Name: Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliais nasais de crianças e reprogramá-las em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Este método não invasivo permite estudar asma e doenças respiratórias em modelos in vitro.

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Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Stem Cell pluripotentes ea Imagem Confocal Núcleo do Hospital Infantil de Cincinnati. Este trabalho foi apoiado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

O protocolo a seguir segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana instituições. 1. A amostragem da mucosa nasal NOTA: obter amostras de indivíduos que estão livres de sinais de infecção viral respiratória. <ol><li> Prepare um 15 ml fresco cónica antes da visita participante e adicionar 2 ml BEGM (brônquica epitelial Médio celular Crescimento) mais 20 ul estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). </li><li> Abrir escova de citologia pouco antes de tomar a amostra, e não se esqueça de manter a escova estéril e não tocá-lo para qualquer superfície, além das superfícies nasais. </li><li> Peça ao participante para ficar parado e incline a cabeça para cima em direção teto. Têm menor ou mais crianças inquietas se sentar em suas mãos e / ou deitado para evitar golpear escova de distância. </li><li> Aponte escova na parte de trás do nariz, onde a passagem estreita (Parece que um pequeno buraco negro). Deslize a escova para baixo e torcer pulsos enquanto o pincel é removido nostrieu. </li><li> Coloque a escova no cônica e submergir em BEGM. Corte o excesso de escova e recoloque a tampa no tubo. NÃO VORTEX. NOTA: Se o participante está disposto, obter uma segunda escova da mesma maneira, mas no segundo narina. A obtenção de uma escova de ambas as narinas vai resultar em uma maior probabilidade de que a amostragem será bem sucedida. Amostragem do mesmo narina pode resultar em sangramento e não irá provavelmente aumentar a amostra. </li><li> Manter as amostras como perto de 37 ° C quanto possível durante o transporte usando um copo com água morna. </li></ol> 2. Contagem de Células e Cytospin <ol><li> Agite suavemente o pincel na BEGM e tomar 10 ml da amostra para uma contagem de células usando um hemocitômetro. Adicionar 10 ml de uma mancha ao vivo / morto e contar apenas células vivem sob um microscópio. </li><li> Tomar 50 ul de amostra e dilui-se para 200 mL com PBS 1x. Adicionar ao funil cytospin ligado a lâmina de vidro e girar a 300 rpm durante 2 min. Vamos deslizar O N e mancha de slides / dry following instruções do fabricante. Deixar secar S / N, de preferência no escuro. </li><li> Deslize mancha com Hema 3 Stain <ol><li> Transfira cada solução (Hema fixador, azul claro; Solution Hema 3 I, rosa, e Hema 3 Solução II, azul profundo) em uma placa de coloração; Manter coberto quando não estiver em uso. Inserir slides em slides barco coloração </li><li> Dip slides continuamente em fixador durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso escorra para. Dip desliza continuamente em Solução I durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso escorra para. Dip desliza continuamente na solução II durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso de drenar </li><li> Enxágüe com água deionizada até que a água corre claro. Deixar secar S / N, de preferência no escuro </li></ol></li><li> Olhe para a corrediça sob o microscópio células e contagem, determinar porcentagem de células epiteliais. Deve ser de 90% ou mais se a amostragem é boa. </li></ol> 3. Células Sementeira NOTA: Realizar todos os procedimentos de cultura de células em uma cultura de tecidos adequada e certificadaexaustor com técnica estéril. <ol><li> placas de revestimento com Bovine Collagen dérmica (BDC), tipo 1. Adicione 0,5 ml de 3 mg / ml BDC diluído em 49,5 ml de 1x PBS. Prepare menos se será utilizado apenas algumas placas. Revestimento um frasco T25 com 2 ml BDC e incubar em estéril capa O / N ou a 37 ° C durante 2 horas, se necessário. </li><li> Após a incubação, aspirar o líquido restante. Expor frascos à luz UV durante 30 minutos na capa estéril. frascos para armazenar até um mês a 4 ° C, mas trazê-los à temperatura ambiente ou 37 ° C antes de semear as células. </li><li> Mantenha a escova e em células BEGM a 37 ° C até estar pronto para semear. Escove suavemente swish dentro cônica, mas não vórtice. <ol><li> Placa de 7 x 10 5 células em um frasco T25. Se houver menos, utilizar um recipiente