Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento Xenopus Kidney
3 de maio de 2016
Aqui, apresentamos um protocolo para usar mapas de destino e traçadores de linhagem para direcionar injeções em blastômeros individuais que dão origem ao rim de embriões de Xenopus laevis.
O objetivo geral deste procedimento é direcionar microinjeções para o rim de xenopus em desenvolvimento. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como como o rim se forma e quais genes são importantes para esse processo. A principal vantagem dessa técnica é que ela maximiza a entrega de reagentes microinjetados a um tecido-alvo.
A visualização deste método é importante porque a identificação do blastômero correto para microinjeção direcionada é crítica. Para iniciar este procedimento, ambos os testículos foram isolados de um único sapo macho e colocados em uma placa de Petri de 60 milímetros preenchida com 10 mililitros de solução de armazenamento de testículos. Em seguida, armazene os testículos a quatro graus Celsius.
Em seguida, os ovos foram coletados de uma rã fêmea em uma placa de Petri de 100 milímetros. Despeje o excesso de água da placa de Petri. Depois disso, corte um quarto de um testículo na solução de armazenamento de testículos.
Transfira o pedaço de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Posteriormente, corte a porção do testículo em pedaços pequenos. Adicione MMR mais Gentamicina à placa de Petri para cobrir os ovos.
Misture-os girando o prato e espere aproximadamente 30 minutos para que a fertilização ocorra em temperatura ambiente. Após a fertilização, o lado pigmentado dos embriões deve estar voltado para cima. Remova a MMR da placa de Petri usando uma pipeta de transferência e adicione solução de degelagem suficiente para cobrir os embriões.
Depois, gire o prato nos próximos minutos para dissolver a camada gelatinosa dos embriões. Uma vez que os embriões estão se tocando no centro do prato, a camada de gelatina foi removida. Remova a solução de degelagem com uma pipeta de transferência.
Em seguida, lave os embriões gelatinosos 3 a 5 vezes em MMR mais Gentamicina, despejando cuidadosamente o MMR e enchendo o prato com o novo MMR. Não remova toda a MMR do prato, o que pode danificar os embriões. Depois disso, remova todos os ovos não fertilizados ou pedaços de testículo da placa de Petri.
Para escalonar seu desenvolvimento, coloque metade dos embriões de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 graus Celsius e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 graus Celsius. Os embriões se desenvolverão mais lentamente a 14 graus Celsius do que a 18 graus Celsius. Permitindo vários conjuntos de injeções de uma única embreagem fertilizada.
Preparar a solução de injecção contendo o ponto zero de um nanograma por nanolitro de RNAm da proteína fluorescente vermelha ligada à membrana. Enquanto os embriões estão se desenvolvendo para o estágio de 4 ou 8 células. Mantenha a solução injetável no gelo até à utilização.
Em seguida, carregue um tubo capilar de vidro de substituição de sete polegadas em um extrator de agulha com a parte superior do tubo de substituição alinhada com a parte superior da caixa do extrator de agulha. Defina o valor do calor número dois para 800 e o valor de tração para 650 e pressione o botão de puxar para puxar a agulha. Depois disso, corte a ponta da agulha puxada com uma pinça Dumont.
Deslize a pinça de micropipeta na parte de trás da agulha. Em seguida, deslize o anel de vedação grande na parte de trás da agulha atrás da pinça. Agora, encha a agulha com óleo mineral usando uma agulha hiperdérmica de calibre 27, tomando cuidado para não deixar bolhas de ar entrarem na agulha.
Deslize a agulha no êmbolo do microinjetor, encaixando a agulha no orifício grande do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. Prenda a agulha apertando a pinça. Em seguida, pressione e segure o botão Esvaziar" na caixa de controle do microinjetor até que haja dois bipes.
Em seguida, pipete três microlitros de solução injetável em um pedaço de parafilme. Em seguida, insira a ponta da agulha no cordão de solução injetável no parafilme. Pressione e segure o botão Fill" na caixa de controle do microinjetor para puxar a solução de injeção para a agulha.
Antes da microinjeção, é importante entender as primeiras divisões celulares do embrião de xenopus. O embrião unicelular tem um pólo animal de pigmentação escura e um pólo vegetal que é branco e yoky. No embrião de duas células, a primeira clivagem normalmente ocorre entre os lados esquerdo e direito do embrião.
