Name: Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda microscopia de longo prazo do ciclo de vida sexual de levedura por fissão. Este método permite visualizar células individuais durante a reprodução, superando problemas de sincronização na diferenciação sexual.

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AV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de longo prazo EMBO. Pesquisa no laboratório de Martin é financiado por uma bolsa ERC Starting (GeometryCellCycle) e uma subvenção Science Foundation Nacional Suíço (31003A_155944) para SGM.

análise de microscopia de reprodução sexual levedura 1. Preparação de Meios <ol><li> Prepare meio de esporulação Mínimo (MSL-N) 15 por mistura dos seguintes componentes: Glucose: 10 g / l, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: 0,1 g / L, MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / EU. Adicionar oligoelementos (10.000x): 100 uL / L, vitaminas (1.000X): 1 mL / L, e 0,1 M de CaCl2 &#160; ml / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 e armazenar a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Utilize a seguinte Vitaminas (1.000x) da: Pantotenato: 1 g / L, ácido nicotínico: 10 g / l, inositol: 10 g / L, Biotina: 10 mg / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. </li><li> Use os seguintes elementos-traço (10.000 vezes) inventário: Ácido Bórico: 5 g / L, MnSO4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / l, ácido cítrico a 10 g / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare MSL-N de agarose a 2% (utilizado para fazer câmaras bloco de agarose) combinando 10 ml de N-MSL com 0,2 g de agarose. Derreta para ~ 2 min em alta potência em um forno de microondas até dissolver agarose e alíquotas de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Prepare meio de esporulação mínima com azoto (MSL + N) do MSL-N através da adição de (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, leucina: 0,225 g / L, adenina: 0,225 g / L, uracilo: 0,225 g / L . Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um. Armazenar à temperatura ambiente. Nota: leucina, adenina e uracilo são adicionados a este meio para permitir o crescimento de estirpes auxotróficas. Suplemento de amino-ácido adicional deve ser incluído se a cepa utilizada carrega uma auxotrofia distinta (por exemplo his3Δ). Observe também que o trabalho com cepas plenamente prototrófica é recomendado, já que apenastais estirpes vai permitir alta eficiência de acoplamento. </li><li> Prepare 200 ml valap para vedação de câmara. Numa proveta de adicionar pesos iguais, de lanolina, vaselina (ou outro vaselina), e parafina. mistura de calor a baixa temperatura e mexa ocasionalmente até ficar bem misturado. Alíquota da mistura em vários pequenos pratos de petri. Armazenar à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Cepas A cultura de fissão de levedura para Experimentos de acoplamento (Figura 1). <ol><li> Dia 1, Evening: Inocular estirpes recém-listradas de meios sólidos em tubos de cultura contendo 3 ml de MSL + N. Use tubos de fundo plano de diâmetro de cerca de 2,5 cm. Use outros tubos de cultura ou de frascos de cultura com um volume adaptado. Incubar durante a noite (O / N) com agitação a 25 ° C, 200 rpm. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, inocular separadamente. <ol><li> Dilui-se suspensões de células em meios na manhã seguinte para assegurar que as culturas possuem uma densidade óptica medida a 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 durante a noite. Nota:OD 600 medições como um proxy de concentração de células de levedura são lineares no intervalo de cerca de 0,1-1,0. Para o nosso espectrofotómetro OD 600 = 0,1 corresponde a 1,4 x 10 6 culas por ml. Assim, se OD inicial de 600 leituras são fora deste intervalo amostras precisa ser diluído / concentrada para medições confiáveis. </li></ol></li><li> Dia 2, Evening: Dilui-se as células em 20 ml de meio MSL + N para DO600 = 0,025 em frascos de 100 ml. Incubar estirpes de O / N a 30 ° C, 200 rpm. Nota: culturas de células do tipo selvagem deve chegar a OD 600 ~ 0,8 na manhã seguinte (15 horas depois). Se estiver a trabalhar com estirpes com maior tempo de geração ajustar diluição em conformidade. </li><li> Dia 3, Manhã: Medida OD600 para verificar que as culturas têm densidade celular de OD600 ~ 0,8. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, misture um número igual de células parceiras. células de pelotas em 1000 xg e transferir para um 1,5 mltubo. Lave as células três vezes em 1 ml de meio MSL-N. Re-suspender as células em 3 ml de meio MSL-N e diluir as células a OD 600 = 1,5. <ol><li> Para monitorar o acasalamento entre as células irmã células montar diretamente para geração de imagens (ver Protocolo Secção 2.4). Use estirpes H90 homotálico, em que tipo de acasalamento de comutação terá lugar durante as divisões mitóticas que ocorrem após a privação de azoto. montagem imediata de células sobre a almofada de agarose assegura que, após a divisão celular, associado células permanecer ao lado do outro. </li><li> Para monitorar a polarização celular (dinâmica exploratórios e shmooing) incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. Dentro destas 3-4 horas, terá ocorrido a última divisão mitótica. Algumas células vão ter iniciado a polarização, mas a maioria só vai estar começando sua dinâmica de polarização exploratórios. </li><li> Para monitorizar a fusão célula-célula incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 4-6 h priou a células de montagem para imagiologia. </li><li> Monitorar eventos de fusão pós-incubar 1-3 ml de culturas celulares a 30 ° C, 200 rpm, durante 8 h antes de células de montagem para imagiologia. </li><li> Para monitorar a resposta a uma concentração de feromonas específicas (apenas para estirpes heterotálicas) incubar 3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. <ol><li> Retire o tubo de microcentrífuga MSL-N contendo a partir do bloco de calor C 95 ° (ver secção Protocolo 2.4.1. Abaixo). Adicionar P-factor ou factor-M na concentração desejada directamente na agarose MSL-N derretido. Misture bem em vortex antes da preparação pad imediata. </li><li> Após a montagem da célula, a almofada incubar durante 15-30 min a 25 ° C antes da imagiologia. -Factor P e factor-M feromonas foram usadas a partir de uma solução stock de 1 mg / ml em metanol. Nota: Se o trabalho com estirpes mutantes tempos de incubação podem variar. A aglomeração das células pode ocorrer após incubação prolongada em m líquidaEDIA e pode ser particularmente forte em algumas estirpes mutantes. células aglutinados não podem ser manchadas sobre almofadas de agarose em uma única camada e, assim, são difíceis de focagem automática e imagem. Em caso de extenso aglutinação celular células em almofadas de agarose montagem imediatamente após lavagens e re-suspensão em meios-falta de azoto (como no protocolo Secção 2.3.1.) E incubar a 30 ° C antes da imagiologia. </li></ol></li></ol></li><li> Montagem Cells for Imaging: <ol><li> Prepare MSL-N almofadas de agarose a 16 por fusão de uma alíquota num bloco de calor a-95 ° C durante 10-15 min e adicionar 200 ul entre duas lâminas de vidro separadas por espaçadores (Figura 1B). Use espaçadores com uma espessura de 0,5 mm ~. Para fazer os espaçadores, de uso tiras cortadas de cartão, como a que está fornecido com enzimas de restrição. </li><li> Pellet 100 ul de células a 1000 x g durante 1 min, remover o sobrenadante e as células em meio de 2-4 ul residual re-suspender. Não re-suspensão em meio fresco em que atrasaacasalamento. </li><li> Após 2-3 min remova cuidadosamente os espaçadores e a lâmina de vidro superior. Se várias cepas são para ser montado, prepare a célula se concentra antes de preparar a almofada de agarose. </li><li> Adicionar 1 ml de células para a almofada e esperar até a queda começa secagem (~ 1 min) antes de cobrir com tampa de deslizamento e selando com valap. </li><li> Deixe que a almofada de se sentar durante pelo menos 30 min antes de imagem a 25 ° C ou TA. </li><li> Para se obter uma mistura de células em vários estágios de acasalamento, fazer uma almofada imediatamente após lavagens em MSL-N (ver secção 2.3.) E incuba-se a 18 ° CO / N (~ 15 h). Essa abordagem é útil para geração de imagens de células em fases distintas de acasalamento com alta resolução temporal ou amostras com sinal fraco. </li></ol></li></ol> Imagem 3. Em células vivas de células de levedura de acoplamento <ol><li> Ajustar as Definições de aquisição. Nota: As configurações de aquisição de imagem aqui apresentados foram otimizados para a plataforma DeltaVision composto por uma personalização Olympus IX-71microscópio invertido com o Plano de Apo 60X / 1,42 NA ou U-Plano de Apo 100X / 1,4 objectivos de NA, uma câmera CoolSnap HQ2 e um 7 cores introspecção SSI unidade combinada iluminador. O equipamento é controlado por softWoRx v4.1.2 que também permite a auto-focagem digital. <ol><li> Assegure-se que os intervalos de focagem automática não excedam 15 min uma vez que o Z-tração