mais pequeno, tal como um poço de uma placa de 6 poços. Esta placa de tamanho requer cerca de 3 x 10 5 células. NOTA: Se não houver esta quantidade de células, não é aconselhável para continuar. </li></ol></li><li> Sob um capuz estéril, leve escova fora do tubo e gently girar escova na superfície do frasco revestido, tomando cuidado para não riscar o revestimento. Descarte pincel em um recipiente de risco biológico apropriado. </li><li> Lentamente pipetar as células restantes em BEGM fora da cónica e para o balão T25. Observar as células ao microscópio. Um número de células flutuantes serão observados e pode haver alguns detritos a partir do nariz, o que é aceitável nesta fase (Figura 3A). </li></ol> Cultura 4. celular <ol><li> Depois de células semear, deixá-los se contentar com 48 horas sem interrupção (Figura 3). Após 48 horas, lenta e suavemente adicionar 2 ml quente BEGM e 20 mL estéril penicilina / estreptomicina / Fungizone (P / S / F). NOTA: NÃO aspirar os originais 2 ml de mídia. </li><li> No 4º dia após a sementeira, aspirar cuidadosamente todo o líquido, e substituir com 4 ml fresco, aquecida BEGM mais 1x Pen / Strep (fungizona não é mais necessário). Mudança de mídia a cada dois dias e avaliar células para anexarmento, crescimento e confluência. Quando as células atingem ~ 80% de confluência, geralmente em 2-3 semanas, eles estão prontos para ser passado. </li><li> Um balão T25 (cerca de 2,5 X 10 6 células quando confluentes) podem ser passadas para frascos T25 três ou um frasco T75. Após a primeira passagem, as células devem ser robusto e saudável, atingindo confluência a cada três dias. </li></ol> 5. As células Passaging <ol><li> Aspirar cuidadosamente a mídia a partir da placa. Adicionar 1 ml de solução de 0,05% de tripsina por frasco T25 a placa e lugar na incubadora durante cerca de 4 min, ou até que as células separar da placa. Verifique o nível de desprendimento de células a cada 2 min e não deixe de tripsina em mais de 10 min. </li><li> Adicionar 5 ml de tripsina Neutralizante Solution (TNS), ou a mídia contendo soro para neutralizar a enzima. Retire todo o líquido e as células do frasco e coloque em um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifuga-se a 200 x g (aceleração desaceleração 0 0) durante 5 min para obter um pellet de células. Aspirar supernatant células e ressuspender em BEGM + P / S no volume necessário para os novos frascos (4 ml para um frasco T25, 10 ml para um frasco T75) </li><li> Efectuar a contagem de células com um corante vivo / morto, tal como descrito acima (2,1). Adicionar uma quantidade adequada de células BEGM e para os frascos revestidos e retornar para a incubadora. Manter como detalhado acima ou criopreservar em meio de congelação (70% BEGM, 20% de FBS e 10% de DMSO) a uma concentração de 0,5-2 x 10 6 culas por ml. </li></ol> 6. A reprogramação para iPSCs NOTA: Antes de gerar iPSCs, garantir a adesão a todas as normas institucionais que regem a produção ea utilização de iPSCs humanos. técnica estéril é especialmente importante para as culturas IPSC, como meio de cultura não rotineiramente contêm antibióticos. É fundamental que NECs parecem saudáveis ​​e são robustamente proliferativa para a reprogramação de sucesso. <ol><li> Placa de 5 x 10 5 CNE por poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Após 24 horas, adicionar polibrenopara BEGM a uma concentração final de 8 mg / ml e transdução NECs adicionando partículas lentivirais expressando Oct4, Sox2, KLF4, c-Myc para a mídia. Destinam-se a conseguir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ~ 27. <ol><li> Para a determinação do MOI, preparar diluições em série do stock concentradas-lentiviral e transduzir células HT1080 com estas diluições. Após a primeira inequivocamente a detecção de expressão dTomato nas células HT1080, calcular o número de &quot;unidades de transdução / mL&quot;, marcando o número de células positivas / dTomato pequenos aglomerados de células em cada diluição. NOTA: Normalmente, haverá diluições que são demasiado elevados (tudo é dTomato positivo) e muito baixa (nenhum ou apenas um par de células positivas). </li><li> Execute pontuação das diluições em que as células positivas discretas / pequenos aglomerados de células é identificada. Determinar o título corrigindo o número de transduzir unidades / ml com o factor de diluição apropriado. MOI é, em seguida, a relação entre o númerode células transduzidas com o número de partículas de vírus 27. NOTA: Cada dTomato