Essas células contribuem igualmente para a linhagem pronéfrica. A segunda clivagem divide as metades dorsal e ventral do embrião, levando a um embrião de 4 células. As células dorsais são menores e têm menos pigmento do que as células ventrais.
Se for injetar em um embrião de 4 células, injete o blastômero ventral esquerdo para atingir o rim esquerdo. A terceira clivagem divide os lados animal e vegetal. Resultando em um embrião de 8 células.
Neste ponto, existem quatro blastômeros animais e quatro blastômeros vegetais. Para atingir o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injete no blastômero vegetal ventral esquerdo. Em seguida, preencha uma placa de Petri de 60 milímetros forrada com malha de poliéster de 500 mícrons com cinco por cento de fycol em MMR mais genticina.
Pipete cuidadosamente 20 a 30 embriões de 8 células no prato. Usando um laço de cabelo, manipule os embriões para que o blastômero a ser injetado fique voltado para a agulha. Para atingir o rim esquerdo, alinhe os embriões de modo que os blastômeros vegetais ventrais esquerdos de embriões de 8 células fiquem voltados para a agulha.
Injete 10 nanolitros de solução de injeção no blastômero selecionado de cada embrião no prato. Em seguida, transfira os embriões injetados para os poços de uma placa de cultura com cinco por cento de fycol em MMR mais genticina. Incube os embriões injetados a 16 graus Celsius por aproximadamente uma a duas horas para permitir que os blastômeros injetados cicatrizem.
Depois disso, transfira os embriões microinjetados para novos poços na placa de cultura preenchida com MMR mais genticina. Incubar os embriões a 14 a 22 graus Celsius até atingirem o estágio 38 a 40. Neste procedimento, transfira 10 a 20 embriões de estágio 38 a 40 para um frasco de vidro.
Adicione 10 microlitros de benzocaína a cinco por cento em etanol a 100 por cento ao frasco. Misture invertendo o frasco e aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões. Em seguida, remova a MMR do frasco e encha-o com MEMFA.
Em seguida, coloque-o em uma plataforma de balanço tridimensional por uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora, remova o MEMFA do frasco e encha-o com 100% de metanol. Em seguida, coloque o frasco em uma plataforma de balanço tridimensional por dez minutos em temperatura ambiente.
Repita esta etapa de lavagem mais uma vez e armazene os embriões em 100% de metanol durante a noite a menos 20 graus Celsius. Os embriões agora estão fixados e prontos para imunocoloração. Este esquema mostra qual blastômero injetar para direcionar o pronefro esquerdo de embriões de xenopus no estágio de 8 células usando o mRNA da proteína fluorescente vermelha ligada à membrana como traçador.
A locatlização do traçador após a injeção no blastômero vegetal ventral esquerdo é mostrada em vermelho, enquanto o rim é marcado em verde. Esta imagem mostra que o rim estava corado de verde com os anticorpos 3G8 e 4A6. Aqui está uma visão de perto da região do rim mostrando a localização do traçador e aqui está a imagem mesclada mostrando a co-localização do traçador com o rim.
Aqui é mostrada a imagem confocal do rim de um segundo embrião corado com 3G8 e 4A6. Esta é a localização do traçador vermelho no rim e no tecido circundante e esta é a imagem mesclada que mostra a co-localização do traçador 3G8 e 4A6 no rim. Antes de realizar este procedimento, é importante se familiarizar com o embrião inicial de xenopus.
Isso permitirá que você direcione adequadamente as microinjeções por meio do mapa de desvanecimento de xenopus estabelecido. Uma vez dominada, essa técnica pode ser adaptada para atingir outros tecidos, como o tubo neural ou o coração.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para direcionar microinjeções a blastômeros individuais que se desenvolvem em rins de embriões de Xenopus laevis. O objetivo é aprimorar nossa compreensão da formação renal e dos genes envolvidos nesse processo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia
- Análise da Função Gênica
Antecedentes
- Compreender o desenvolvimento renal é fundamental na biologia do desenvolvimento.
- As técnicas de microinjeção permitem a entrega precisa de reagentes.
- Identificar o blastômero correto é essencial para injeções bem-sucedidas.
- Este método pode ajudar a elucidar os papéis dos genes na organogênese.
Objetivo do Estudo
- Investigar a formação do rim em Xenopus laevis.