sobre um tempo mais longo pode ultrapassar a capacidade do sistema de auto-focagem de software. Se estiver usando um sistema de focagem baseada em hardware, use intervalos maiores. </li><li> Ajuste o intervalo de imagem. Captar imagens a cada 10 minutos para ~ 15 hr como ponto de partida quando se trabalha com uma proteína fluorescente etiquetado pela primeira vez. Este intervalo fornece uma boa visão geral de todo o processo de acasalamento, sem branqueamento extensivo. <ol><li> Imagem com intervalos de 5 min ou mais curtas para mais precisamente eventos de tempo, como a fusão. intervalos mais curtos exigem fluoróforos fortes que permitam baixos tempos de exposição e pouco branqueamento. Para geração de imagens com intervalos inferiores a microscopia de 1 min evitar O / Ne em vez disso se preparar uma mistura de todas as fases de acoplamento tal como detalhado na Secção 2.4.6 Protocolo. </li></ol></li><li> Ajustar a imagem tempo de exposição. tempos de exposição de teste entre 50 e 300 ms. Destinam-se a estabelecer um equilíbrio entre a relação sinal-ruído e fotodegradação de alcançar um grande número de pontos de tempo com um sinal perceptível (normalmente mais de 100). </li><li> Ajustar Z-seccionamento. Secções cada 0,3 pm, cobrindo 5 uM fornecer uma boa profundidade da imagem. Note-se que aumenta ainda mais foto-lesão de corte Z, que podem ser minimizados através da utilização do OAI (integração eixo óptico - aquisição de um único varrimento da profundidade total da amostra). Bom sistema de foco automático reduz a necessidade de muitas Z-seções e é altamente recomendado. </li></ol></li><li> Dicas para estudar comportamentos específicos-Type Acasalamento: <ol><li> Para as estirpes heterotálicas, usar H- e H + células expressando fluoróforos diferentes, de modo que os dois tipos de células podem ser distinguidas. Use qualquer fluoropho geneticamente codificadoestá expresso como uma versão citosólica ou fusão de uma proteína endógena, embora tenhamos tido um bom sucesso com sfGFP, uma variante de dobrar rápida de GFP 17. Proteínas endógenas são geralmente etiquetado no seu local genómico endógeno por recombinação homóloga 14. </li><li> Para as estirpes homotálico, expressar uma proteína citosólica fluorescente geneticamente codificado sob o controlo de promotores específicos do tipo de acasalamento, tais como os dos genes de receptores de feromonas map3 e mam2 para conduzir a expressão em células P e M, respectivamente. Os promotores de map3 e mam2 estão inativas durante o crescimento vegetativo e são induzidas mediante privação de nitrogênio 18,19. Constructos de condução da expressão de GFP citosólico ou mCherry sob o controlo de um destes promotores são tipicamente integrados num locus genómico (ura4, Leu1) que não interfere com a progressão normal do ciclo de vida sexual 12. </li></ol></li&gt; <li> Use tipo de acasalamento fluoróforos citosólicas específicas (como na Seção Protocolo 3.2.2) para determinar o sincronismo preciso de fusão celular visualizado como a transferência de sinal fluorescente de uma célula parceiro para o outro. </li></ol> 4. Quantificação de acasalamento e fusão Eficiências <ol><li> Para quantificar a eficiência de fusão e de acoplamento 11,12, células no local directamente após MSL-N de lavagem sobre MSL-N almofadas de agarose, tal como no passo 2.3.1, supra, e deixar durante 24 horas a 25 ° C antes da imagiologia (Figura 1A). Usando este protocolo um tipo selvagem estirpe eficiência de acoplamento homotálico ~ atinge 60% e a eficiência de fusão de 99%. Para testar se qualquer redução nestes valores observados em estirpes mutantes reflectir um fenótipo terminal ou um atraso, repetir a experiência com um tempo de incubação 36 h. </li><li> Calcular a eficiência de acasalamento como <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> pares de acasalamento incluem zigotos, asco, e pares de células não fundidas identificados a partir desua posição e crescimento para cada um dos outros. </li><li> Calcular a eficiência de fusão como <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> Nota: pares de acasalamento fundidas são identificados pela sua capacidade de formar esporos, se for conhecido que o mutante sob estudo não influencia a esporulação. Se a esporulação não pode ser utilizado como leitura para fora, a fusão é determinada através da observação da propagação de um marcador citosólica expressa em apenas um dos parceiros de acoplamento em ambos os parceiros. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