celular positiva / pequeno grupo é assumido a surgir a partir de uma única partícula de vírus. </li></ol></li><li> Cerca de 3 horas após a transdução, remova a mídia e substituir com BEGM fresco. Descarte de mídia contendo Lentivírus usando procedimentos institucionalmente aprovados. Retorno CNE transduzidas para a incubadora durante 3 dias. </li><li> No dia 3, substituir a mídia com BEGM frescos, e, em seguida, incubar por mais 3 dias. Aspirar gasto meios, lavar as células com PBS 1x e adicionar 1 ml de 0,05% de solução de tripsina para o poço. células de passagem com tripsina como escrito acima (seção 5). Aspirar cuidadosamente as células sobrenadante e ressuspender em 4 ml BEGM + P / S. As células podem ser passadas para um novo poço de uma placa de 6 poços revestidas com BDC, ou adicionados a culturas MEF, se pronto (ver próximo passo). </li><li> Prepare placas revestidas MEF. No dia 4 adicionar solução de gelatina a 0,1% (1 ml / poço) para 2 poços de uma 6 bem (para realizar +/- Thiazovivin (SPT) veja o passo 6.6). Na próximadia, descongelar um frasco de MEFs inativadas 28. </li><li> Coloque MEFs em 10 ml de meio DMEM + MEF (1x NEAA + 10% de dFCS). Centrifugação a 200 xg durante 5 min para sedimentar. Ressuspender em media MEF. Gelatina aspirado a partir da placa de 6 poços e adicionar 1,87 x 10 5 MEFs por poço da placa de 6 poços revestidos com gelatina. Incubar O / N a 37 ° C, ou para um mínimo de 24 hr. </li><li> Transferir 2 ml de BEGM contendo células transduzidas por poço em 2 poços de uma placa de 6 poços previamente revestidas e incubar O / N. No dia seguinte, substituir BEGM com 2,5 ml por poço de meio de células estaminais embrionárias humanas normais que contêm o factor de 4 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico. Alimentar as células com a mídia CTEh fresco +/- SPT dia durante 10 dias NOTA: É possível adicionar um cocktail de pequenas moléculas (SB431542, PD0325901 e Thiazovivin () cocktail SPT) para melhorar a eficiência e cinética de reprogramação para NECs 23. </li><li> Depois de dez dias, continuar a alimentar diária usando a mídia hESC sem SPT. Alimente culturas diariamente até colónias hESC-likeaparecer (Figura 5A, P0 colónia). Identificar colônias que abrigam iPSCs putativos por sua alta núcleo: relação citoplasmática e nucléolos proeminentes. </li><li> Manualmente especiais de consumo e de transferência de colónias com morfologia hESC-like para separar poços para a cultura e expansão como linhas separadas em um sistema de livre-alimentador. colónias excisadas deve adaptar-se rapidamente a estas condições. <ol><li> Depois de colônias chapeamento excisadas estas linhas IPSC putativos discretos são agora considerados passagem 1 (P1). culturas diário de ração com mTeSR1. Passagem e expandir linhas de IPSC, utilizando procedimentos padrão. Pode demorar vários dias a uma semana para as colónias p1 para alcançar o tamanho em que eles devem ser passadas. </li></ol></li></ol> 7. Manutenção iPSCs em Cultura <ol><li> Alimentar e avaliar culturas diariamente. Manualmente áreas especiais de consumo exibindo diferenciação ostensiva raspando com uma pipeta de vidro esterilizada ou ponteira micro. Mudança de mídia após a colheita diária. </li><li> células de passagem após approximamadamente, de quatro em quatro dias: meios delicadamente aspirado, adicionar 1 ml de dispase quente (1 mg / ml) por poço de uma placa de 6 poços (metade do volume de alimentação), em seguida, incuba-se a 37 ° C durante cerca de 4 min. As bordas das colônias vai começar a levantar, que se parece com um esboço branco ao redor da colônia. Suavemente aspirar o Dispase e lavar 3x com aquecida DMEM / F12. </li><li> Adicionar 2 ml mTeSR1 e utilizar um elevador de célula para levantar as colónias da placa. Use uma pipeta de 5 ml serológicos ou micropipeta P1000 para triturar suavemente as células até que as colônias são divididos em grupos menores. <ol><li> Evite produzindo muito pequenos grupos ou células individuais, como a sobrevivência e proliferação subsequente será sub-óptima. Quando re-plaqueamento colónias, uma mistura 1: 4 a 1: 6 de divisão vai manter a densidade óptima de colónias. Remova cuidadosamente colônias e mídia da placa e adicione aos poços novos, revestidos com Matrigel. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Células epiteliais nasais (CNE) são uma plataforma acessível para o estudo de doenças das vias respiratórias, e NEC-iPSCs oferecer uma avenida emocionante para explorar o desenvolvimento da doença, tratamento e terapia 1,31,32. CNE pode ser facilmente obtida sem procedimentos prejudiciais estressantes ou potencialmente 6,23. Em nossa experiência, a amostragem da mucosa nasal, como descrito neste protocolo parece ser menos estressante e melhor percepção do que a coleta de sangue para as crianças. Po...

