Name: Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento Xenopus Kidney (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda microinjeção direcionada em blastômeros para estudar o desenvolvimento renal em Xenopus laevis. Esta técnica maximiza a entrega de reagentes e ajuda a elucidar genes importantes na formação do rim.

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Este trabalho foi apoiado por uma National Institutes of Health subvenção NIDDK (K01DK092320) e financiamento de arranque do Departamento de Pediatria da Universidade do Texas McGovern Medical School.

O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas Health Science Center em Center em Houston para o Comitê de Animais de Laboratório de Medicina Animal Welfare, que serve como o Cuidado Institucional e Use Committee (protocolo nº: HSC-AWC-13-135). 1. Identificação e Seleção de Blastômeros para injectáveis ​​alvo de rim <ol><li> Antes de gerar embriões, o uso de mesa normal de Xenopus 21 Desenvolvimento de compreender a orientação das divisões celulares precoces no embrião. Alternativamente, diagramas de acesso dos primeiros estágios de desenvolvimento de Xenopus em Xenbase 11. </li><li> Acessar os mapas destino celular interativos Xenopus sobre Xenbase 11 para selecionar quais blastomere vai ser alvo de microinjeção. </li><li> Observe que o embrião unicelular tem um pólo animais mais pigmentadas e um pólo vegetal, que é branco e yolky. Note-se que uma membrana de protecção, conhecido como o vitelina envelope, abrange o embrião. </li><li> Note-se que a primeira clivagem ocorre normalmente entre os lados esquerdo e direito do embrião. Estas células contribuem igualmente para a linhagem pronephric. </li><li> Note-se que a segunda clivagem divide dorsal e ventral metades do embrião, levando a um embrião de quatro células. As células dorsais são mais pequenos e têm menos pigmento do que as células ventrais (Figura 2A e a Figura 3A). <ol><li> Identificar os blastômeros ventral (V; as células grandes, escuros) nas laterais esquerda e direita, que contribuem mais para o rim em desenvolvimento do que o dorsal (D; células pequenas e leves) blastômeros (Figura 2A). </li><li> Se a injeção em um embrião de 4 células, injetar o blastomere ventral esquerdo para atingir o rim esquerdo (Figura 3A e Seção 3). </li></ol></li><li> A terceira clivagem bissecta os lados do animal e vegetal, resultando em um embrião de oito células. Neste ponto, há quatro blastômeros animais [esquerda e direita ventral(V1) e dorsal (D1)] e quatro blastómeros vegetais [ventral esquerda e direita (V2) e dorsal (D2)] (Figura 2B e Figura 3B). <ol><li> Localize os blastômeros, vegetais ventral (V2). Estes blastómeros contribuir mais para o rim desenvolvimento de quaisquer outras células nesta fase (Figura 2B). Para atingir o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injetar no blastomere deixou V2 (Figura 3B e Seção 3). </li></ol></li><li> Observe que os quarto e quinto clivagens bissetriz os blastômeros animais e vegetais. Dois descendentes são geradas a partir de cada um blastómero, resultando em um embrião de 16 células. As células são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o V2 blastï¿½ero a partir da fase de 8 células dá origem a progénie V2.1 e V2.2 na etapa de 16 células (Figura 2C). A célula V2.2 no estágio de 16 células fornece a maior parte das células que contribuem para o desenvolvimento renal. </li><li> Observe os sexto e sétimo clivagens resultar em uma Embry 32 célulaso. Mais uma vez, dois descendentes são gerados a partir de cada blastomere, que são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o blastï¿½ero V2.2 a partir do estágio de 16 células dá origem a V2.2.1 e V2.2.2 na fase de 32 células. Existe um sistema de nomenclatura alternativa na fase de 32 células em que as