Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

O objetivo geral deste protocolo é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em melanócitos maduros e totalmente pigmentados. Este método pode ajudar a identificar fatores-chave durante o desenvolvimento dos melanócitos. Além disso, este protocolo nos permitirá identificar fatores que apresentaram alterações durante o desenvolvimento de doenças, bem como realizar triagens de medicamentos importantes no descobrimento de fármacos.

A principal vantagem deste protocolo é que ele nos permite produzir grandes quantidades de melanócitos totalmente pigmentados. Enquanto o isolamento de melanócitos de pacientes geralmente resulta em um número relativamente pequeno de células. Após a alíquota e o congelamento da proteína gelatinosa, descongele e reconstitua uma alíquota de um mililitro em 19 mililitros de DMEM f12.

Em seguida, adicione cinco mililitros dessa mistura em um único recipiente de cultura de tecidos de 10 centímetros. Após preparar várias placas desse tipo, prossiga com a incubação delas por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, inicie o preparo de placas revestidas com PO, laminina e fibronectina adicionando primeiro PBS contendo 15 microgramas por mililitro de PO a uma placa de cultura.

Em seguida, incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius em um incubador umidificado. Depois disso, aspirar a solução e lavar as placas três vezes com PBS 1X. Continuar o revestimento adicionando 10 mililitros de PBS contendo um micrograma por mililitro de laminina 1 de camundongo e dois microgramas por mililitro de fibronectina.

Em seguida, incubar as placas conforme descrito anteriormente. Para começar, adicione 0,1% de gelatina em PBS a uma placa de 10 centímetros. E deixe em temperatura ambiente por cinco minutos.

Enquanto esta placa estiver sendo revestida, coloque fibroblastos embrionários de camundongo congelados, ou MEFs, em banho-maria a 37 graus Celsius para descongelá-los rapidamente. Em seguida, aspire a gelatina do recipiente e plaque os MEFs numa densidade de aproximadamente 50.000 células por centímetro quadrado em DMEM suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal. Após incubação do recipiente durante a noite a 37 graus Celsius, aspire o meio e lave a placa de MEFs preparada com PBS 1X.

Prossiga adicionando 10 mililitros do meio para hESC previamente preparado, contendo células-tronco pluripotentes humanas, abreviadas como hPSCs, a uma placa de 10 centímetros. Após semear as células numa densidade de 5 milhões de células por placa, incubar as placas a 37 graus Celsius em 5 por cento de dióxido de carbono. Prossiga alimentando as células diariamente com 10 mililitros de meio fresco para hESC.

Antes de iniciar a diferenciação, inspecione a placa em busca de colônias que pareçam conter células diferenciadas, bordas irregulares ou centros transparentes. Sob um microscópio estereoscópico em uma cabine de fluxo laminar, desprenda mecanicamente quaisquer colônias irregulares com uma pipeta. Para realizar o revestimento com proteína gelatinosa, como Matrigel, primeiramente alíquota e congele a proteína em partes de um mililitro para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

Em seguida, descongele e reconstitua um alíquota congelado de um mililitro com 19 mililitros de DMEM F12. Prossiga para semear cinco mililitros dessa mistura em uma placa de 10 centímetros e incube as placas por uma hora à temperatura ambiente. Depois, aspire imediatamente a proteína gelatinosa logo antes de semear as células e lave com DMEM F12. Enquanto essa placa estiver sendo revestida, selecione uma placa onde as hPSCs apresentem aproximadamente 80% de confluência.

Prossiga com a aspiração do meio de hESC. Em seguida, lave as células com PBS. Após a remoção do PBS, adicione três mililitros de tripsina-EDTA 0,05% à placa.

Prossiga agitando vigorosamente a placa horizontalmente por dois minutos até que os MEFs sejam observados ao microscópio começando a se desprender como células isoladas. Durante esse período, espera-se que as colônias de hPSCs permaneçam aderidas à placa. Prossiga com a aspiração da tripsina assim que os MEFs se desprendem, mas antes que as colônias de hPSCs se soltem.

Em seguida, adicione à placa 10 mililitros de meio para hESC contendo 10 micromolares de Y-27632 diidrocloridrato, um inibidor de ROCK. Depois, desprenda as células pipetando para cima e para baixo sobre as colônias. A seguir, retorne à placa com uma proteína gelatinosa e aspire a solução.

Lave esta placa com DMEM F12 para remover quaisquer agregados. Em seguida, plaque as hPSCs nesta placa numa proporção de 1 para 2. Depois, adicione ao poço meio para hESC contendo 10 micromolares de Y-27632 diidrocloridrato até completar 10 mililitros.

Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite. Alimente as células diariamente com meio suplementado com inibidor de ROCK. Quando as hPSCs atingirem 80% de confluência, prossiga para iniciar a diferenciação neural e designe este ponto temporal como Dia 0.

