Name: Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda ensaios de difusão em microslide e liberação de corante para triagem rápida de enzimas antimicrobianas. Estes métodos simples permitem avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática contra bactérias patogênicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pela The MITRE Corporation por meio do Programa de Inovação MITRE (Projeto 25MSR621-CA). Os autores gostariam de agradecer a Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D. e Caroline Gary por seu apoio e revisão deste trabalho.

1. Preparação de origem bacteriana e de peptidoglicano Substratos Nota: os substratos de bactérias de células inteiras e os peptidoglicanos purificados são utilizados como substratos de enzimas, tanto no ensaio de difusão microlâmina e o ensaio de corante de libertação. Estes substratos requerem preparação antes de se realizar as reacções de enzimas. O protocolo seguinte descreve a sua preparação. <ol><li> Total substrato celular bacteriana <ol><li> Produção de substrato celular bacteriana por inoculação de 500 mL de caldo nutriente com um 2 ml de cultura de uma noite de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubar a 30 ° C com agitação (125 rpm) até a cultura atingir uma fase exponencial de crescimento, definida como uma fase de crescimento rápido que resulta na duplicação da cultura bacteriana. Para o cultivo de salmonela entérica subsp. Enterica (ATCC 10708), caldo de nutrientes usar como um meio de crescimento a 37 ° C com agitação (125 rpm). </li&gt; <li> Calor-matar cada cultura em autoclave durante 10 min a 121 ° C sob 3 atm de pressão. </li><li> Colher o substrato de bactérias mortas pelo calor por centrifugação durante 20 min a 5000 x g. Lavar o sedimento três vezes com 1 Tipo de água e re-suspensão numa quantidade mínima de água. Neste estudo, suspender os substratos em 1200 ul. </li><li> Aliquota de 300 ul de substratos de células bacterianas para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e armazenar a 20 ° C. </li></ol></li><li> Substrato Peptidoglicana purificada <ol><li> Purificar peptidoglicano da bactéria substrato alvo 7-10 ou adquirir de um fornecedor (ver Materiais e Tabela Equipment). Purifica-se preparações de peptidoglicano em bruto a partir de polímeros da parede celular acessório. </li></ol></li></ol> 2. Ensaio de Difusão qualitativa MicroSlide [Modificado de Lachica, et ai. 11] Nota: O ensaio de difusão MicroSlide éum método qualitativo para detectar a presença de enzima antimicrobiano numa amostra. À medida que a enzima se difunde através de um substrato contendo matriz de agarose, uma zona de compensação se desenvolve como a enzima hidrolisa o substrato. O protocolo seguinte descreve a preparação e o desempenho do ensaio de difusão microlâmina para detectar qualitativamente, a presença de agentes antimicrobianos de proteína. <ol><li> Determinar a concentração da enzima antimicrobiano a ser avaliada utilizando um kit de ácido bicinconínico (BCA) de ensaio de proteína de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Utilizar solução salina tamponada com fosfato (PBS) como um tampão de enzima; No entanto, determinar empiricamente o tampão apropriado para a enzima dado. </li><li> Efectuar uma diluição em série da enzima antimicrobiana usando solução salina tamponada com fosfato (PBS) como um tampão de reacção. A diluição em série utilizado nestes ensaios de difusão MicroSlide produziu massas de proteína final de ensaio de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg e 10 ug por volume de reacção. </li><li> Dispensar massas proteína em tubos de microcentrífuga individuais e ajustar os volumes de proteína de 20 ul utilizando PBS, em preparação para adição a MicroSlide poços de reacção. </li><li> Adicione uma solução de agarose a 0,5% por dissolução de 0,25 g de agarose em 50 ml de PBS. Aquece-se a solução à fervura até a agarose estar completamente dissolvida. Determinar a água perdida durante o processo de fusão, em peso, e adicionar de