células são identificados em quatro linhas como A, B, C, e D (de animal para vegetal), e em quatro colunas como 1, 2, 3, e 4 ( de dorsal para ventral). Assim, o blastomere V2.2.2, o que mais contribui para as pronephros em desenvolvimento, é chamado C3 sob este sistema de nomeação alternativo (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparação de Embriões <ol><li> Preparar 50 ml de Solução Dejelly (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0). </li><li> Isolar ambos os testículos de um único rã macho de acordo com protocolos padrão 14. Colocar os testículos em um prato de 60 milímetros de Petri cheio com 10 ml de solução de armazenamento Testículos (1x Marc modificação de Ringer [MMR; 0,1 M de NaCl, KCl 2 mM, MgSO 4 1 mM, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES, pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albumina de soro bovino, 50 ug / ml de gentamicina). Armazenar os testículos a 4 ° C. Nota: Testículos pode ser armazenado por cerca de 7-10 dias a 4 ° C, mas a eficiência de fertilização irá diminuir o tempo os testículos foram armazenados. </li><li> Espremer um sapo fêmea para obter ovos de acordo com protocolos padrão 14. Recolher os ovos em um 100 milímetros placa de Petri. Deitar fora qualquer excesso de água. </li><li> Cortado ¼ de um testículo enquanto ele está em Testes solução de armazenamento usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Transferir o pedaço de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Ajustar o tamanho da porção de testículo usado para contabilizar o tamanho do testículo, quanto tempo o testículo foi armazenado, e quantos os ovos devem ser fertilizado. Geralmente usam ¼ a 1/3 de um testículo recém-dissecados para fertilizar uma ninhada de ovos. </li><li> Corte a parte de testículo em pedaços pequenos usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Adicionar o suficiente MMR 0,3x+ 30 mg / ml de gentamicina para a placa de Petri para cobrir os ovos. Agitar o MMR no prato para misturar. </li><li> Aguarde cerca de 30 min para a fertilização ocorra à temperatura ambiente. Note-se que o hemisfério animais (pigmentado do lado do embrião) ficará por cima do embrião sobre a fertilização eficaz. Em seguida, retire a MMR a partir da placa de Petri com uma pipeta de transferência. Adicionar solução Dejelly suficiente para o prato para cobrir os embriões. </li><li> Ao longo dos próximos minutos, rode suavemente o prato de forma intermitente. A agitação vigorosa do prato neste momento pode causar defeitos de eixo. &#160; O casaco de geléia sobre os embriões se dissolverá, e os embriões se reúnem no centro do prato durante a roda. Uma vez que os embriões são intimamente tocar uns aos outros no centro do prato, remover a solução Dejelly com uma pipeta de transferência. Não deixe embriões na solução Dejelly por mais de 5 minutos, ou os embriões podem ser danificados. </li><li> Lavar os embriões dejellied 3 - 5 vezes em 0,3XMMR + 30 mg / ml de gentamicina com cuidado derramamento ou pipetagem fora da MMR e enchendo o prato com nova MMR. Não remova todo o MMR do prato, ou os embriões podem ser danificados. </li><li> Remova todos os ovos não fertilizados ou pedaços de testículo da placa de Petri com uma pipeta de transferência. </li><li> Incubar embriões entre 14 e 22 ° C. Nota: Os embriões cultivados a temperaturas mais baixas desenvolver mais lentamente do que os embriões cultivados a temperaturas mais elevadas. O sincronismo de fases de desenvolvimento pode ser encontrado no Xenbase 22. <ol><li> Para espaço para o seu desenvolvimento, lugar de metade dos embriões a partir de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 ° C, e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 ° C. Isto permite que dois conjuntos de injecções em embriões de 4-celulares ou células-8 a partir de um único fertilização. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de soluções de injecção e microinjecção de embriões <ol><li> Prepare a solução para injecção contendo 0,01ng / nl de proteína ligada à membrana fluorescente vermelha (RFP-MEM) ARNm de 9, enquanto que os embriões estão em desenvolvimento para o estágio de 4 células ou de 8 células. Armazenar a solução injectável em gelo até estar pronto para injetar. </li><li> Carregar um &quot;tubo capilar de vidro de substituição em um extrator de agulhas, com a parte superior do tubo de substituição alinhado com a parte superior da caixa de agulha extrator. Defina o valor de calor # 2 a 800, eo valor de puxar para 650. Pressione o botão&quot; 7 puxe &quot;botão para retirar a agulha. Isto irá criar 2 agulhas de um único 7&quot; tubo capilar de vidro. </li><li> Cortando a ponta de uma agulha puxado com um par de fórceps Dumont. Nota: Depois de puxar a agulha, a dica é selada e deve ser cortado. Quanto mais próximo da ponta da agulha que é cortada, quanto menor for o diâmetro da ponta da agulha será. Embora o diâmetro da ponta não afectará o volume de injecção com o sistema de microinjecção utilizado aqui, uma ponta com um diâmetro maior é mais susceptível de danificar o embrião. </li><li> Deslize o mCollet icropipette na parte de trás da agulha. Em seguida, deslizar o orifício grande junta tórica para a parte de trás da agulha atrás da pinça. </li><li> Encha a agulha com óleo mineral utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 27, com cuidado para não obter bolhas de ar na agulha. </li><li> Deslizamento da agulha para o êmbolo da microinjetor, assentando a agulha no orifício grande do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. O êmbolo deve ter um pequeno anel de vedação mais próxima do corpo do microinjetor, seguido pelo espaçador branco, grande furo O-ring, e Collet. Fixe a agulha pelo aperto da pinça. Puxe suavemente a agulha para se certificar de que está devidamente protegidas. </li><li> Pressione e segure o botão &quot;vazio&quot; na caixa de controle microinjetor até há dois sinais sonoros. </li><li> Pipeta 3 uL de solução de injecção sobre um pedaço de Parafilm. Inserir a ponta da agulha para o talão da solução de injecção sobre o Parafilm. Pressione e segure o botão &quot;preencher&quot; no microinjector caixa de controlo para extrair a solução de injecção para dentro da agulha. </li><li> Encher um prato de 60 milímetros de Petri revestidas com 500 micra de malha de poliéster com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Cuidadosamente Pipetar 20 - 30 4-celulares ou células de embriões de 8 no prato. </li><li> Utilizando uma ansa de cabelo 14, manipular os embriões de modo que a blastómero para ser injectado está de frente para a agulha. Para atingir o rim esquerdo, alinhar os embriões de modo que os blastómeros ventral esquerdo de embriões 4-celulares ou as restantes blastómeros V2 de embriões de 8 células enfrentam a agulha. </li><li> Injectar 10 nl de uma solução de injecção no blastï¿½ero seleccionado de cada embrião no prato. Nota: A malha na parte inferior da placa de Petri estabiliza os embriões e os impede de laminagem, permitindo-lhes ser injectado, sem a utilização de um circuito de cabelo para a estabilização. </li><li> Transferência de embriões injectados nos poços de uma placa de cultura que foram preenchidos com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar a embriões injectadoss a 16 ° C durante pelo menos uma hora para permitir que os blastómeros injectados para curar. </li><li> Transferir os embriões curadas em poços de uma nova placa de cultura que tenham sido cheios com 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por etapa 9 (antes da gastrulação). </li><li> Incubar os embriões a 14-22 ° C, até atingir os embriões fase 38-40 