Name: Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a controlar opticamente proteínas neuronais utilizando aminoácidos não naturais codificados geneticamente em neurónios do hipocampo. Esta técnica permite estudar funções proteicas com alta resolução espacial e temporal.

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Agradecemos ao Dr. S. Szobota pela discussão útil sobre cultura de neurônios e transfecção de Ca-P. L.W. reconhece o apoio do The Salk Innovation Grant, do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RN1-00577-1) e dos Institutos Nacionais de Saúde (1DP2OD004744).

Todos os procedimentos do presente estudo foram realizadas utilizando Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) aprovou protocolos para lidar com os animais no Instituto Salk para Estudos Biológicos, La Jolla, CA. Uaa 1. Incorporação em Kir2.1 e Expressão da resultante Pirk na cultura neuronal primária <ol><li> DNA Construção <ol><li> Selecione um local alvo de Kir2.1 relativamente à SAU incorporação. Explorar o conhecimento prévio e informações sobre a estrutura e função de Kir2.1, de modo que o local escolhido com o fotossensíveis Uaa Incorporated permite a modulação da função óptica Kir2.1 21. </li><li> Construir um gene de codificação de ADN recombinante Kir2.1 com o local escolhido mutado para o codão de paragem TAG âmbar. Use as técnicas de clonagem convencionais 25 para clonar o ADN Kir2.1-TAG num plasmídeo de expressão de mamífero. </li><li> genes / sintetase Clone tRNA que são específicos para a SAU e incorporar SAU em resposta ao codão de paragem TAG em outro plasmídeo de expressão de mamífero 21. Nota: Para incorporação óptima Uaa, diferentes promotores e combinações de cassetes de genes (para ARNt, sintetase, e Kir2.1) podem ser testados em diferentes plasmídeos. </li><li> Obter DNAs de plasmídeos de alta qualidade usando miniprep ou maxiprep kits comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Cerca de 1,9 do rácio 260/280 é óptima para o ADN purificado. Quando necessário, realizar uma eletroforese em gel de agarose para verificar a pureza do DNA preparado 25. DNAs de plasmídeos super-enrolados com elevado grau de pureza são os melhores para transfecção neuronal. </li></ol></li><li> Cultura Rat neurônios do hipocampo primária <ol><li> lamelas lugar de vidro (círculos, de 12 mm de diâmetro) em placas de 24 poços, uma lamela em cada poço, e revestimento de cada poço com 250 pL de 0,5 mg / ml de poli-D-lisina (em 100 mM de tampão de borato: 1,24 g bórico ácido e 1,90 g de tetraborato de sódio em 400 ml de s ionizada destilada H2O ou 2 DDH </sub&gt; S a pH 8,5) durante mais de 10 horas à temperatura ambiente, selada. Prepare cerca de 10-12 lamelas revestidas por filhote. </li><li> No dia da dissecção, coletar cérebros neonatais de filhotes de ratos pós-natal (1-4 dias pós-parto), depois de anestesiar-los com isoflurano e decapitar. Anestesiar as crias numa câmara contendo anestesiados com isoflurano (2-4%). Espere até que eles perdem a consciência e deixar de responder a estímulos tácteis e beliscar das patas. </li><li> Usando a técnica de padrão 26, dissecar hipocampo do cérebro em quente (~ 37 ° C), solução salina (HEPES a 10 mM e D-glicose 20 mM adicionado em solução salina equilibrada de Hank), e recolher hipocampos num tubo cónico de 4,5 ml de solução salina morna . </li><li> Adicionar 500 uL de 2,5% de tripsina para o hipocampo (0,25% de concentração final de tripsina), e incubar durante 10 min num banho de água a 37 ° C. </li><li> Enxaguar minuciosamente o tecido com solução salina (3 x 10 ml) e triturado. </li><li> Recuperar os neurônios dissociados em 1 ml wmeios de crescimento braço contendo Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS), mM de D-glucose 21,2, 2 mM de L-glutamina, 2% de B-27, e 0,1% de diluição de soro. Nota: Adicionar L-glutamina e B-27, no dia da dissecção para preparar o meio de crescimento fresco. </li><li> Contagem de neurónios com um hemocitómetro, e placa-los em lamelas em placas de 24 poços a 1,0-1,5 x 10 5 células / poço densidade com 500 ul de meio de crescimento depois de filtrada através de uma malha de nylon de 40? M. </li><li> Incubar a cultura neuronal, a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar humidif içado, durante incubadora 2-3 semanas. Para obter o melhor resultado, evitar perturbar a cultura, tanto quanto possível durante