- Identificar genes importantes envolvidos no desenvolvimento renal.
- Aprimorar técnicas de microinjeção direcionada em embriões.
Métodos Utilizados
- Isolamento dos testículos de um sapo macho.
- Preparação da solução de armazenamento dos testículos.
- Armazenamento dos testículos em temperaturas baixas.
- Técnicas de visualização para identificação de blastômeros.
Resultados Principais
- Alcance bem-sucedido de microinjeções em blastômeros específicos.
- Melhor compreensão dos processos de desenvolvimento renal.
- Identificação de genes-chave que influenciam a formação dos rins.
- Melhoria da metodologia para estudos futuros em biologia do desenvolvimento.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para estudar o desenvolvimento renal.
- Injeções microdirigidas podem gerar insights significativos sobre a função gênica.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar a organogênese.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microinjeção direcionada em embriões de Xenopus permite controle espacial preciso da expressão gênica, reduzindo efeitos fora do alvo e melhorando a clareza mecanicista em estudos de desenvolvimento. Esta abordagem apoia a validação de alvos ao associar genes específicos a vias de organogênese, como a formação do pronefros, com mínima perturbação sistêmica. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao isolar a função gênica em contextos teciduais definidos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da superexpressão ou silenciamento gênico em blastômeros específicos que contribuem para o pronefros.
- Valor Operacional: Reduz efeitos secundários em tecidos não alvo, aumentando a relação sinal-ruído nas leituras fenotípicas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer os papéis dos genes no desenvolvimento renal por meio de manipulação espacialmente restrita.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados com células marcadas por linhagem para análise posterior da contribuição pronefrica.
- Valor Operacional: Utiliza imunomarcação em preparação inteira no estágio 38–40 para avaliar quantitativamente a integração de células-alvo no pronefros.
- Reprodutibilidade: Baseia-se em mapas de destino celular estabelecidos e na consistência do direcionamento de blastômeros em embriões de 4 e 8 células.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: O pronefros de Xenopus atua como um sistema relevante para doenças ao modelar mecanismos conservados de desenvolvimento renal em vertebrados.
- Continuidade Mecanística: Permite a progressão da descoberta da função gênica em embriões para a análise de vias em modelos pré-clínicos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir ou não ao validar o engajamento do alvo em um sistema orgânico em desenvolvimento antes de estudos em mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A técnica se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, conectando a modulação gênica específica de blastômeros à avaliação fenotípica em tecidos em desenvolvimento e orientando a seleção de alvos para validação adicional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao restringir a manipulação gênica a blastômeros da linhagem do pronefros, esclarecendo o envolvimento de vias na organogênese.
- Prontidão do Ensaio: Produz embriões com localização verificada do marcador, permitindo imunomarcação e imagem padronizadas para análise quantitativa do pronefros.
- Análises: Facilita a comparação da estrutura pronefrica e da co-localização do marcador para avaliar o impacto da função gênica no desenvolvimento renal.
- Pesquisa Translacional: Relaciona achados no pronefros embrionário a mecanismos conservados aplicáveis em modelos de doenças renais de mamíferos.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a outros tecidos (por exemplo, tubo neural, coração) utilizando o mesmo arcabouço de microinjeção guiado por mapa de destino celular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a precisão da validação de alvos ao minimizar efeitos de confusão decorrentes da modulação generalizada de genes.
- Valor Operacional: Permite microinjeção reprodutível e escalonável em blastômeros definidos, utilizando etapas padronizadas de preparação e incubação.
- Valor Estratégico: Melhora a triagem de portfólios ao fornecer vínculos mais claros entre genótipo e fenótipo em um sistema orgânico em desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Reduz o risco biológico em estágios avançados mediante a desmistificação mecanicista precoce de alvos relacionados aos rins.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de embriões de Xenopus, identificação de blastômeros e técnicas de microinjeção.
- Depende de equipamentos de injeção funcionais, incluindo puxadores de micropipetas, microinjetores e sistemas de incubação com controle de temperatura.
- Necessita de protocolos padronizados para estadiamento de embriões, fixação e imunomarcação para garantir consistência entre experimentos.
- A adaptação a outros tecidos depende de mapas de destino celular precisos e exatidão no direcionamento de blastômeros.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade da viabilidade embrionária a variações de temperatura e ao trauma da injeção.