Induzidas células-tronco pluripotentes a partir de amostras humanas (hiPSCs) são uma tecnologia em rápido desenvolvimento da investigação sobre células estaminais. Eles oferecem uma alternativa à investigação em células estaminais embrionárias (hESC) com muito menos inconvenientes éticos e morais 1,2. Embora eles não são idênticos epigeneticamente para hESCs 3-5, hiPSCs oferecer uma forma única para o modelo de desenvolvimento de doença e fenótipos, e eles podem ser derivados a partir de tecidos relevantes para o estado de doença 5-8. Novos métodos de hiPSCs geradoras estão constantemente a ser explorado para identificar tipos de células ideais para começar, como uma maneira de se preparar iPSCs GMP-qualidade adequados para transplante, e também para aumentar a prontidão ea eficiência do processo de reprogramação 6,9-11. As células epiteliais das vias respiratórias são críticos no desenvolvimento de inflamação alérgica 12, e o epitélio é um importante factor de respostas alérgicas das vias aéreas e a remodelação através da interacção com Immune estromais e células. O epitélio das vias aéreas desempenha um papel essencial na origem e persistência de doenças pulmonares como a asma. No entanto, as células epiteliais das vias aéreas inferiores são difíceis de obter em um ambiente clínico, especialmente a partir de pacientes de controle saudáveis ​​e crianças. Dados de vários estudos apoiam a premissa de que as células epiteliais da mucosa nasal são uma procuração válida e prático para as vias aéreas inferiores células epiteliais 13-20, especialmente quando se estuda as respostas a poluentes do ar e alérgenos. A mucosa nasal é composto de células epiteliais das vias aéreas ciliada mais de 90% e amostragem dessas células epiteliais nasais (CNE) podem ser facilmente realizados em crianças a partir dos quatro anos de idade ou cinco, como é menos invasivo do que outras técnicas de amostragem de células / tecidos e é associado com um risco mínimo de efeitos adversos, como infecção 20-23. Ele oferece uma maneira rápida e simples para provar as crianças saudáveis ​​e doentes sem tempo, desnecessário e muitas vezes dolorosa procedu broncoscopiares que necessitem de sedação. Estudos anteriores mostraram que os subtipos de doença relacionados com a gravidade da asma podem ser distinguidos em ambos da mucosa nasal, bem como amostras de células bronquiais tomadas a partir de crianças asmáticas, e a expressão do gene entre os dois tipos de tecidos foi semelhante em cerca de 90% dos genes não ubíquos 22 , 24. Como fonte para iPSCs, CNE oferecer vantagens sobre outros tipos de células frequentemente utilizados. Os fibroblastos são muitas vezes utilizados para a geração de CIPS, mas apesar dessas células pode facilmente ser cultivada a partir de uma biópsia da pele, este processo normalmente requer anestesia local, uma incisão, e suturas, e está associada a um certo risco de infecção. Portanto, a obtenção de consentimento informado dos pacientes para este tipo de biópsia pode ser difícil 25. Uma alternativa para os fibroblastos são as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). No entanto, pode ser difícil de obter sangue suficiente para geração iPSC de pacientes pediátricos. Além disso, há limitações de AP jusanteplicações para fibroblastos e iPSCs de glóbulos derivados, especialmente sua capacidade de diferenciação de certos tipos de células 5,26. Portanto, dada a acessibilidade relativa e o baixo risco de efeitos colaterais após a colheita, NECs representam uma fonte de células ideal para a geração de iPSC de populações pediátricas. iPSCs têm recebido muita atenção recentemente como uma plataforma para o estudo do desenvolvimento humano, gerando novos modelos de doenças, e como uma fonte potencial de células para terapias personalizadas. Antes de todo o potencial desta tecnologia pode ser realizado, as bases moleculares do processo de reprogramação precisam ser elucidadas, mas por agora este protocolo e os procedimentos descritos no prazo irá elucidar os estudos de pesquisa voltadas para as exposições das vias aéreas, bem como fornecer uma plataforma para estudar os efeitos da medicina personalizada envolvendo iPSCs. O trabalho colaborativo de vários laboratórios levou à generatioN de uma técnica bem sucedida, não só para a amostragem da mucosa nasal, mas também a cultura CNE, e reprogramar essas células para iPSCs 23. Este artigo fornece um esboço de um protocolo de amostragem ideal, cultura e condições de reprogramação.