a incubação. </li></ol></li><li> O fosfato de cálcio (Ca-P) Transfecção de Cultura neuronal primária <ol><li> Fazer soluções de reserva e armazenar a 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hidroxi-etil] -2-aminoetanossulfónico ácido) tampão (10x); 150 mM de Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M de NaCl (10x); DDH estéril 2 O; estéril de NaOH 1 N. </li><li> No dia da transfecção, fazer fresco M de solução 2,5 CaCl 2 em ddH2O e filtro esterilizado com filtro de 0,22 um. Adicione fresco 2x BES-salino tamponado (BBS) tampão contendo BES 50 mM, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, e NaCl 280 mM a pH 7,00 (ajustar o pH com NaOH) e com o filtro estéril de 0,22 um filtro. Nota: Calcular a quantidade de solução de CaCl2 e o tampão BBS, dependendo do número de lamelas a ser transfectada. Também olhar para 1.3.4. </li><li> Substituir o meio de crescimento de cultura com 500 meios de crescimento transfecção pré-aquecido ul fresco. (Meio de transfecção pode ser feita com MEM mais mM de D-glicose 21,2). Nota: Não descarte a mídia. </li><li> Calcular a quantidade de ddH2O e preparar para adicionar, a fim de fazer a solução de transfecção (33 ul por cada lamela) contendo 1,65 mL de CaCl 2, 0,7 ug de ADN, e de 16,5 &amp;# 181; l 2x BBS. </li><li> Preparar a solução de transfecção imediatamente antes de o adicionar à cultura. Para se preparar, em primeiro lugar combinar CaCl 2 e ddH2O, enquanto lentamente agitando o tubo. Continuar a agitação e adiciona-se lentamente a solução de DNA em. Por último, adicione tampão 2x BBS gota a gota com agitação. </li><li> Imediatamente adicionar 30 ul da solução de transfecção para cada lamela de cultura neuronal. </li><li> Balance o prato de cultura de algumas vezes para misturar a solução e incubar a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar humidificado incubadora durante 45 min-1 h. Depois de neurónios são incubadas com a solução de transfecção, muito finos precipitados de Ca-P iria formar uma camada de cobertura neurónios. </li><li> Substituir o meio de transfecção com 500 ul de pré-aquecido tampão de lavagem (NaCl 135 mM, HEPES 20 mM, KCl a 4 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de glucose a pH 7.3, esterilizado filtrada com filtro de 0,22 um) e incubar a 356; C numa atmosfera de 5% de CO2: 95% de ar incubador humidificado durante 15-20 min. precipitados Ca-P desapareceria após a etapa de lavagem. </li><li> Substitua o tampão de lavagem com 500 mL de meio de crescimento fresco. Mais uma vez, substituir o meio de crescimento com a mídia original salvo. </li><li> Adicionar SAU Cmn (pré-misturado em 50 ul de mídia crescimento quente) à cultura para chegar a 1 mM de concentração final. </li><li> Incubar a cultura transf ectadas a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar humidificado durante 12-48 incubadora horas antes dos ensaios. </li></ol></li><li> Gravação de células inteiras com fotoativação <ol><li> Preparar soluções extra / intracelular. A solução intracelular contém gluconato de potássio 135 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM, ATP 2 K 2,56, e 0,3 mM de Li 2 GTP a pH 7,4. A solução de registo extracelular contém NaCl 150 mM, KCl 3 mM, MgCl 2 5 mM, CaCl 2 0,5 mM, glucose a 5 mM e HEPES 10 mM a pH 7,4. </li><li&gt; Configurar o equipamento de eletrofisiologia para fixação patch-célula inteira: microscópio equipado com 4X e 20X objectivos, contraste de interferência diferencial (DIC), eo filtro mCitrine (excitação: 495/10 nm, emissão: 525/25 nm); manipulador; patch-clamp amplificador; digitador; aquisição de dados e software de análise. <ol><li> Instalar um díodo emissor de luz (LED), com emissão de 385 nm pelo microscópio na plataforma para fornecer luz para o ponto focal de 1 cm de distância em um ângulo de 45 °. Verifique a potência do LED com um medidor de energia de luz. </li></ol></li><li> Puxe pipetas de patch a partir de eletrodos de vidro usando um extrator micropipeta comercial para ter 3-6 mohms resistência pipeta. Siga as instruções do fabricante para configurar o extrator micropipeta. <ol><li> Para testar a resistência pipeta, primeiro encher a pipeta com a solução intracelular e posicioná-lo no suporte de eléctrodo. Mergulhar o pipeta em uma placa de cultura de 35 milímetros preenchido com a solução extracelular, colocado no microscópio Platform. Mergulhe um