condições ambientais e disponibilidade de nutrientes em particular, afetam fortemente a fisiologia da levedura de fissão. Privação de nitrogênio é necessário para compromisso com a reprodução sexual e, inicialmente, leva a mudanças marcantes na progressão do ciclo celular mitótico (Ref. 21 e Figura 2). Após a remoção do azoto população em crescimento exponencial, o tamanho das células em divisão diminui rapidamente (Figura 2C) e a maioria das células deter a progressão mitóti...

Apesar de intercâmbio genético entre duas células é o evento central na reprodução sexual, ele depende de uma cadeia de eventos que promovem a diferenciação celular, permitem a escolha do parceiro, realizar a fusão célula-célula e manter a estabilidade genômica. Assim, o ciclo de vida sexual se apresenta como um sistema modelo para estudar uma série de questões biológicas sobre interruptores de desenvolvimento, resposta a estímulos extrínsecos, a fusão da membrana plasmática, segregação cromossômica, etc. Explorando a levedura ciclo sexual para estudar esses fenômenos traz os benefícios da genética poderosos do sistema modelo, bem estabelecida abordagens de alto rendimento e de microscopia sofisticado. Sexo em levedura é um evento heterotípica entre uma célula e um P-célula M de tipos de cruzamento distintos. Os dois tipos de células expressam diferencialmente uma série de genes de 1,2, incluindo aqueles para a produção do ácido P- segregada e M-feromonas,-receptores de feromonas map3 e Mam2 bem como feromona-Proteases Sxa1 e Sxa2. Homotálico estirpes, tais como a estirpe H90 comumente utilizado, transportar a informação genética para os dois tipos de acasalamento em um único genoma e as células sofrem um padrão complexo de tipo de acasalamento de comutação ao longo do ciclo de vida do mitótico (revisto em Ref. 3). Vários isolados de levedura heterotálicas que raramente ou nunca mudar tipo de acasalamento também são comumente utilizados 4, o mais proeminente o h + N (P-tipo) e as cepas h S (M-tipo). Em levedura, a entrada no ciclo de vida sexual está sob regulação nutricional rigorosa. Apenas células de levedura de fissão deficientes em nitrogênio prender reprodução mitótico e produzir feromônios difusï¿½eis para sinalizar a presença de um parceiro de acasalamento e promover novas etapas do ciclo sexual (revisto em Ref. 5). privação de azoto de-reprime o regulador transcricional chave de Ste11 de acoplamento que funciona como um interruptor de desenvolvimento e promove expression de acasalamento genes específicos, incluindo o receptor de feromônio e o feromônio genes de produção de 6,7. Engajamento-receptor de feromônio ativa a proteína-acoplado receptor G-alfa e de sinalização MAPK a jusante que aumenta ainda mais Ste11 atividade transcricional 8-10, aumentando assim a produção de feromônio em um feedback positivo entre os parceiros de acasalamento. Níveis de feromonas são cruciais para induzir diferentes estados de polarização celular, regulando o organizador mestre da polaridade celular, a Rho-família GTPase Cdc42 11. Após a exposição a baixas concentrações de feromonas, Cdc42 activo é visualizado em manchas dinâmicos explorando a periferia da célula, e nenhum crescimento de células é observada nesta fase. níveis de feromônio aumento promover a estabilização da actividade Cdc42 a uma única zona e crescimento de uma projeção polarizada, denominado o shmoo, que traz células parceiras em contato. Posteriormente, os dois parceiros de acasalamento haplóide fundir para formar um zigoto diplóide. Um trabalho recente revela the existência de uma estrutura nova actina essencial para a fusão que é montado pela formin induzida por acasalamento FUS1 12. Este enfoque de fusão concentra processos dependentes tipo V-miosina e posiciona a maquinaria degradação da parede celular, permitindo, assim, a remodelação da parede celular para permitir o contacto da membrana plasmática, sem lise celular 12. Após a fusão célula-célula, os núcleos entram em contato e passam por cariogamia. Um movimento de vai-e-vem dependente da dineína proeminente dentro do núcleo do zigoto (o movimento do cavalo-cauda), em seguida, promove o emparelhamento de homólogos do cromossoma 13,14, que é seguido por meiose. Finalmente, os quatro produtos de meiose são embalados em esporos individuais durante a esporulação. Devido à sua complexidade e os numerosos passos envolvidos, monitoramento detalhado do acasalamento tem sido um desafio. Duas dificuldades notáveis ​​são que todo o processo leva bem mais de 15 horas e que as células são difíceis de sincronizar. estes difficulties são contornadas por abordagens de microscopia de uma única célula. Aqui um protocolo geral para investigar o ciclo de vida sexual na levedura de fissão é apresentado. Com pequenos ajustes, este protocolo permite o estudo de todas as diferentes etapas do processo, ou seja, a indução de produto do gene de acasalamento, a polarização celular e emparelhamento entre irmãos células após tipo de acasalamento de comutação e entre os parceiros não-irmã, a fusão célula-célula, e pós-fusão horse-tail movimento, a meiose e esporulação. Este método permite 1) visualizar facilmente fluorescente etiquetado proteínas ao longo do tempo pré, durante e pós-fusão; 2) discriminar o comportamento das células do tipo de cruzamento oposto; e 3) medir e quantificar parâmetros como shmooing, mating, fusão ou eficiência esporulação.