21. </li></ol> 4. Fixação e imunocoloração de Embriões <ol><li> Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnésio / Formaldeído buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldeído]. </li><li> Usando uma pipeta de transferência, colocado de 10 - 20 etapa 38 - 40 embriões num frasco de vidro. Adicionar 10 ul de 5% de benzocaína em etanol a 100% para o frasco e do frasco invertido para misturar. Aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões. </li><li> Remover o MMR do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Se o processamento de vários frascos ao mesmo tempo, os frascos podem ser mantidos na posição vertical em uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Com um tubo de vidroTTE, encher o frasco com MEMFA. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Remover o MEMFA do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Encha o frasco com 100% de metanol. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 10 min à temperatura ambiente. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez, e armazenar os embriões em 100% de metanol durante a noite a -20 ° C. </li><li> Prepare 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato-Albumina de Soro Bovino Triton-(PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Preparar a solução de anticorpo primário: 1x PBT com soro de cabra a 10%, com uma diluição 1: 5 do anticorpo monoclonal de ratinho 4A6 anticorpo (para etiquetar as membranas do intermediário, distais e túbulos de ligação 20), uma diluição de anticorpo monoclonal de ratinho 3G8 01:30 (a etiqueta lúmen dos túbulos proximais 20) e uma diluição 1: 250 de anticorpo policlonal de coelho RFP (para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare o secondaA solução de anticorpo RY: 1x PBT com soro de cabra a 10%, 1: 500 Alexa IgG 488 de cabra anti-ratinho (concentração de caldo de 2 mg / ml; a etiqueta 4A6 e 3G8), e 1: anti-IgG de coelho 500 Alexa 555 cabra (estoque concentração de 2 mg / ml; para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C, cobrindo o tubo em folha para proteger da luz. </li><li> Em alternativa, recolher os anticorpos primário e secundário, após coloração, e guardar a 4 ° C para reutilização em experiências futuras. Se o anticorpo é para ser salvo para reutilização, adicionar 0,01% de azida de sódio. </li><li> Imunocoloração os embriões utilizando protocolos estabelecidos 18. </li></ol> 5. Visualização de Embriões e Análise de Targeted Tissue Pronephric <ol><li> Peneirar os embriões imunocoradas para verificar que o blastï¿½ero correcto foi injectado através da visualização da fluorescência do marcador fluorescente sob um estereomicroscópio em 1X (para visualizar embrião inteiro) e 5X (para ler rim) de ampliação. embriões lugar em uma placa de vidro multi-bem com o quells cheios com 1x PBT utilizando uma pipeta de transferência com a ponta cortada. Manipular os embriões com um laço de cabelo. Utilizar apenas os embriões que possuem o marcador co-injectado presente nas pronephros no lado esquerdo do embrião (figura 3C, F e Figura 4C, F) para a sobre-expressão do gene ou análise knockdown. </li><li> Alternativamente, limpar os embriões no de Murray claro (2 partes de benzoato de benzilo: uma parte do álcool benzílico), colocando os embriões num frasco de vidro e enchimento do frasco com Murray claro. Visualize os embriões utilizando uma placa de vidro. Nota: Murray Clear é um solvente orgânico, e devem ser manuseados com cuidado. Usar luvas, e só usar frascos de vidro e pipetas com Murray Clear. </li><li> embriões armazenar a 4 ° C em 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo de embriões, os embriões desidratar por lavagem duas vezes em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min. Armazenar os embriões a -20 ° C em metanol a 100%. </li></ol>