eletrodo terra no prato para completar o circuito. </li><li> Ligue o amplificador / digitalizador e iniciar um programa de aquisição de dados. Monitorar a resistência da pipeta com um protocolo de teste da membrana. </li></ol></li><li> Retire uma lamela do neurónio cultura do incubador e lavar uma vez na solução extracelular. Usando graxa de vácuo, mantenha pressionada a lamela no meio de uma placa de cultura 35 milímetros cheio com a solução extracelular fresco. </li><li> Coloque a lamela / prato na plataforma eletrofisiologia microscópio. </li><li> Usando as técnicas de patch de fixação padrão, remendar um neurônio com mCitrine fluorescência 27. actividade neuronal registro usando pinça de corrente (I-clamp) método. Em primeiro lugar, ajustar o potencial de repouso de -72 mV em torno através da injecção de uma pequena corrente. Em seguida, injetar uma corrente passo (10-200 pA) para induzir disparo contínuo (5-15 Hz) dos potenciais de ação. </li><li> Manualmente, ou usar o software de aquisição de dados, piscar um pulso (um pecadogle pulso de 100 ms-1 s de duração) da luz LED para o neurônio durante a gravação, e ver se os potenciais de ação são afetados. </li><li> Adicionar BaCl 0,5 mM 2 para o banho e verificar se os potenciais de ação são recuperados. </li></ol></li></ol> 2. Incorporação Uaa em Kir2.1 e Expressão da Pirk resultante no Rato In Vivo cérebro embrionário <ol><li> DNA Construção <ol><li> Design o DNA de plasmídeo de forma semelhante como no passo 1.1. Para a expressão, in vivo, utilizar um promotor forte tal como o CAG (promotor da beta-actina de galinha com CMV). </li><li> Purifica-se o ADN com um kit comercial maxiprep isento de endotoxinas de acordo com o protocolo do fabricante. Realizar a extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol 25 para adquirir ADN qualidade extremamente elevada (condensado de 2-5 ug / uL). </li></ol></li><li> In Utero Eletroporação à embrionárias de camundongos Neocortex Nota: O techni básicathat para in utero electroporação foi descrito anteriormente 28. <ol><li> Anestesiar um ratinho grávida cronometrado no dia embrionário 14,5 (E14.5) com pentobarbital sódico (injecção intraperitoneal, 50 ug por grama de peso corporal) ou isoflurano (inalação, 2-4%). Monitorização da profundidade anestésica, verificando perda de consciência e nenhuma resposta a estímulos tácteis e beliscar das patas. </li><li> Fazer uma pequena incisão na linha média abdominal. Gentilmente expor os cornos uterinos com uma pinça e pontas dos dedos. </li><li> Injectar solução cerca de 1 uL de ADN (2-5 ug / mL de cada plasmídeo, dependendo da construção) no ventrículo lateral de cada ninhada com uma pipeta de vidro introduzido através da parede uterina. Na maioria dos casos, cerca de 60-80% dos embriões totais são injectados. </li><li> Electroporate os embriões com um electroporator (33-35 V, 50 mseg de duração, 950 intervalo de milissegundos, 4-8 pulsos). </li><li> Devolver os cornos uterinos à cavidade abdominal suavemente com aceps e pontas dos dedos. Sutura parede muscular e, em seguida, a pele com sutura cirúrgica para permitir que os embriões para continuar o desenvolvimento. </li></ol></li><li> SAU microinjeção <ol><li> Fazer uma pequena incisão na linha média abdominal novamente em E16.5, e suavemente expor as trompas uterinas com uma pinça e alcance. </li><li> Injectar cerca de 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) para o lado a electroporação ou ambos os lados do ventrículo lateral, com uma pipeta de vidro introduzido através da parede uterina. Para aumentar Cmn biodisponibilidade, utilize o dipeptídeo Cmn-Ala (CMN-alanina) para entregar Cmn in vivo 21. </li><li> Mais uma vez, retornar os cornos uterinos à cavidade abdominal suavemente com uma pinça e pontas dos dedos. Sutura parede muscular e, em seguida, a pele com sutura cirúrgica para permitir que os embriões para continuar o desenvolvimento. </li></ol></li><li> Obter aguda fatias do cérebro do <ol><li> Adicione 1 L de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1,3 mM, CaCl 2,5 mM <sUB&gt; 2, glicose 1 mM de NaH 2 PO 4, 26,2 mM de NaHCO3, e 11 mM a pH 7,3. </li><li> Tome 200 ml ACSF e rápido por congelação a -80 ° C durante 20-30 min. Bolha o resto de ACSF com 5% de CO2: 95% de gás O2 à temperatura ambiente. </li><li> Preparar e esterilizar instrumentos cirúrgicos para colher os cérebros dos embriões. Também