Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

O objetivo geral deste procedimento é controlar opticamente a função de uma proteína neuronal usando um aminoácido não natural geneticamente codificado nos neurônios. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a contribuição de uma proteína neuronal específica para a sinalização neuronal na função cerebral com resolução espaço-temporal. A principal vantagem desta técnica é que ela tem potencial para ser aplicada a várias proteínas neuronais para alcançar a regulação óptica de vários processos neuronais.

Comece este procedimento colocando os neurônios do hipocampo em lamínulas em uma placa de 24 poços com 500 microlitros de meio de crescimento, depois de filtrar através de uma malha de náilon de 40 micrômetros. Depois disso, incube a cultura neuronal a 35 graus Celsius em uma incubadora de cinco por cento de dióxido de carbono e 95 por cento de ar umidificado por 2 a 3 semanas. No dia da transfecção, faça uma solução fresca de cloreto de cálcio 2,5 molar em água bidestilada e filtre-a com um filtro de 0,22 micrômetro.

Em seguida, faça 2X BBS fresco a pH 7 e filtre-o estéril com um filtro de 0,22 micrômetro. Depois disso, substitua o meio de cultura por 500 microlitros de meio de transfecção fresco e pré-aquecido e não descarte o meio de cultura antigo. Prepare a solução de transfecção imediatamente antes de adicioná-la à cultura, combinando cloreto de cálcio e água bidestilada

Continue agitando o tubo e adicione lentamente DNA à solução. Em seguida, adicione 2X BBS buffer gota a gota. A preparação do tampão 2X BBS é uma etapa crítica na transfecção de fosfato de cálcio, e é uma boa ideia calibrar o pH ideal para o tampão 2X BBS entre 6,90 e 7,15 para novas construções ou preparações de DNA.

Em seguida, adicione imediatamente 30 microlitros da solução de transfecção a cada lamínula da cultura neuronal. Balance o prato de cultura algumas vezes para misturar a solução e incube-o a 35 graus Celsius por 45 minutos a uma hora. Após cerca de uma hora, uma camada de precipitados finos de fosfato de cálcio deve ser observada cobrindo os neurônios.

Em seguida, substitua o meio de transfecção por 500 microlitros de tampão de lavagem pré-aquecido e incube-o a 35 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Os precipitados de fosfato de cálcio devem desaparecer após a lavagem. Agora, substitua o tampão de lavagem por 500 microlitros de meio de crescimento fresco.

Depois, substitua a mídia de crescimento pela mídia original salva. Em seguida, adicione o aminoácido Cmn não natural pré-misturado em 50 microlitros de meio de crescimento quente à cultura, o que resulta em uma concentração final de um milimolar. Incube a cultura transfectada a 35 graus Celsius por 12 a 48 horas antes da gravação.

Neste procedimento, prepare as soluções extracelular e intracelular. Em nossa configuração, o LED com emissão de 385 nanômetros é instalado ao lado do microscópio para fornecer luz a um centímetro de distância do ponto focal em um ângulo de 45 graus. Em seguida, puxe algumas pipetas de remendo com um eletrodo de vidro usando um micro extrator de pipetas.

Depois, pegue uma lamínula de culturas de neurônios da incubadora e enxágue-a uma vez na solução extracelular. Profuse o equipamento com solução extracelular. Em seguida, coloque a lamínula na plataforma do microscópio de eletrofisiologia, usando técnicas padrão de fixação de patch.

Patch um neurônio transfectado com fluorescentes M-citrinas. Em seguida, registre a atividade neuronal usando o método de pinça de corrente. Primeiro, ajuste o potencial de repouso para cerca de 72 milivolts negativos.

Em seguida, injete uma corrente de passo para induzir o disparo contínuo de potenciais de ação de cinco a 15 Hertz. Durante a gravação, forneça pulsos de LED únicos ao neurônio e monitore as mudanças de seus potenciais de ação. Em seguida, adicione cloreto de bário 0,5 milimolar ao banho, para recuperar os potenciais de ação.

No cenário de corte cerebral agudo, remende um neurônio com fluorescentes GFP M-cherry da região neocortical. Em seguida, registre a atividade PIRK usando o método de rampa de tensão. Especificamente, monitore as correntes internas específicas do Kir2.1 em 100 milivolts negativos.

Em seguida, forneça pulsos de LED únicos ao neurônio durante a gravação e monitore se as proteínas PIRK estão ativadas. Uma vez que o PIRK é ativado, as correntes internas em 100 milivolts negativos aumentariam significativamente. No final, adicione cloreto de bário 0,5 milimolar ao banho e verifique se o PIRK está inativado.

Aqui são mostradas fotos exemplares de culturas neuronais saudáveis do hipocampo de ratos. E dois neurônios saudáveis exibindo corpos celulares rechonchudos e dendritos e axônios pronunciados. Estas são as imagens DIC e fluorescência de culturas de neurônios do hipocampo de ratos in vitro e transfectadas para expressão de PIRK sem CMN.

Na presença de um CMN milimolar, os neurônios transfectados são capazes de expressar proteínas PIRK M-citrinas de comprimento total, mostrando assim fluorescência verde. E aqui está um exemplo de um único pulso de luz, suprimindo a atividade de um neurônio do hipocampo expresso PIRK. Essas imagens de fluroescência de neurônios corticais embrionários de camundongos mostram a incorporação bem-sucedida de CMN nas proteínas GFP e Kir2.1 in vivo.

Neste gráfico, a ativação dependente de luz do PIRK é indicada nas correntes registradas dos neurônios neocorticais do camundongo. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças cerebrais causadas pelo mau funcionamento de proteínas neuronais específicas, por exemplo, Kir2.1 mutado na síndrome de Andersens, porque essa técnica ajuda a descobrir quais circuitos cerebrais são afetados por déficits de Kir2.1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para controlar a função das proteínas neuronais com luz em alta especificidade em neurônios vivos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como incorporar aminoácidos não naturais em proteínas em neurônios para obter controle fotográfico sobre proteínas neuronais de interesse.