volta para a solução. </li><li> Adicionar 50 ul de 10% de azida de sódio em água à solução de agarose e ajustar a temperatura da solução para 50 ° C num banho de água. A azida de sódio é adicionado para inibir o crescimento bacteriano contaminante durante a incubação do ensaio de difusão microlâmina. Se as células viáveis ​​são utilizados como substrato, omitir a azida de sódio a partir da solução de agarose. </li><li> Descongelar o substrato bacteriana morta pelo calor em gelo. </li><li> Re-suspender o substrato bacteriana em 12 ml de solução de agarose a cerca correspondem a turbidez de uma 2,0 MCFArland equivalência padrão (ver Tabela de Materiais). Comparar as turvações das soluções de visualização de uma linha de preto sobre um fundo branco através das soluções, a adição de substrato bacteriana para a agarose até a turbidez aproximado é alcançado. </li><li> Imediatamente pipetar 3 ml de solução de agarose-substrato para cada microlâmina (25 x 75 x 1 mm3). </li><li> Depois de lâminas solidificar, perfurar três poços na camada de agarose-substrato de cada MicroSlide com uma sonda (diâmetro 4,8 mm). Adicionar 20 mL de cada diluição em série da proteína ajustados aos respectivos poços. </li><li> Use PBS (20 uL) ou albumina de soro de bovino (5 ug em 20 ul de PBS) num poço de controlo negativo. Use enzimas bacteriolíticas conhecidos apropriados para o substrato, tal como a lisozima, como um controlo positivo. </li><li> Incubar as lâminas numa câmara de humidade a 37 ° C ou a temperatura óptima de actividade da enzima. A duração da incubação depende da concentração ea actividade específica da enzima antimicrobiana. Um tempo de reacção típico é durante a noite (aproximadamente 16 horas). </li><li> Após a incubação, observar as lâminas sob luz e capturar imagens indiretos do ensaio de desenvolvimento usando uma câmera digital reflex de lente única com uma lente de 60 mm a uma distância focal de cerca de 30 cm. Nota: A actividade enzimática da proteína antimicrobiana para o substrato dado está correlacionado com o desenvolvimento de uma zona clara de hidrólise, que forma em torno do bem como o enzima difunde-se para a agarose. </li><li> Para se qualificar a atividade enzimática, observar os tamanhos das zonas que formam em torno de cada bem. alta actividade enzimática qualitativa refere a uma zona maior, enquanto que a baixa actividade enzimática refere-se qualitativamente a uma zona menor. </li></ol> 3. Substrato Labeling - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Modificado de Zhou 12] Nota: No ensaio de corante de libertação, o substrato é covalentemente Linked para Remazol Brilliant corante R azul. O protocolo seguinte descreve a preparação de substratos de enzimas tingidos. <ol><li> Adicione uma solução de hidróxido de sódio 250 mM (NaOH) por dissolução de 1 g de NaOH em 99 mL de água Tipo I a ser usada para fazer uma solução 200 mM de Remazol Brilliant Blue R corante (RBB). </li><li> Adicione uma solução RBB 200 mM por dissolução de 1,25 g de RBB em 98,75 ml ± 1 ml de uma solução de NaOH a 250 mM fresco (passo 3.1). </li><li> Re-suspender as células bacterianas mortas por calor a uma concentração de 0,5 g de peso fresco em 30 ml de solução de RBB. Para peptidoglicano purificado, re-suspender o peptidoglicano, a uma concentração de 0,3 g de peso fresco em 30 ml de solução de RBB. </li><li> Incubar a mistura de reacção num balão de Erlenmeyer, numa plataforma rotativa durante 6 h a 37 ° C com mistura suave. </li><li> Transferir a mistura reaccional a 4 ° C incubadora e incubar durante uma 12 horas adicionais, com mistura suave. </li><li> Após a incubação, o substrato tingido colheita por centrifugação a 3000 xgdurante 30 min. Decantar a solução corante a partir do sedimento substrato. </li><li> Remover o corante solúvel não-covalentemente ligada a partir dos substratos por lavagem das células marcadas com corante ou peptidoglicano repetidamente (aproximadamente 3-5 lavagens com água) Tipo I seguido de centrifugação. Com cada adição de água, re-suspender