prepare um balde de gelo. </li><li> Adicione ~ solução de agarose de baixo ponto de fusão de 100 ml de 4% num balão por aquecimento num forno de microondas. Arrefecer solução para cerca de 5 minutos antes de começar a solidificar. </li><li> Eutanásia do hr rato 12-24 após Cmn-Ala injecção de CO 2 overdose. Fazer grandes incisões na área abdominal, e dissecar os embriões / microinjetados electroporado do útero com uma tesoura fina e fórceps. </li><li> cérebros colheita dos embriões com uma tesoura fina e fórceps. </li><li> Coloque cada cérebro em uma placa de cultura de 10 centímetros colocados no balde de gelo. Dividir dois hemisférios usando uma lâmina afiada, e colocar cadahemisfério no prato com o plano sagital mediano tocar no fundo do prato. Rapidamente despeje sobre a solução de agarose sobre cérebros (cerca de 500 ul por hemisfério). </li><li> Usando uma lâmina afiada, quadrado cortar a agarose em torno de um cérebro para fazer um bloco de agarose-embedded cérebro. </li><li> Usando cola de tecido, cola para baixo a superfície plano sagital médio do bloco de agarose em uma montagem para vibratome. Encha a câmara vibratome com ACSF pré-refrigerados e cortar 200 mm fatias de cérebro sagital. </li><li> Incubar fatias agudas em ACSF suplementado com 3 mM de inositol mio, ácido ascórbico 0,4 mM e piruvato de sódio 2 mM a 33 ° C durante 42 min enquanto se fazia borbulhar com 5% de CO2: 95% de gás O2. </li><li> Após 42 min, desligue o aquecedor e continuar a incubar as fatias à temperatura ambiente com borbulhante. Iniciar a gravação de patch-célula inteira, pelo menos, 15 minutos após desligar o aquecedor. </li></ol></li><li> Gravação de células inteiras com fotoativação <ol><li> Prepare o INTRACellular solução contendo gluconato de potássio 130 mM, MgCl 2 4 mM, HEPES 5 mM, EGTA 1,1 mM, 3,4 mM de Na 2 ATP, fosfato de creatina de sódio 10 mM, e 0,1 mM de Na 3 GTP a pH 7,3 ajustado com KOH. </li><li> Puxe pipetas de patch a partir de eletrodos de vidro usando um extrator micropipeta comercial para ter 3-6 mohms resistência pipeta. </li><li> Configurar o equipamento eletrofisiologia fatia para fixação de patch de células inteiras e superfuse a câmara de gravação com ACSF a 2 mL / min taxa com uma bomba de perfusão. Ajustar a temperatura da câmara para cerca de 33 ° C. Nota: O equipamento de fatia electrofisiologia está equipado com uma câmara de perfusão, uma objectiva de imersão em água e um controlador de temperatura. Além disso, o filtro GFP (excitação: 480/30 nm, emissão: 535/40 nm) e filtro de mCherry (excitação: 580/20 nm de emissão: 675/130 nm) são obrigatórios. <ol><li> Instalar um LED com emissão de 385 nm pelo microscópio na plataforma para fornecer luz para o ponto focal a partir de 1 cm de distância em um 45 °ângulo. Verifique a potência do LED com um medidor de energia de luz. </li></ol></li><li> Cuidadosamente pegar uma fatia do cérebro com uma pipeta de vidro e coloque na câmara de perfusão. Mantenha pressionada a fatia com uma harpa. </li><li> Remendar um neurônio com fluorescência mCherry / GFP da região neocortical 27. atividade Pirk registro usando braçadeira de tensão (V-clamp) método. Em primeiro lugar, têm o potencial de membrana de -60 mV. Então, as correntes recorde em potenciais fixos negativos membrana (-100 mV) ou rampas de tensão (-100 mV a +40 mV). Especificamente, Kir2.1 monitorizar correntes de entrada específicos a -100 mV. </li><li> Manualmente, ou usar o software de aquisição de dados, piscar um pulso (um único pulso de 100 ms -1 duração seg) de luz LED para o neurônio durante a gravação, e ver se as proteínas Pirk são ativados. Uma vez Pirk é ativado, correntes de entrada em -100 mV aumentaria significativamente. </li><li> Adicionar BaCl 0,5 mM 2 para o banho e verificar se Pirk é inativado novamente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para alcançar photo-modulação eficaz, o passo inicial importante é decidir onde a incorporar SAU fotossensíveis na proteína alvo. A informação estrutural e funcional da proteína alvo é muito útil para orientar a selecção de locais candidatos. Ao mesmo tempo, o efeito de regulação da luz iria determinar que o local é o mais adequado. Depois de escolher locais candidatos, é recomendável para testar os sítios em linhas celulares de mamíferos, tais como o rim embrionário humano (HEK) células de cultura e mais fácil manipula...