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<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
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<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
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<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda 18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sobre-expressão...

O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros 1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese 2, 3. Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) 1, 4-6 (Figura 1 </strong&gt;). A única, grande nefrónio presente nas pronephros Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença. Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase 7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis ​​histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha 12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blastï¿½ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados ​​para calcular o índice pronephric 13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise. Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele 14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 - 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido. A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido 15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável 16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 - 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus 18-20.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gentamicina, 50 mg / ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína, 99% +</td> <td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm x 15 mm</td><td>Mini</td><td></td> Frigorífico Fisher FB0875712 <td></td></tr><tr><td>II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Incubadora de bancada para embriões.</td></tr><tr>Plasmídeo <td></td><td></td><td>Gap43-RFP</td><td>Para fazer RNA traçador. Referência: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Rodamina dextrana, 10.000 M.W.</td><td>Rastreador Invitrogen</td><td>D1817</td><td>.</td></tr><tr><td>Grau de biologia molecular, água purificada estéril</td><td>USP Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7" Tubos de substituição Drummond Agulhas</td> de <td>microinjeção</td> <td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td>.</tr><tr><td>Extrator</td> de <td>agulhas Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Para quebrar a ponta da agulha de microinjeção.</td></tr><tr><td>Microinjetor Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>.</td></tr><tr><td>Óleo mineral, pesado</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Óleo para agulhas.</td></tr><tr><td>27 G Agulha hipodérmica Monoject</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>Para carregar óleo mineral na agulha de microinjeção.</td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lok de 5 ml</td><td>BD</td><td>309646</td><td>Para carregar óleo mineral na agulha de microinjeção.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 mícrons Malha de poliéster</td> Peças <td>pequenas</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Para transferência de embriões. Corte a ponta para que os embriões sejam facilmente absorvidos pela pipeta.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Frasco com rosca Fisher</td><td></td><td>03-339-25B</td><td>Para fixar, colorir e armazenar embriões.</td></tr><tr><td>Placa de cultura celular de 24 poços</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x pó</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini balancim, modelo 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra, origem neozelandesa</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal 3G8</td><td>Centro Europeu de Recursos</td><td></td> Xenopus <td>Anticorpo primário para marcar proximal Túbulos.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal 4A6</td><td>European Xenopus Resource Center</td><td></td><td>Anticorpo primário para marcar túbulos intermediários, distais e de conexão.</td></tr><tr><td>pAb anti-RFP, IgG/coelho purificado</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Anticorpo primário para marcar o traçador Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Anticorpo secundário para marcar túbulos renais.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 cabra anti-coelho IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Anticorpo secundário para rotular o rastreador Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>9 Placa de ponto de cavidade</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato de benzila</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Opcional - para limpeza de embriões</td></tr><tr><td>Álcool benzílico</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Opcional - para limpeza de embriões</td></tr></tbody></table>