Para iniciar a diferenciação, alimente as células no Dia 0 e Dia 1 com 10 mililitros de meio de diferenciação KSR contendo 100 nanomolar de LDN-193189, um inibidor de BMP, e 10 micromolar de SB 431542, um inibidor de activina e Nodal. No Dia 2, prossiga substituindo o meio por outro contendo as mesmas concentrações dos inibidores de BMP e de activina e Nodal, além de 3 micromolar de CHIR99021, um agonista de Wnt. Em seguida, no Dia 3, alimente as células com meio de diferenciação KSR suplementado apenas com 10 micromolar de SB 431542 e 3 micromolar de CHIR99021.

Após preparar uma mistura do meio de diferenciação 75%KSR e do meio de diferenciação 25%N2, que também contém três micromolares do agonista Wnt. Alimente as células com 15 mililitros desse líquido no Dia 4 e 5. Em seguida, nos Dias 6 e 7, alimente as células com 15 mililitros de meio constituído por 50% do meio de diferenciação KSR e 50% do meio de diferenciação N2, que também foi suplementado com três micromolares de CHIR99021, 25 nanogramas por mililitro de BMP4 e 100 nanomolares de EDN3.

Em seguida, nos Dias 8 e 9, alimente as células com 20 mililitros de meio de diferenciação 25%KSR e 75%N2 suplementado com as mesmas concentrações de fatores utilizadas nos Dias 6 e 7. Prossiga com a diferenciação neural no Dia 10, alimentando as células com 20 mililitros de meio de diferenciação N2 contendo três micromolares de CHIR99021, 25 nanogramas por mililitro de BMP4 e 100 nanomolares de EDN3. No Dia 11, aspire a solução dos recipientes previamente revestidos com lâmina 1 de poliornitina e fibronectina.

Em seguida, deixe as placas descobertas em uma câmara de cultura de tecidos por aproximadamente 10 a 15 minutos, permitindo que sequem completamente. Prossiga removendo o meio das células do dia 11 e lave-as com PBS. Em seguida, adicione quatro mililitros de solução de desanexação celular ao recipiente e incube a 37 graus Celsius por 25 minutos.

Após a incubação, adicione cinco mililitros de meio completo para melanócitos à placa. E ressuspenda as células pipetando manualmente para cima e para baixo até que se desprendam da placa. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células por cinco minutos a 200 ×g. Após a contagem celular utilizando exclusão com azul de tripano e um hemocitômetro, ressuspenda-as em meio completo para melanócitos numa densidade de 2×10⁶ células por mililitro.

Plaque gotas de 10 microlitros da suspensão celular sobre as placas secas e revestidas. Certifique-se de que as gotas estejam próximas umas das outras, mas sem se tocarem, tenham bordas bem definidas e não escorram. Para permitir que as células adiram, deixe as gotas em repouso à temperatura ambiente por 10 a 20 minutos.

Em seguida, adicione lentamente 10 mililitros de meio completo para melanócitos à placa, tomando cuidado para não perturbar as células aderidas. Depois, transfira a placa para o incubador. Alimente as células a cada dois ou três dias com meio completo para melanócitos.

E espera-se observar pigmentação em aglomerados de células ao final da primeira semana. Uma vez por semana, realize o repique celular associando-as primeiramente à solução de desanexação celular, conforme descrito anteriormente. Após coletar e centrifugar as células, lave-as duas vezes com meio neurobasal simples.

Em seguida, replaque as células em uma proporção de um para seis em meio completo para melanócitos em placas revestidas com PO, lâmina 1 e fibronectina. Após cerca de 30 dias de diferenciação, as células apresentarão pigmentação intensa, o que é facilmente visualizado quando cultivadas em alta densidade ou quando centrifugadas durante a repicagem.

É mostrada aqui uma imagem em campo claro de células de uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas transgênicas psox10 GFP cultivadas até o Dia 11 do protocolo de diferenciação descrito, antes de as células serem replantadas. Evidentes nestes cultivos estão cordões celulares escuros e bem definidos. Quando esses cultivos foram avaliados quanto ao sinal GFP, os cordões escuros mostraram enriquecimento por células positivas para sox10.

Como a sox10 é um fator de transcrição regulado positivamente por células-tronco da crista neural e mantido nos melanoblastos, esses resultados sugerem que, no Dia 11, este método de diferenciação enriqueceu células que eventualmente darão origem aos melanócitos. Como evidência disso, no Dia 20 do protocolo, os cultivos continham melanócitos não pigmentados, em maturação e totalmente maduros com pigmentação. No Dia 25, os mesmos tipos de células são observados nos cultivos.

A presença de melanócitos em maturação e pigmentados nestas preparações é confirmada por meio de coloração com duas proteínas envolvidas na produção de melanina. A TYRP2, que atua como marcador tanto de melanoblastos quanto de melanócitos, e a TYRP1, que é um marcador tardio de melanócitos expresso apenas nos melanócitos pigmentados. Uma vez dominado, este protocolo pode ser empregado para diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em melanócitos maduros e totalmente pigmentados em 25 dias.

O protocolo avança através do desenvolvimento normal dos melanócitos, passando primeiro pelo estado de crista neural e também pela fase de melanoblasto.