Em comparação com a estimulação elétrica convencional, fotoestimulação oferece maior resolução temporal e espacial com a mínima interferência no sistema fisiológico das amostras. Desde a demonstração do uso de lasers para estimular neurônios em 1971 1, muitas maneiras criativas foram inventados para controlar exogenamente atividade neuronal com a luz. Libertação óptica de agonistas photocaged tem sido muito utilizado para estudar a resposta fisiológica da rede neuronal para ligandos 2,3,4. Esta técnica tem limitado especificidade devido à difusão de agonistas enjaulados. Especificidade genética é conseguido por ectopicamente que expressam canais de opsina sensíveis à luz e bombas de 5,6,7, e que tem sido aplicado com sucesso para modular redes neuronais seleccionadas em diversos organismos modelo. No entanto, seria difícil de aplicar este método para controlar opticamente várias outras proteínas neuronais, uma vez que enxertia photoresponsiveness das proteínas a outras proteínas opsina acolherá-D necessitam de engenharia intenso que podem alterar as características naturais da proteína em estudo. Quimicamente amarrar um ligando fotossensível exógeno a uma proteína demonstrou uma outra maneira de controlar a funcionalidade de proteínas de canal 8,9,10. O ligando é apresentado ou retirado do local de ligação da proteína através da foto-isomerização da porção azobenzeno. Partilha química limita a aplicação, principalmente, para o lado extracelular de proteínas de membrana, excluindo o lado intracelular e proteínas intracelulares. Fotossensíveis UAAS, depois de ter sido incorporada em proteínas, fornecer uma estratégia geral para manipular proteínas com luz. Em esforços iniciais, tRNAs quimicamente acilados com UAAS photocaged receberam microinjeções em oócitos de Xenopus para incorporar as UAAS em receptores de membrana e canais iônicos 11, que têm avançado a compreensão de suas relações estrutura-função 12,13,14.Esta abordagem microinjeção é limitado principalmente para grandes oócitos. Incorporação genética de uma Uaa ignora o desafio técnico tRNA acilação e microinjecção usando um par ARNt / sintetase ortogonal, que incorpora SAU através da tradução de proteína endógena em células vivas 15,16,17,18. Uaa incorporação proteínas neuronais tem sido demonstrada em neurónios primárias e células estaminais neurais 19,20. Mais recentemente, fotossensíveis Uaa foi geneticamente incorporada uma proteína neuronal no cérebro de mamíferos, in vivo, pela primeira vez 21. Estes avanços tornam possível estudar proteínas neuronais com UAAS no seu ambiente celular nativo. Interiormente retificação do canal de potássio Kir2.1 é um forte retificador que passa K + correntes mais facilmente em que para fora da célula, e é essencial na regulação de processos fisiológicos incluindo excitabilidade das células, tônus ​​vascular, a frequência cardíaca, refluxo sal nal e insulina liberar 22. A sobre-expressão de Kir2.1 hiperpolariza o potencial de membrana do neurónio-alvo, que se torna menos excitável 23,24. Para controlar opticamente Kir2.1 nas suas células nativas, Kang et ai. Geneticamente incorporou um Uaa foto-sensível em Kir2.1 expresso em células de mamíferos, os neurónios e cérebro do rato embriónica 21. Uma breve pulso de luz foi capaz de converter o EAU em um aminoácido natural Cys, activando assim a proteína Kir2.1 alvo. Quando esta proteína de canal de foto-indutível interiormente rectificação de potássio (Pirk) foi expresso em neurónios primários do hipocampo do rato, que suprimiu o disparo neuronal em resposta à activação de luz. Além disso, o canal Pirk foi expressa no neocórtex de rato embrionário, e a corrente activado pela luz Pirk em neurónios corticais foi medida. A implementação bem sucedida da tecnologia Uaa in vivo no cérebro de mamíferos abre a porta para controlar opticamente proteínas neuronaisno seu ambiente nativo, o que permitirá dissecção óptico dos processos e mecanismos neuronais, a nível molecular. Neste protocolo, descrevemos os procedimentos para a constituição genética de UAAS em neurônios primários na cultura e no cérebro do rato embrionário in vivo. O fotossensíveis Uaa CMN e Kir2.1 são utilizados para ilustrar o processo. Métodos para avaliar bem-sucedida incorporação Uaa e controle óptico da actividade da proteína neuronal são fornecidos. Este protocolo fornece um guia claro para codificar geneticamente UAAS em neurônios e in vivo, e para a regulação opticamente função da proteína neuronal através de um Uaa fotossensíveis. Esperamos que este protocolo para facilitar a adoção da tecnologia in vivo Uaa para a neurociência e estudos biológicos optogenética.