<table><tbody><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>AppliChem</td><td>A2088,0025</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nicotínico</td><td>AppliChem</td><td>A0963,0100</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>AppliChem</td><td>A1716,0100</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>AppliChem</td><td>A0967,0250</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>AppliChem</td><td>A1038,0250</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&#8226; 7H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&#8226; 6H2O</td><td>AppliChem</td><td>A3514,0250</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de molibdênio (VI) (MoO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69850</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>AppliChem</td><td>A3872,0100</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&#8226; 5H2O</td><td>AppliChem</td><td>A1034,0500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2344,0500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr>(<tr><td>NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01217.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adenina Hemissulfato Sal, mini 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Uracila&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Reactolab</td><td>92045-74-4</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Reactolab</td><td>7005600</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de fissão de levedura ciclo de vida sexual

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

A levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe tem sido um sistema modelo inestimável no estudo da regulação da progressão do ciclo celular mitótico, a mecânica da divisão celular e a polaridade celular. Além disso, experimentos clássicos sobre sua reprodução sexuada produziram resultados fundamentais para a compreensão atual da recombinação e meiose do DNA. Análises mais recentes do acasalamento de leveduras de fissão levantaram questões interessantes sobre os mecanismos de resposta a estímulos extrínsecos, crescimento celular polarizado e fusão célula-célula. Para estudar esses tópicos em detalhes, desenvolvemos um protocolo simples para microscopia de todo o ciclo de vida sexual. O método descrito aqui é facilmente ajustado para estudar estágios específicos de acasalamento. Resumidamente, depois de serem cultivadas até a fase exponencial em um meio rico em nitrogênio, as culturas de células são transferidas para um meio privado de nitrogênio por períodos de tempo adequados ao estágio do ciclo de vida sexual que será explorado. As células são então montadas em câmaras de almofada de agarose personalizadas e facilmente construídas para geração de imagens. Essa abordagem permite que as células sejam monitoradas desde o início do acasalamento até a formação final dos esporos.

Fissão crescimento do fermento e Acasalamento Dynamics após a remoção da fonte de nitrogênio Como privação de nitrogênio é um pré-requisito para o início da reprodução sexual na levedura de fissão, estirpe de tipo selvagem H90 homotálico foi monitorada mediante mudança de para médio privado de azoto rico em nitrogênio (Figura 2), seguindo o protocolo apresentado na Figura 1. Resumidamente, as células foram cultivadas O / N a fase exponenc...

Fornecemos um método básico reprodutível para a microscopia de longo prazo do ciclo de vida sexual da levedura de fissão. Com pequenos ajustes descritos, o protocolo apresentado permite que a pesquisa se concentre em diferentes etapas do processo reprodutivo.

