentração de 8,3 vezes dez elevado ao quarto esporozoítos por microlitro em DPBS frio no gelo. Antes de injetar os esporozoítos, confirme o nível adequado de sedação do animal experimental beliscando o dedo do pé e aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento da córnea. Em seguida, trabalhando rapidamente, use fita adesiva transparente para fixar suavemente o lado ventral do pavilhão auricular sob um microscópio estéreo e carregue uma seringa de dez microlitros, equipada com uma agulha de calibre 35, com 0,6 microlitros de parasitas ressuspensos.

Em seguida, insira cuidadosamente a agulha, com o lado chanfrado para cima, abaixo da epiderme no lado dorsal da orelha e injete 0,15 microlitros de esporozoítos no local. Uma pápula característica será observada no local da injeção. Depois de injetar a derme mais três vezes, como acabamos de demonstrar, remova cuidadosamente a fita e monitore o mouse até que esteja totalmente recuperado.

No momento desejado após a inoculação do esporozoíto, sacrifique o camundongo e inicie o procedimento imediatamente. Certifique-se de que o camundongo demonstre sinais de morte clínica. Desinfete o ouvido e a região do pescoço correspondente com etanol a 70%.

Em seguida, usando tesouras e pinças estéreis, faça uma incisão na área jugulo-carotídica. Em seguida, estique a incisão com duas pinças para expor o linfonodo drenante de aparência cinza. Aperte e remova cuidadosamente o tecido conjuntivo diretamente acima do linfonodo e extraia-o com um segundo par de pinças, colocado embaixo dele.

Transfira o linfonodo para um filtro de 70 mícrons em um poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços, contendo 4,5 mililitros de meio padrão, suplementado com colagenase e DNase. Em seguida, colha toda a espiga inoculada e use duas pinças para beliscar e separar a espiga nos aspectos dorsal e ventral. Em seguida, coloque cada lado da orelha em um poço de uma segunda placa de seis poços, contendo 4,5 mililitros por poço de meio suplementado com enzimas digestivas, cuidando para que cada tecido fique completamente imerso no meio.

Para isolar as células imunes dos gânglios linfáticos, incube a placa de tecido linfóide a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2 sob agitação suave. Após 15 minutos, adicione dez EDTA milimolares a cada poço e coloque a placa no gelo. Em seguida, para cada linfonodo, use a extremidade de um novo êmbolo de seringa de cinco milímetros e pressione o linfonodo contra o filtro usando movimentos circulares para dissociar o tecido.

Quando restar apenas tecido conjuntivo branco, enxágue o filtro duas vezes com 500 microlitros de DPBS contendo FBS e EDTA e transfira a lavagem para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, lave o poço mais duas vezes com 500 microlitros do DPBS suplementado e transfira a lavagem para o tubo colocado no gelo. Para isolar as células imunológicas do ouvido, incube os folhetos auriculares a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2 com agitação suave.

Após 20 minutos, corte os tecidos em pedaços menores para facilitar sua digestão e devolva as amostras à incubadora. Após 40 minutos, pare a digestão com dez milimolares de EDTA e coloque o prato no gelo. Usando uma pipeta de um mililitro com uma ponta cortada, transfira todo o conteúdo de cada poço para novos poços contendo filtros de 70 mícrons.

E use um êmbolo de seringa de cinco mililitros para dissociar os fragmentos de tecido da orelha com movimentos circulares, como acabamos de demonstrar. Quando restarem apenas tecido conjuntivo branco e cabelo, lave os filtros e poços com DPBS mais FBS e EDTA como acabamos de demonstrar, agrupando as lavagens em um tubo de 50 mililitros no gelo. Por fim, lave o poço duas vezes com DPBS suplementado e transfira a lavagem para o tubo colocado no gelo.

Neste vídeo, pode-se ver a migração de esporozoítos atenuados por radiação para a pele do camundongo 15 minutos após a injeção intradérmica dos parasitas. 24 horas após a injeção intradérmica de esporozoítos, as células totais são isoladas da pele e do linfonodo drenante. Conforme observado nesta figura, a frequência de células mielóides na pele e no linfonodo de drenagem é robustamente aumentada em comparação com camundongos virgens.

Uma vez dominado, os primeiros passos do protocolo de irradiação de mosquitos para injeção de esporozoítos podem ser concluídos em quatro horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os esporozoítos isolados das glândulas salivares do mosquito perdem rapidamente sua infectividade. Portanto, eles devem ser injetados o mais rápido possível.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células mieloides da pele do camundongo e do linfonodo de drenagem para explorar a resposta imunológica à injeção intradérmica de parasitas plasmodium vivos atenuados.