<table><tbody><tr><td>Vidros de cobertura, círculos, 12 mm, espessura 0,13-0,17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Solução de D-(+)-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Iris Spatula-curvada</td><td>Fine Science</td><td>Tool 10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Faca de dissecação - Ponta</td> <td>angular finaFerramenta de Ciência Fina</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Extensor de Soro</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Filtro de células</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (N,N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico, N,N-Bis(2-hidroxietil)taurina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>FONTE DE LUZ LED &ndash; Preto LED 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, baixo ponto de fusão, grau analítico</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido unnatural amino geneticamente codificados em neurónios

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

A fotoestimulação é uma forma não invasiva de controlar eventos biológicos com excelente resolução espacial e temporal. Novos métodos são desejados para fotorregular proteínas endógenas expressas em seu ambiente nativo. Aqui, apresentamos uma abordagem para controlar opticamente a função de uma proteína neuronal diretamente nos neurônios usando um aminoácido não natural (Uaa) geneticamente codificado. Usando um par ortogonal de tRNA / aminoacil-tRNA sintetase para suprimir o códon âmbar, um Uaa 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzil-cisteína foto-reativo (Cmn) é especificamente incorporado no poro de uma proteína neuronal Kir2.1, um canal de potássio retificador interno. O Cmn volumoso bloqueia fisicamente o poro do canal, tornando o Kir2.1 não condutor. A iluminação da luz converte instantaneamente o Cmn em um aminoácido natural menor Cys, ativando a função do canal Kir2.1. Expressamos esses canais de potássio farmacológicos(PIRK) em neurônios primários do hipocampo de ratos e demonstramos que a ativação luminosa do PIRK cessa o disparo neuronal devido ao fluxo de corrente de K + através dos canais Kir2.1 ativados. Usando eletroporação in utero, também expressamos PIRK no neocórtex embrionário de camundongo in vivo, mostrando a ativação luminosa de PIRK em neurônios neocorticais. A codificação genética do Uaa não impõe restrições ao tipo de proteína-alvo ou localização celular, e uma família de Uaas fotorreativos está disponível para modular diferentes resíduos de aminoácidos naturais. Essa técnica, portanto, tem o potencial de ser geralmente aplicada a muitas proteínas neuronais para alcançar a regulação óptica de diferentes processos no cérebro. O protocolo atual apresenta um procedimento acessível para a intrincada incorporação de Uaa em neurônios in vitro e in vivo para obter o fotocontrole da atividade da proteína neuronal em nível molecular.

