encapsulando citocromo

O objetivo geral deste procedimento é encapsular citocromo c em sol-géis de sílica. Para processar supercriticamente esses géis e formar bioaerogéis, e utilizar esses bioaerogéis para reconhecer rapidamente óxido nítrico por meio de uma reação em fase gasosa. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biossensoriamento e bioanálise, como quais condições são necessárias para que o citocromo c permaneça ativo quando encapsulado em um aerogel altamente poroso?

A importância desta técnica reside no fato de ser um procedimento simples para encapsular uma proteína em uma matriz na qual as proteínas raramente foram encapsuladas com sucesso. Embora este método possa fornecer informações sobre a citocromo c, também pode levar ao desenvolvimento de procedimentos para encapsular outras proteínas em aerogéis, com potencial relevância para dispositivos bioanalíticos futuros. Prepare uma solução com uma concentração de citocromo c na faixa de 0,7 a milimolar.

Além de uma solução diluída de citocromo c a 0,105 milimolar, conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, rotule um béquer descartável de 50 mililitros em polipropileno, Béquer A. Coloque o béquer sobre o prato de uma balança analítica e use uma pipeta de Pasteur de vidro para adicionar 1,88 gramas de tetrametoxissilano ao béquer. Zere a balança.

Em seguida, pipete 2,88 gramas de metanol para o béquer A. Cubra o béquer A com parafilm. Depois, adicione uma barra de agitação magnética a um béquer descartável de 50 mililitros de polipropileno rotulado como béquer B e coloque-o no prato de uma balança analítica. Utilize uma pipeta de vidro para adicionar 0,75 gramas de água e 3,00 gramas de metanol antes de cobrir o béquer B com parafilm.

Inicie a agitação do conteúdo do Béquer B em uma placa de agitação dentro de uma capela de exaustão. Em seguida, utilize uma seringa para inserir 5 microlitros de solução de hidróxido de amônio a 28,0 a 30,0% através da tampa de parafilm na mistura, sob agitação. Assim que esta etapa for concluída, adicione o conteúdo do Béquer A ao Béquer B. Agite a mistura por 20 minutos mantendo-a coberta com parafilm.

Enquanto a mistura de sol de sílica está sendo homogeneizada, obtenha oito a nove frascos de cintilação de polipropileno e suas respectivas tampas. Coloque uma película plástica sobre a extremidade da tampa do frasco para criar uma superfície plana sobre a qual o gel irá se formar. Em seguida, coloque a tampa por cima.

Certifique-se de que o filme plástico permaneça intacto dentro da tampa. Alinhe os frascos com a extremidade da tampa voltada para baixo sobre a bancada, e as aberturas voltadas para cima. Em seguida, corte pedaços de parafilm que serão usados para cobrir cada frasco.

Após a conclusão da mistura do sol, adicione 3 mililitros da mistura de sol a um béquer limpo e descartável de 50 mililitros de polipropileno. Utilize uma pipeta de Pasteur de vidro para gotejar muito lentamente 500 microlitros da solução diluída de citocromo c 0,105 milimolar ao longo da parede do béquer, na mistura de sol de 3 mililitros, ao longo de aproximadamente um minuto. Certifique-se de agitar suavemente a mistura durante a adição do citocromo c para evitar a formação de grandes grumos vermelhos.

Pipete 0,5 mililitros do sol de sílica de citocromo c resultante para cada molde preparado. Também pipete 0,5 mililitros do sol de sílica simples restante em um ou dois moldes para serem usados como amostras controle durante o processo de secagem supercrítica. Cubra as aberturas superiores dos moldes com parafilm e coloque na geladeira durante a noite, ou por pelo menos 12 horas, para produzir géis sol.

Retire as moldes da geladeira. Remova o parafilm do topo de uma das moldes contendo um sol-gel de citocromo c e, também, retire a tampa e o plástico do fundo. Após adicionar um pouco de etanol de um frasco lavador na molde, use a extremidade circular em disco do êmbolo de uma seringa para empurrar cuidadosamente o gel para fora da molde e dentro de um frasco de vidro limpo de 20 mililitros contendo aproximadamente 5 mililitros de etanol.

Repita este procedimento de remoção do gel até que todos os géis de citocromo c sejam adicionados ao frasco e todos os géis de sílica sejam adicionados a um frasco separado. Em seguida, encha os frascos até o topo com etanol. Tampe e armazene entre 2 e 8 graus Celsius.

