Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

O objetivo geral deste método é monitorar todo o processo de reprodução sexuada em levedura de fissão por microscopia de luz. Este método descreve a preparação de células de levedura de fissão para imagens de lapso de tempo de vários estágios do ciclo de vida sexual, como escolha do parceiro de acasalamento, crescimento polarizado, fusão célula-célula, miose e esporulação. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece visualização de célula única e, assim, supera o problema de que as células não entram na diferenciação sexual de forma síncrona.

Este método é muito simples, mas a demonstração visual é útil para mostrar como montar várias deformações em paralelo para microscopia. Demonstrando o procedimento com minha aluna de doutorado Omaya Dudin, estará Laura Merlini, uma pós-doutoranda em meu laboratório. Existem várias variações para este protocolo que podem ser adaptadas para estudar vários estágios do ciclo de vida sexual, usando cepas homotálicas ou heterotálicas.

Nesta demonstração, serão utilizadas cepas homotálicas H90. Nessas cepas, a troca de tipo de acasalamento ocorre durante a última divisão mitótica após a privação de nitrogênio, resultando em uma mistura dos dois tipos de acasalamento. À noite, dois dias antes do experimento de acasalamento, inocular cepas recém-listradas de meio sólido em tubos de cultura contendo 3 mililitros de meio de esporulação mínimo com nitrogênio ou MSL mais N. Incubar durante a noite com agitação a 25 graus Celsius.

Na manhã seguinte, se necessário, diluir as suspensões celulares em MSL mais N para garantir um crescimento exponencial ao longo do dia. À noite, medir a densidade óptica e diluir as células em 20 mililitros de MSL mais N em frascos de 100 mililitros até uma densidade óptica de 025 As culturas de células do tipo selvagem devem atingir uma densidade óptica de 600 de cerca de 8 na manhã seguinte. Portanto, a diluição deve ser ajustada de acordo, se trabalhar com cepas com tempos de geração mais longos.

Incube as culturas durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Na manhã seguinte, medir a densidade óptica para verificar se cada cultura tem uma densidade ótica de 600 em torno de 8. Pulverize as células a 1000 x g por um minuto e transfira-as para um tubo de 1,5 mililitro.

Lave as células três vezes em 1 mililitro de meio de esporulação mínima sem nitrogênio ou MSL menos N.Após a última lavagem, ressuspenda as células em 3 mililitros de MSL menos meio N. Meça a densidade óptica e dilua as células para uma densidade óptica 600 de 1,5. Para começar a preparação de almofadas de agarose, primeiro derreta um Aliquat de MSL menos N agarose 2 por cento em um bloco de calor de 95 graus Celsius por 10 a 15 minutos.

Enquanto isso, pellet 100 microlitros da suspensão celular preparada anteriormente a 1000 x g por um minuto. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células nos 2 a 4 microlitros residuais do meio. Com as células esperando na bancada, adicione 200 microlitros do meio derretido em uma lâmina de vidro entre dois espaçadores.

Delicadamente, coloque outra lâmina em cima do ágar derretido. Assim que a agarose solidificar, remova cuidadosamente os espaçadores. Para remover a corrediça de vidro superior, gire suavemente e puxe-a para o lado.

Se várias cepas forem fotografadas simultaneamente, a almofada pode ser subdividida em quatro mini almofadas. Para isso, use uma lâmina de barbear e divida a almofada ao meio, puxando as peças cerca de 1 milímetro para o lado e repita na direção perpendicular. Adicione 1 microlitro de células à almofada de agarose e aguarde cerca de um minuto.

Cubra as células com uma lamínula e sele toda a periferia da lamínula com VELAP aquecido. É importante selar toda a lamínula para evitar a dessecação da almofada. Deixe a almofada descansar por pelo menos 30 minutos antes de fazer a imagem.

Para garantir o sucesso do protocolo e alta eficiência de acasalamento, as células devem ser mantidas em crescimento exponencial até a falta de nitrogênio e montadas sem excesso de líquido para que fiquem estacionárias na almofada de agarose. A imagem de células vivas das células de levedura em acoplamento é então realizada a 25 graus Celsius, ou temperatura ambiente, seguindo o procedimento descrito no texto do protocolo. A imagem de lapso de tempo permite a visualização de células submetidas a shmooing, fusão e esporulação nas 24 horas que se seguem à falta de nitrogênio.

Este processo é ilustrado neste filme representativo pelas duas células ampliadas na inserção inferior esquerda. Este protocolo também pode ser usado para monitorar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência em células de acasalamento. Aqui, uma cepa H heterotálica expressando myo52 marcada com 3GFP foi acasalada com uma cepa H + heterotálica expressando myo52 fundida à proteína tdTomato fluorescente vermelha, bem como GFP citosólica.

A GFP citosólica permite o monitoramento do tempo de fusão, visualizado por sua entrada na célula H. Essas imagens de lapso de tempo mostram que o myo52 inicialmente se formou em zonas dinâmicas em todo o córtex celular. O sinal Myo52 foi então estabilizado em um único foco pouco antes do evento de fusão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar células para um acasalamento eficiente e investigação de células vivas do processo de acasalamento da levedura de fissão.