Para incorporar um Uaa geneticamente para uma proteína em neurónios, o primeiro passo importante é a concepção de gene apropriado constrói para proporcionar e expressar genes de forma eficiente em neurónios. Há três componentes genéticos para Uaa incorporação: (1) o gene alvo com o codão de paragem TAG âmbar introduzido no local escolhido para Uaa incorporação (2) um ARNt ortogonal para reconhecer o codão de paragem TAG mutado, e (3) uma aminoacil ortogonal -tRNA sintetase de cobrar SAU ...

Aqui, é apresentado um procedimento para ativar seletivamente uma proteína neuronal com um pulso curto de luz codificando geneticamente um aminoácido não natural foto-reativo em uma proteína neuronal alvo expressa em neurônios em cultura ou in vivo.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

O objetivo geral deste procedimento é controlar opticamente a função de uma proteína neuronal utilizando um aminoácido não natural codificado geneticamente em neurônios. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a contribuição de uma proteína neuronal específica na sinalização neuronal na função cerebral, com resolução espacial e temporal. A principal vantagem desta técnica é o seu potencial de ser aplicada a diversas proteínas neuronais para alcançar a regulação óptica de vários processos neuronais.Inicie este procedimento semeando neurônios do hipocampo em lamínulas colocadas em uma placa de 24 poços com 500 microlitros de meio de crescimento, após filtração através de uma malha de náilon de 40 micrômetros. Em seguida, incube a cultura neuronal a 35 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 2 a 3 semanas. No dia da transfeção, prepare uma solução fresca de cloreto de cálcio 2,5 molar em água duplamente destilada e filtre-a esterilmente com um filtro de 0,22 micrômetro.Em seguida, prepare BBS 2X fresco em pH 7 e filtre-o esterilmente com um filtro de 0,22 micrômetro. Depois disso, substitua o meio de crescimento da cultura por 500 microlitros de meio de transfeção fresco e pré-aquecido, sem descartar o meio de crescimento antigo. Prepare a solução de transfeção imediatamente antes de adicioná-la à cultura, combinando cloreto de cálcio e água bidestilada, agitando lentamente o tubo.Continue agitando o tubo e adicione lentamente o DNA à solução. Em seguida, adicione o tampão 2X BBS gota a gota. A preparação do tampão 2X BBS é uma etapa crítica na transfeção por fosfato de cálcio, e é recomendável calibrar o pH ideal do tampão 2X BBS entre 6,90 e 7,15 para novos construtos ou preparações de DNA.Em seguida, adicione imediatamente 30 microlitros da solução de transfeção a cada lamínula da cultura neuronal. Agite suavemente o recipiente da cultura algumas vezes para misturar a solução e incube-a a 35 graus Celsius por 45 minutos a uma hora. Após cerca de uma hora, deve-se observar uma camada fina de precipitados de fosfato de cálcio cobrindo os neurônios.Em seguida, substitua o meio de transfeção por 500 microlitros de tampão de lavagem pré-aquecido e incube a 35 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Os precipitados de fosfato de cálcio devem desaparecer após a lavagem. Agora, substitua o tampão de lavagem por 500 microlitros de meio de crescimento fresco.Posteriormente, substitua o meio de crescimento pelo meio original guardado. Em seguida, adicione o aminoácido não natural Cmn pré-misturado em 50 microlitros de meio de crescimento aquecido ao cultivo, resultando em uma concentração final de um milimolar. Incube o cultivo transfectado a 35 graus Celsius por 12 a 48 horas antes da gravação.Neste procedimento, prepare as soluções extracelular e intracelular. Em nossa configuração, o LED com emissão de 385 nanômetros está instalado ao lado do microscópio para fornecer luz a um centímetro de distância do ponto focal em um ângulo de 45 graus. Em seguida, puxe algumas pipetas de patch com um eletrodo de vidro utilizando um puxador de micropipetas.Em seguida, retire um lamínula com culturas de neurônios do incubador e lave-o uma vez com a solução extracelular. Perfunda o aparato com solução extracelular. Posteriormente, posicione o lamínula na plataforma do microscópio de eletrofisiologia, utilizando técnicas padrão de patch clamping.Patcheie um neurônio transfectado com fluorescência M-citrina. Em seguida, registre a atividade neuronal utilizando o método de fixação de corrente. Primeiro, ajuste o potencial de repouso em torno de menos 72 milivolts.Em seguida, injete uma corrente em degrau para induzir a emissão contínua de potenciais de ação entre cinco e 15 hertz. Durante a gravação, aplique pulsos simples de LED ao neurônio e monitore as alterações em seus potenciais de ação. Em seguida, adicione cloreto de bário 0,5 milimolar ao banho para recuperar os potenciais de ação.No contexto de fatias cerebrais agudas, realize um selamento em um neurônio com fluorescência de M-cherry GFP da região neocortical. Em seguida, registre a atividade de PIRK utilizando o método de rampa de voltagem. Especificamente, monitore as correntes internas específicas de Kir2.1 em menos 100 milivolts.Em seguida, aplique pulsos únicos de LED ao neurônio durante a gravação e monitore se as proteínas PIRK são ativadas. Uma vez que PIRK é ativada, as correntes entrantes em menos 100 milivolts aumentarão significativamente. No final, adicione cloreto de bário 0,5 milimolar ao banho e verifique se PIRK é inativada.Mostradas aqui estão imagens exemplares de culturas neuronais hipocampais saudáveis de rato. E dois neurônios saudáveis exibindo corpos celulares volumosos e dendritos e axônios proeminentes. Estas são as imagens de contraste de fase e de fluorescência de culturas de neurônios hipocampais de rato in vitro, transfetados para expressão de PIRK sem CMN.Na presença de um milimolar de CMN, neurônios transfectados são capazes de expressar proteínas PIRK M-citrina de comprimento completo, exibindo assim fluorescência verde. E aqui há um exemplo de um único pulso de luz, suprimindo a atividade de um neurônio hipocampal que expressa PIRK. Essas imagens de fluorescência de neurônios corticais embrionários de camundongo mostram a incorporação bem-sucedida de CMN em proteínas GFP e Kir2.1 in vivo.Neste gráfico, a ativação dependente da luz de PIRK é indicada nas correntes registradas de neurônios neocorticais de camundongo. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de doenças cerebrais causadas por disfunção de proteínas neuronais específicas, por exemplo, Kir2.1 mutada na síndrome de Andersen, porque esta técnica ajuda a revelar quais circuitos cerebrais são afetados pelos déficits de Kir2.1. Após dominada, esta técnica pode ser usada para controlar com alta especificidade a função de proteínas neuronais com luz em neurônios vivos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como incorporar aminoácidos artificiais em proteínas em neurônios para obter controle fotônico sobre proteínas neuronais de interesse.