A cada quatro horas ao longo do dia, retire os géis do refrigerador. Decante o etanol dos géis e substitua por etanol fresco. Durante mais três dias, mantenha os géis sol úmidos submersos em acetona, decantando e adicionando acetona fresca três vezes ao dia.

Resfrie um aparelho de secagem em ponto crítico a 10 graus Celsius, ajustando a temperatura de um circulador acoplado para oito graus Celsius. Uma vez que o aparelho atinja 10 graus Celsius, realize um teste de vazamento no aparelho conforme descrito no protocolo do texto. Após garantir que o aparelho não apresenta vazamentos, despeje cuidadosamente os géis úmidos dos frascos de cintilação, juntamente com a maior parte da acetona, nas três seções longas da embarcação de transferência.

Adicione mais acetona, se necessário, para garantir que todos os géis estejam completamente submersos na acetona antes de selar o barco no interior do aparelho. Abra a válvula de enchimento do aparelho para adicionar dióxido de carbono. Após observar o dióxido de carbono afundando no fundo do aparelho através da janela do aparelho, abra a válvula de drenagem para liberar a acetona durante cinco minutos.

Essa infiltração da acetona para o fundo ocorrerá antes que o aparelho seja completamente preenchido com dióxido de carbono. Portanto, mantenha a válvula de enchimento aberta durante o escoamento para que o aparelho continue a ser preenchido. Em seguida, feche a válvula de drenagem.

Mantenha a válvula de enchimento ligeiramente aberta. No início, a mistura que escoa contém água, porque a acetona não é anidra. Pode ocorrer congelamento, entupimento e acúmulo de pressão no tubo de drenagem.

Se uma obstrução for detectada, feche a válvula de drenagem até que a obstrução derreta. Cinco minutos depois, abra a válvula de drenagem por mais cinco minutos e ajuste a válvula de enchimento para ficar aberta o suficiente para que o aparelho permaneça cheio durante todo o tempo de drenagem. Após cinco minutos, feche a válvula de drenagem e mantenha a válvula de enchimento levemente aberta.

Em seguida, repita este passo de drenagem mais uma vez, cinco minutos depois. Após a conclusão dos passos de drenagem, feche a válvula de enchimento e drene o dióxido de carbono líquido, de modo que o nível permaneça visível logo acima das pontas do barquinho através da janela do aparelho. Em seguida, ajuste a temperatura do circulador acoplado ao aparelho para 40 graus celsius para garantir que o dióxido de carbono líquido ultrapasse sua temperatura e pressão críticas.

Após aproximadamente 15 minutos, observe a transição do líquido para fluido supercrítico através da janela do aparelho, à medida que o menisco líquido acima das hastes do barquinho desaparece. Após um tempo de equilíbrio de pelo menos 15 minutos, abra ligeiramente a válvula de ventilação para iniciar a liberação do fluido supercrítico. Ao longo de aproximadamente 45 minutos, continue abrindo a válvula de ventilação progressivamente, de modo que um sibilo constante, porém muito baixo, do fluido em liberação possa ser ouvido, e o manômetro seja observado diminuindo lentamente até zero.

Após a pressão do aparelho atingir zero, abra a porta do aparelho. Remova o barquinho. E use pinças para colocar os aerogéis recém-secos em frascos de cintilação de vidro limpos.

Os aerogéis de citocromo c em sílica estão agora prontos para serem utilizados na detecção da presença de gás óxido nítrico, após a caracterização descrita no protocolo textual. Aerogéis encapsulando citocromo c a 15 micromolar em tampão fosfato de potássio a 4,4 milimolar, 40 milimolar e 70 milimolar são mostrados em comparação com uma moeda de dez centavos. É apresentado aqui um espectro representativo de citocromo c em tampão comparado ao citocromo c encapsulado em aerogéis sob diversas condições.

O pico de Soret da citocromo c em 409 nanômetros permanece essencialmente inalterado dentro dos aerogéis e apresenta um deslocamento para o vermelho característico quando os bioaerogéis são expostos ao óxido nítrico na fase gasosa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar géis sol-silica, encapsular citocromo c nesses géis sol, e secar esses géis sol compostos até obter aerogéis. Informações adicionais podem ser encontradas no protocolo escrito sobre a caracterização dos bioaerogéis e sobre o uso dos bioaerogéis para detectar óxido nítrico na fase gasosa.