<table><tbody><tr><td>Protocolo cônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td> de 15 ml <td>Etapa 1.1.</td></tr><tr><td>Protocolo BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Etapa 1.1.</td></tr><tr><td>Penn / Strep / Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocolo Etapa 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocolo Etapa 4.a.</td></tr><tr><td>escova de citologia cytosoft</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocolo Etapa 1.2.</td></tr><tr><td>azul de tripano</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocolo Etapa 2.1.</td></tr><tr><td>hemacitômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocolo Etapa 2.1.</td></tr><tr><td>Protocolo PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Etapa 2.2.</td></tr><tr><td>Clipes de funil de citologia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocolo Etapa 2.2.</td></tr><tr><td>funil de cytospin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocolo Etapa 2.2.</td></tr><tr>Protocolo <td>de A78300003</td><td>Científica Fisher</td> <td>Cytospin 4</td><td>Etapa 2.2.</td></tr><tr><td>slide em branco</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocolo Etapa 2.2.</td></tr><tr><td>kit de coloração hema 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocolo Etapa 2.2.</td></tr><tr><td>Colagen dérmico bovino, tipo 1</td><td>tecnologias da vida</td><td>A1064401</td><td>Protocolo Etapa 3.2.</td></tr><tr><td>Frasco T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocolo Etapa 3.3.</td></tr><tr>Etapa <td>5.2 do protocolo</td> <td>de Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td>.</tr><tr><td>Solução Neutralizante de Tripsina</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocolo Etapa 5.2.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS), esterilizado por calor a 65 graus; C por 30 min</td><td>Protocolo Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Etapa 5.5.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Hybri-Max&trade;, filtrado estéril, BioReagent, adequado para hibridoma, &ge; 99,7%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protocolo Etapa 5.5.</td></tr><tr><td>lentivírus policistônico*</td><td>e.g. Millipore</td><td>SCR511</td><td>Etapa 6.4.&nbsp; Uma fonte comercial de vetor de reprogramação é listada. Usamos rotineiramente o plasmídeo 4 em 1 relatado por Voelkel et al (PMID: 20385817) para gerar lentivírus de reprogramação policistrônica pseudotipado VSV-G internamente. Este plasmídeo pode ser obtido por contato&nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocolo Etapa 6.4.</td></tr><tr><td>MEFs CF1 irradiados</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>Protocolo GSC-6301G</td><td>Etapa 6.4.</td></tr><tr><td>Mídia hESC</td><td>Veja a receita incluída no protocolo</td><td></td><td>Etapa 6.11 do protocolo.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Etapa 6.11 do protocolo.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Etapa 6.11 do protocolo.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protocolo Etapa 6.11.</td></tr><tr>Protocolo de <td>354277</td> <td>Matrigel BD Biosciences qualificado para hESC</td><td></td><td>Etapa 6.13.</td></tr><tr><td>Placa de Corning, 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocolo Etapa 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Protocolo Etapa 6.13.</td></tr><tr><td>Balão filtrante descartável de 250 ml (0,22 &micro; m)</td> <td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocolo Etapa 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protocolo Etapa 7.3.</td></tr><tr><td>levantador de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocolo Etapa 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Etapa 6.11. componentes devem ser misturados e, em seguida, esterilizados por filtro. A mídia pode ser mantida em 4 &deg; C por até duas semanas. Ao aquecer o meio, não deixe a 37 &graus; C mais de 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 mídia</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Concentração Final KO</td></tr><tr><td>sérum de reposição (KO-SR)</td> <td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0,2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-mercaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>100x aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &micro; g/ml Fator de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultivar células primárias nasal epiteliais de crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