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Adulto-nascido neurônios expressando ChR2 pode ser manipulado em preparações fatia eletrofisiológicos, a fim de examinar sua contribuição para a função olfativa de circuitos neurais.

Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios

Pegue uma cultura de Corynebacterium glutamicum, transformada com um plasmídeo carregando um gene repórter fluorescente a jusante do antiterminador do ácido ribonucléico ou sequência RAT, em uma placa de vários poços.Durante a transcrição, o RAT-RNA forma uma estrutura de alça de haste que bloqueia a RNA polimerase, interrompendo a expressão do gene repórter.O plasmídeo também expressa constitutivamente LicV, uma proteína de fusão que compreende a proteína de ligação ao RNA RAT, LicT e o...

Controle optogenético da expressão gênica em Corynebacterium glutamicum

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e<em&gt; Xenopus</em&gt; Desenvolvimento embrionário

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho sobre como combinar artificial microRNA mediada por RNA interferência com optogenetics para estimular especificamente pré-sináptica boutons com reduzida expressão de genes seletiva dentro de circuitos neuronais intactos.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

O controle confiável das células mamíferas responsivas à luz requer a padronização dos métodos optogenéticos. Em direção a esse objetivo, este estudo descreve um pipeline de construção de circuitos genéticos, engenharia celular, operação de equipamentos optogenéticos e ensaios de verificação para padronizar o estudo da expressão genética induzida pela luz usando um circuito genético optogenético de feedback negativo como estudo de caso.

Engenharia confiável e controle de circuitos genéticos estáveis em células mamíferas

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Aprenda a controlar opticamente proteínas neuronais utilizando aminoácidos não naturais codificados geneticamente em neurónios do hipocampo. Esta técnica permite estudar funções proteicas com alta resolução espacial e temporal.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

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