técnica ao target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; xenopus</em&gt; kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blastï¿½ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.

Microinjeções de 4 e 8 células de embriões de Xenopus com MEM-RFP mRNA mostram diferentes níveis de segmentação para os pronephros. A Figura 4 mostra estágio 40 embriões com MEM-RFP padrões de expressão de mRNA corretas. Os embriões foram injectados na blastï¿½ero ventral esquerdo (Figura 4A), e classificadas para o padrão de expressão adequada de ARNm de MEM-RFP. Além de expressar MEM-RFP no sentido proximal, intermédio e distai ligar túbulos d...

Aqui, apresentamos um protocolo para usar mapas de destino e traçadores de linhagem para direcionar injeções em blastômeros individuais que dão origem ao rim de embriões de Xenopus laevis.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

O objetivo geral deste procedimento é direcionar microinjeções ao rim em desenvolvimento de Xenopus. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como a forma como o rim se forma e quais genes são importantes para esse processo. A principal vantagem desta técnica é que ela maximiza a entrega de reagentes microinjetados a um tecido-alvo.A visualização deste método é importante porque a identificação do blastômero correto para microinjeção direcionada é fundamental. Para iniciar este procedimento, ambos os testículos foram isolados de um único sapo macho e colocados em uma placa de petri de 60 milímetros contendo 10 mililitros de solução de armazenamento de testículos. Em seguida, armazene os testículos a quatro graus Celsius.Em seguida, os ovos foram coletados de uma rã fêmea em uma placa de Petri de 100 milímetros. Derrame a água em excesso da placa de Petri. Depois disso, corte um quarto de um testículo em Solução de Armazenamento de Testículos.Transfira o fragmento de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Em seguida, corte a porção do testículo em pequenos pedaços. Adicione MMR com Gentamicina à placa de Petri até cobrir os ovos.Misture-os girando o recipiente e aguarde aproximadamente 30 minutos para que a fertilização ocorra à temperatura ambiente. Após a fertilização, o lado pigmentado dos embriões deve estar voltado para cima. Remova o MMR do recipiente de Petri utilizando uma pipeta de transferência e adicione solução desgelificante suficiente para cobrir os embriões.Em seguida, agite suavemente o recipiente durante os próximos minutos para dissolver a camada de gelatina nos embriões. Quando os embriões estiverem em contato próximo uns com os outros no centro do recipiente, a camada de gelatina terá sido removida. Remova a solução de dessurgimento com uma pipeta de transferência.Em seguida, lave os embriões desenjoados de 3 a 5 vezes em MMR acrescido de Gentamicina, derramando cuidadosamente o MMR e reenchendo o recipiente com MMR novo. Não remova todo o MMR do recipiente, pois isso pode danificar os embriões. Depois disso, remova os óvulos não fertilizados ou fragmentos de testículo do recipiente de plástico.Para escalonar seu desenvolvimento, coloque metade dos embriões de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 graus Celsius e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 graus Celsius. Os embriões se desenvolverão mais lentamente a 14 graus Celsius do que a 18 graus Celsius, permitindo múltiplos conjuntos de injeções a partir de um único lote fertilizado.Prepare a solução de injeção contendo zero vírgula zero um nanograma por nanolitro de mRNA da Proteína Fluorescente Vermelha ligada à membrana. Enquanto os embriões estão se desenvolvendo até o estágio de 4 ou 8 células. Mantenha a solução de injeção sobre gelo até o uso.Em seguida, carregue um tubo capilar de vidro de reposição de sete polegadas em um puxador de agulhas, alinhando a extremidade superior do tubo de reposição com a extremidade superior do invólucro do puxador de agulhas. Ajuste o valor de calor dois para 800 e o valor de tração para 650 e pressione o botão de tração para puxar a agulha. Depois disso, corte a ponta da agulha puxada com uma pinça Dumont.Encaixe o contra-pino da micropipeta na parte traseira da agulha. Em seguida, encaixe a junta de vedação de furo grande na parte traseira da agulha, atrás do contra-pino. Agora, encha a agulha com óleo mineral usando uma agulha hipodérmica de calibre 27, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na agulha.Insira a agulha no êmbolo do microinjetor, encaixando-a no orifício maior do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. Fixe a agulha apertando o mandril. Em seguida, pressione e mantenha pressionado o botão "Esvaziar" na caixa de controle do microinjetor até que soem dois bips.Em seguida, pipete três microlitros da solução de injeção sobre um pedaço de parafina. Então, insira a ponta da agulha na gota da solução de injeção sobre a parafina. Pressione e mantenha pressionado o botão "Fill" na caixa de controle do microinjetor para aspirar a solução de injeção para dentro da agulha.Antes da microinjeção, é importante compreender as primeiras divisões celulares do embrião de Xenopus. O embrião unicelular possui um polo animal fortemente pigmentado e um polo vegetal branco e rico em vitelo. No embrião de dois células, a primeira clivagem geralmente ocorre entre os lados esquerdo