As células epiteliais nasais (ECNs) são a parte das vias aéreas que responde aos poluentes atmosféricos e são as primeiras células infectadas com vírus respiratórios. Eles também estão envolvidos em muitas doenças das vias aéreas por meio de sua resposta imune inata e interação com células imunológicas e estromais das vias aéreas. Os NECs são de particular interesse para estudos em crianças devido à sua acessibilidade durante as visitas clínicas. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram geradas a partir de vários tipos de células e são uma ferramenta poderosa para modelar o desenvolvimento humano e a doença, bem como para suas aplicações potenciais na medicina regenerativa. Este é o primeiro protocolo a estabelecer métodos para a geração bem-sucedida de iPSCs a partir de NECs derivadas de participantes pediátricos para fins de pesquisa. Ele descreve como obter células epiteliais nasais de crianças, como gerar culturas primárias de NEC a partir dessas amostras e como reprogramar NECs primárias em iPSCs bem caracterizadas. Amostras de mucosa nasal são úteis em estudos epidemiológicos relacionados aos efeitos da poluição do ar em crianças e fornecem uma ferramenta importante para o estudo de doenças das vias aéreas. As células nasais primárias e as iPSCs derivadas delas podem ser uma ferramenta para fornecer material ilimitado para pesquisas específicas do paciente em diversas áreas da biologia epitelial das vias aéreas, incluindo pesquisa de asma e DPOC.

A parte inicial do nariz, chamado de vestíbulo nasal, é a área cercada por cartilagem 29. A escova tem de ir suavemente passado esta área do nariz, para além da válvula nasal (ostium internum, ou o &quot;buraco negro&quot; visto na parte de trás da narina), e a amostra é obtida a partir da concha inferior (Figura 1). As conchas nasais são estruturas ósseas que aumentam a área da superfície do nariz 29, o que os torna um local ideal para a amostragem...

Esta publicação demonstra métodos para amostragem e cultura bem-sucedidas da mucosa epitelial nasal de crianças e reprogramação dessas células para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células epiteliais nasais obtidas de crianças e reprogramá-las em células-tronco pluripotentes induzidas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das doenças aeradas, como o desenvolvimento da asma. A principal vantagem desta técnica é que ela permite coletar células epiteliais das vias aéreas de crianças sem procedimentos estressantes.Em cultura, essas células formam uma população homogênea e servem como uma excelente fonte para gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSCs. Tivemos pela primeira vez a ideia para este estudo quando conversamos com os doutores Ji e Hershey sobre seu estudo para coletar células mesoepiteliais de crianças a fim de investigar a variação epigenética na asma e na poluição do ar.A demonstração visual dessas técnicas é fundamental porque a coleta nasal e o reprogramamento para iPSCs de células epiteliais nasais são técnicas difíceis de aprender, já que se baseiam em experiência pessoal e não em protocolos estabelecidos. Antes da visita do participante, transfira dois mililitros de meio de crescimento fresco para epitélio brônquico, abreviado como BEGM, para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione a este meio 20 microlitros de uma mistura de penicilina, estreptomicina e anfotericina B até uma concentração final de 0,01%. Quando o participante chegar, oriente-o a sentar-se em uma cadeira.Em seguida, abra uma escova citológica imediatamente antes de coletar a amostra, e não a toque em nenhuma superfície para garantir que permaneça estéril. Prossiga instruindo o participante a permanecer imóvel e a inclinar a cabeça para cima, em direção ao teto. Se estiver inquieto, peça para sentar sobre as próprias mãos, para que não tente afastar a escova.Em seguida, direcione e insira a escova até a parte posterior do nariz, onde a passagem se estreita. Depois, remova a escova da narina deslizando-a para baixo com um movimento de torção do punho. Prossiga colocando a escova no tubo