Microscopia de fissão de levedura Ciclo de Vida Sexual

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

O objetivo geral deste método é monitorar todo o processo de reprodução sexuada em levedura de fissão por microscopia de luz. Este método descreve o preparo de células de levedura de fissão para imagens de lapso de tempo de várias etapas do ciclo de vida sexual, como escolha do parceiro de acasalamento, crescimento polarizado, fusão célula-célula, meiose e esporulação. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a visualização de células individuais, superando assim o problema de as células não entrarem na diferenciação sexual de forma sincronizada.Este método é muito simples, mas a demonstração visual é útil para mostrar como montar várias cepas em paralelo para microscopia. A demonstração do procedimento com minha estudante de doutorado Omaya Dudin será feita por Laura Merlini, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Existem várias variações deste protocolo que podem ser adaptadas para estudar diferentes estágios do ciclo de vida sexual, utilizando cepas homotálicas ou heterotálicas.Nesta demonstração, serão utilizadas cepas homotálicas H90. Nessas cepas, a troca do tipo de acasalamento ocorre durante a última divisão mitótica após a privação de nitrogênio, resultando em uma mistura dos dois tipos de acasalamento. À noite, dois dias antes do experimento de acasalamento, inocular cepas recentemente repicadas de meio sólido em tubos de cultura contendo 3 mililitros de meio mínimo de esporulação com nitrogênio ou MSL mais N. Incubar durante a noite com agitação a 25 graus Celsius.Na manhã seguinte, se necessário, dilua as suspensões celulares em MSL mais N para garantir crescimento exponencial durante todo o dia. À noite, meça a densidade óptica e dilua as células em 20 mililitros de meio MSL mais N em frascos de 100 mililitros até uma densidade óptica de 025. Culturas de células selvagens devem atingir uma densidade óptica 600 de aproximadamente 8 na manhã seguinte. Assim, a diluição deve ser ajustada adequadamente, caso se trabalhe com cepas de tempos de geração mais longos.Incube as culturas durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica para verificar se cada cultura apresenta uma densidade óptica 600 em torno de 8. Peliculize as células a 1000 x g durante um minuto e transfira para um tubo de 1,5 mililitro.Lave as células três vezes em 1 mililitro de meio mínimo de esporulação sem nitrogênio ou MSL sem N. Após a última lavagem, re-suspenda as células em 3 mililitros de meio MSL sem N. Meça a densidade óptica e dilua as células para uma densidade óptica 600 de 1,5. Para iniciar o preparo de lâminas de agarose, primeiro derreta uma alíquota de agarose MSL sem N a 2 por cento em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius por 10 a 15 minutos.Enquanto isso, centrifugue 100 microlitros da suspensão celular preparada anteriormente a 1000 x g durante um minuto. Remova o sobrenadante e reconstitua as células no resíduo de 2 a 4 microlitros de meio. Com as células aguardando na bancada, adicione 200 microlitros do meio derretido sobre uma lâmina de vidro entre dois espaçadores.Coloque suavemente outra lâmina sobre o ágar derretido. Uma vez que o agarose tenha solidificado, remova cuidadosamente os espaçadores. Para remover a lâmina de vidro superior, gire e puxe-a suavemente para o lado.Se várias cepas devem ser visualizadas simultaneamente, a lâmina pode ser subdividida em quatro mini lâminas. Para isso, use uma lâmina de barbear e corte a lâmina ao meio, separando as partes cerca de 1 milímetro e repita na direção perpendicular. Adicione 1 microlitro de células à lâmina de agarose e aguarde cerca de um minuto.Cubra as células com uma lamínula e sela toda a periferia da lamínula com VELAP aquecido. É importante selar completamente a lamínula para evitar a dessecação do preparo. Deixe o preparo repousar por pelo menos 30 minutos antes da aquisição de imagens.Para garantir o sucesso do protocolo e uma alta eficiência de acasalamento, as células devem ser mantidas em crescimento exponencial até a privação de nitrogênio e montadas sem excesso de líquido, de modo que fiquem estacionárias sobre o suporte de agarose. Em seguida, é realizada a microscopia de tempo real das células de levedura em acasalamento a 25 graus Celsius, ou à temperatura ambiente, seguindo o procedimento descrito no texto do protocolo. A microscopia com intervalo de tempo permite a visualização das células passando pelos processos de formação de "shmoo", fusão e esporulação nas 24 horas subsequentes à privação de nitrogênio.Esse processo é ilustrado neste filme representativo pelas duas células ampliadas no inseto inferior esquerdo. Este protocolo também pode ser usado para monitorar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência em células em acasalamento. Aqui, uma linhagem H heterotálica expressando myo52 marcado com 3GFP foi cruzada com uma linhagem H+ heterotálica expressando myo52 fundido à proteína fluorescente vermelha tdTomato, bem como GFP citosólico.A GFP citoplasmática permite o monitoramento do momento da fusão, visualizado pela sua entrada na célula H. Essas imagens de lapso de tempo mostram que o myo52 inicialmente formou zonas dinâmicas em toda a cortex celular. O sinal de myo52 foi então estabilizado em um único foco logo antes do evento de fusão.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar células para acasalamento eficiente e investigação em tempo real do processo de acasalamento do levedura de fissão.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Microscopia de fissão de levedura Ciclo de Vida Sexual

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