e direito do embrião.Essas células contribuem igualmente para a linhagem pronefrica. A segunda clivagem divide as metades dorsal e ventral do embrião, resultando em um embrião de 4 células. As células dorsais são menores e possuem menos pigmento do que as células ventrais.Se a injeção for realizada em um embrião de 4 células, injete no blastômero ventral esquerdo para direcionar ao rim esquerdo. A terceira clivagem divide os lados animal e vegetal, resultando em um embrião de 8 células.Neste momento, existem quatro blastômeros animais e quatro blastômeros vegetais. Para direcionar o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injete no blastômero vegetal ventral esquerdo. Posteriormente, preencha uma placa de petri de 60 milímetros forrada com malha de poliéster de 500 mícrons com ficol a cinco por cento em MMR acrescido de gentamicina.Pipete cuidadosamente de 20 a 30 embriões de 8 células para dentro da placa. Usando um laço de cabelo, posicione os embriões de modo que o blastômero a ser injetado fique voltado para a agulha. Para direcionar ao rim esquerdo, alinhe os embriões de forma que os blastômeros vegetais ventrais esquerdos dos embriões de 8 células fiquem voltados para a agulha.Injete 10 nanolitros da solução de injeção no blastômero selecionado de cada embrião na placa. Em seguida, transfira os embriões injetados para os poços de uma placa de cultura com cinco por cento de fycol em MMR acrescido de Gentamicina. Incube os embriões injetados a 16 graus Celsius por aproximadamente uma a duas horas para permitir a cicatrização dos blastômeros injetados.Em seguida, transfira os embriões microinjetados para novos poços na placa de cultura contendo MMR acrescido de Gentamicina. Incube os embriões a 14 a 22 °C até que alcancem o estágio 38 a 40. Neste procedimento, transfira 10 a 20 embriões nos estágios 38 a 40 para um frasco de vidro.Adicione 10 microlitros de benzocaína a cinco por cento em etanol a 100 por cento ao tubo. Misture invertendo o tubo e aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões. Em seguida, remova o MMR do tubo e preencha-o com MEMFA.Em seguida, coloque-o em uma plataforma tridimensional com movimento oscilante por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, remova o MEMFA do frasco e preencha-o com metanol a 100 por cento. Então, coloque o frasco em uma plataforma tridimensional com movimento oscilante por dez minutos à temperatura ambiente.Repita este passo de lavagem mais uma vez e armazene os embriões em metanol a 100 por cento durante a noite a menos 20 graus Celsius. Os embriões estão agora fixados e prontos para imunomarcação. Este esquema mostra qual blastômero injetar para direcionar o pronefros esquerdo de embriões de Xenopus no estágio de 8 células, utilizando mRNA da Proteína Fluorescente Vermelha Ligada à Membrana como traçador.A localização do marcador após a injeção no blastômero vegetal ventral esquerdo é mostrada em vermelho, enquanto o rim é rotulado em verde. Esta imagem mostra que o rim foi corado em verde com os anticorpos 3G8 e 4A6. Aqui há uma visão ampliada da região do rim mostrando a localização do marcador e aqui está a imagem mesclada mostrando a co-localização do marcador com o rim.É mostrada aqui a imagem confocal do rim de um segundo embrião corado com 3G8 e 4A6. Esta é a localização do marcador vermelho no rim e no tecido circundante, e esta é a imagem mesclada mostrando a co-localização dos marcadores 3G8 e 4A6 no rim. Antes de realizar este procedimento, é importante familiarizar-se com o embrião inicial de Xenopus.Isso permitirá que você direcione corretamente microinjeções através do mapa de referência estabelecido do xenopus. Uma vez dominada, esta técnica pode ser adaptada para direcionar outros tecidos, como o tubo neural ou o coração.

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática...

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

Este vídeo descreve uma técnica de microinjeção de embriões para entregar compostos no saco vitelino de peixe-zebra.

Microinjeção de embriões: uma técnica para entregar um composto na gema do peixe-zebra

Este vídeo demonstra a microinjeção intravenosa de nefrotoxinas na veia da cauda de um embrião de peixe-zebra para estudar seus efeitos químicos na função renal.

Microinjeção intravenosa de nefrotoxinas em embrião de peixe-zebra: uma técnica para administrar agentes nefrotóxicos na corrente sanguínea de embriões de peixe-zebra

Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.

Um Método para microinjeção de Patiria minata zigotos

O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

Procedimentos otimizados para o isolamento de folículos únicos, microinjeções de RNA citoplasmático, remoção de camadas de células circundantes e expressão de proteínas em oócitos de Xenopus são descritos. Além disso, é apresentado um método simples para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos com canais iônicos dependentes de ligantes.

Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Aprenda microinjeção direcionada em blastômeros para estudar o desenvolvimento renal em Xenopus laevis. Esta técnica maximiza a entrega de reagentes e ajuda a elucidar genes importantes na formação do rim.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento

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