cônico previamente preparado e certifique-se de que ela esteja submersa no BEGM.Em seguida, corte a parte excedente da escova e fixe a tampa no tubo. Após a coleta da amostra, coloque-a imediatamente em um béquer contendo água morna, mantendo-a o mais próximo possível de 37 graus Celsius. Em seguida, transporte-a para o laboratório.Uma vez no laboratório, agite suavemente a escova no BEGM. Em seguida, retire 10 microlitros da amostra e adicione 10 microlitros de um corante para células vivas/mortas. Prossiga introduzindo essa mistura em um hemocitômetro.E conte apenas as células vivas sob um microscópio. Após a contagem celular, retire 50 microlitros da amostra e prossiga para diluí-la até 200 microlitros com PBS 1X. Transfira o restante da mistura celular não diluída, juntamente com a escova, para um banho-maria regulado a 37 graus Celsius até o semeadura celular.Prossiga adicionando a amostra diluída em PBS ao funil de citocentrifugação acoplado a uma lâmina de vidro. Em seguida, gire todo o aparelho a 400 rpm durante dois minutos. Depois, remova o funil e deixe a lâmina secar durante a noite no escuro.Após a coloração da lâmina com Hema 3, conforme discutido no protocolo do texto, observe-a ao microscópio e conte as células. Identifique as células epiteliais por suas características únicas: forma colunar, cílios e um único núcleo arredondado, e determine a porcentagem dessas células na preparação.Para iniciar a semeadura, gire suavemente a escova dentro do tubo cônico em uma cabine de cultura celular certificada e, em seguida, remova-a do tubo. Depois, gire suavemente a escova sobre a superfície interna de um frasco T25, previamente revestido com colágeno dérmico bovino, tomando cuidado para não arranhar o revestimento. Em seguida, descarte a escova em um recipiente apropriado para resíduos biológicos.Pipete lentamente as células restantes em BEGM do tubo cônico para o frasco T25, pelo menos 7 vezes 10 à quinta células. Prossiga para observar as células em um microscópio invertido. Após o cultivo e a repicagem das células, conforme descrito no texto, prossiga para semear 5 vezes 10 à quinta células epiteliais nasais em dois mililitros de BEGM por poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços.Em seguida, incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, certifique-se de que as células estejam proliferando robustamente. Em seguida, adicione Polibreno a cada poço contendo BEGM até uma concentração final de oito microgramas por mililitro em capela de exaustão.Prossiga para transduzir as células epiteliais nasais adicionando partículas lentivirais, expressando Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc ao meio em cada poço, conforme discutido no protocolo no texto. Após incubação das células transduzidas por aproximadamente três horas, remova o meio contendo o vírus e descarte-o, utilizando procedimentos aprovados pela instituição. Em seguida, substitua este meio por BEGM e retorne as células epiteliais nasais transduzidas ao incubador.Após três dias, substitua o meio por BEGM fresco. Em seguida, incube as células transduzidas nas mesmas condições. No dia seguinte, adicione solução de gelatina a 0,1% a duas cavidades de uma placa de seis poços para começar a preparar placas revestidas com fibroblastos embrionários de camundongo.Em seguida, cubra a placa com sua tampa correspondente e incube-a durante a noite a 37 graus Celsius. No quinto dia, descongele um frasco contendo aproximadamente 5 vezes 10 à quinta fibroblastos embrionários de camundongo inativados, abreviados como MEFs. Em seguida, coloque essas células em 10 mililitros de meio para MEFs.E proceda com a centrifugação a 200 x g durante cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e re-suspenda os MEFs no mesmo meio. Após a contagem dessas células, aspire a solução de gelatina da placa de seis poços previamente preparada.Em seguida, adicione 1,87 vezes 10 à quinta MEFs em cada poço do placa revestido com gelatina e incube a 37 graus Celsius por um mínimo de 24 horas. Então, no sexto dia de cultivo, aspire o meio usado das células transduzidas e lave-as com PBS 1X. Em seguida, adicione um mililitro de solução de tripsina a 0,05% em cada poço da placa.Após as células serem destacadas, prossiga com a neutralização usando solução neutralizante de tripsina ou TNS, em seguida colete e centrifugue as células conforme discutido anteriormente. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em quatro mililitros de BEGM, suplementado com penicilina e estreptomicina. Prossiga introduzindo dois mililitros dessa suspensão celular em cada poço revestido com gelatina e MEF da placa previamente preparada.Após incubar as células durante a noite, substitua o BEGM por 2,5 mililitros de meio padrão de células-tronco embrionárias humanas, abreviado como meio de hESC, contendo quatro nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos básico. Prossiga com o cultivo das células e alimente-as diariamente com meio fresco de hESC até que colônias semelhantes a hESC, abrigando células-tronco pluripotentes induzidas putativas, ou iPSCs, sejam observadas nos cultivos. Excise manualmente essas colônias e transfira-as para poços separados de uma placa de 24 poços, a fim de cultivá-las e expandi-las como linhagens independentes em um sistema livre de células de apoio.Inicialmente, as amostras nasais são uma mistura de tipos celulares e detritos. No entanto, após o cultivo e as trocas de meio, as células epiteliais tornam-se predominantes nessas preparações, conforme mostrado nesta imagem obtida um dia após a repicagem celular. Aqui, as células epiteliais, crescendo até a confluência, demonstram núcleos grandes e citoplasma alongado.Devido às propriedades das partículas lentivirais utilizadas neste estudo, quando essas células epiteliais nasais são transduzidas, elas expressam o marcador fluorescente tdTomato, conforme demonstrado pela imagem superior direita das células, quatro dias após a transdução. Uma comparação com a imagem correspondente em campo claro revela que nem toda célula apresenta sinal de tdTomato, como evidenciado pela imagem fusionada na parte inferior. Assim, nem todas as células são transduzidas.No entanto, a eficiência de transdução é de aproximadamente 90%. Quando as células epiteliais nasais transduzidas são cultivadas conforme descrito no protocolo, elas dão origem a colônias de iPSCs. Após a colheita das colônias de iPSCs e cultivo em condições padrão sem camada de alimentação, as células individuais nessas colônias demonstraram morfologia típica semelhante à de hESCs, como forma arredondada, núcleo grande e alta razão entre núcleo e citoplasma, conforme demonstrado nesta imagem ampliada. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora e meia, se executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de coletar a amostra corretamente, manter as células a 37 graus Celsius e semear-nas o mais rapidamente possível na densidade correta. Após este procedimento, outros métodos, como a montagem de uma interface ar-líquido utilizando células epiteliais nasais primárias, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como o epitélio respiratório responde a alérgenos e patógenos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores modelassem doenças como asma, DPOC e fibrose cística.Essa técnica também ajuda a estudar os efeitos ambientais no desenvolvimento pulmonar no sistema humano in vitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como cultivar células epiteliais nasais de crianças e gerar iPSCs a partir dessa população. Como trabalhamos com células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas, lembre-se de sempre seguir as diretrizes institucionais e nacionais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos aqui um método para biopsying mucosa olfativa de ratos e humanos cavidades nasais. Essas biópsias podem ser utilizados tanto para identificar anomalias molecular em doenças cerebrais ou isolar células-tronco adultas multipotentes que podem ser utilizados para o transplante de células em modelos animais de trauma cerebral / doença.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.

Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Reprogramação neuronal direta gera neurônios que mantêm a idade da célula somática inicial. Aqui, descrevemos um método baseado em vetor único para gerar neurônios induzidos de fibroblastos dérmicos obtidos de doadores humanos adultos.

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

Células Epiteliais Nasais Humanas Primárias: Biobanco no Contexto da Medicina de Precisão

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a cultivar células epiteliais nasais de crianças e reprogramá-las em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Este método não invasivo permite estudar asma e doenças respiratórias em modelos in vitro.

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

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