o pellet cuidadosamente. Nota: Quando não ligado tintura, solúvel não é mais visível na lavagem com água após a centrifugação. O substrato deve ser dada uma lavagem adicional. Note-se que o substrato vai permanecer azul, enquanto que o sobrenadante da última lavagem será claro. </li><li> Armazenar os substratos tingidos em suspensão numa quantidade mínima de água a -20 ° C para uso posterior. </li></ol> 4. Quantitative Dye-lançamento de Ensaio Nota: Durante o ensaio de corante de libertação, a hidrólise de substrato de RBB-tingido nas versões reacção enzimática produtos tingidos para o sobrenadante da reacção. medição colorimétrica da quantidade de corante libertado indica o amount da actividade enzimática presente na amostra para uma dada enzima. O método quantitativo permite a comparação de diferentes enzimas em todo substratos e permite variações de condições ambientais que influenciam a reacção enzimática (por exemplo, temperatura, salinidade e de pH). O protocolo seguinte descreve a preparação e o desempenho do ensaio de libertação de corante para a detecção quantitativa da actividade enzimática da proteína antimicrobianos. <ol><li> Preparação para o ensaio Dye-release <ol><li> Permitir que o substrato tingido congelado para voltar à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com tampão de ensaio (PBS), que é empiricamente determinada para a enzima dado. </li><li> Calcular o volume de suspensão de substrato que é necessário, multiplicando o volume de reacção de 200 ul por o número de ensaios de libertação de corante a ser executada. </li><li> Prepara-se o substrato de suspensão por adição do substrato tingido com o volume de tampão de ensaio, determinado em 4.1.2, até uma densidade óptica (OD) de 2,0 é atingida a 595 nm utilizando um espectrofotómetro. Para permanecer dentro das limitações funcionais do espectrofotômetro, medir a 2,0 OD 595 de 1,0 para uma diluição de 1: 1 da solução concentrada. Utilize tampão de ensaio como um branco. Nota: A turbidez substrato para a reacção pode ser aumentado para além de 2,0 para coincidir com os níveis de enzimas de actividade altamente eficientes. </li><li> Suspender a proteína antimicrobiana ser avaliada em tampão de ensaio a uma concentração estimada de 1 mg / ml. </li><li> Utilizando o ensaio de microplacas de um kit de ensaio de BCA proteína de acordo com o protocolo do fabricante, determinar a concentração real da amostra de proteína a ser ensaiada. Ajustar a concentração da suspensão de pasta a 1 mg / mL utilizando tampão de ensaio. </li></ol></li><li> Utilizando o ensaio Dye-release para determinar as condições óptimas de incubação para uma proteína antimicrobiana <ol><li> Diluir a suspensão antimicrobiana proteína de ações para 100 ng / mL. Esta concentração dá afmassa de reacção inal de 1 ug de proteína por unidade de volume (10 mL) adicionada à reacção do ensaio. </li><li> Determine o intervalo térmico para ser avaliada para a proteína bacteriolytic. A gama térmica nestes ensaios incluídos 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, e 65 ° C. </li><li> Realizar os ensaios de reação em 0,5 ml tubos de microcentrífuga. Para cada condição térmica, adicionar 10 ul de estoque a proteína a 200 ul de suspensão de substrato preparado. </li><li> Incubar em um termociclador durante 8 horas, com mistura por inversão, uma vez por hora. </li><li> Após a incubação, prender as reacções pela adição de 25 ul de etanol. </li><li> Retirar, o substrato não digerido insolúvel por centrifugação a 3000 xg durante 2 min, e transferir 150 ul do sobrenadante de cada mistura de reacção para a reacção a uma microplaca de 96 poços de fundo plano, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento de substrato não digerido. </li><li> Medir a actividade enzimática da proteína Antimicrobial para o substrato determinado através da determinação da quantidade de corante solúvel em RBB dissociado do substrato após a hidrólise enzimática. Para quantificar a actividade enzimática, medir a absorvância do sobrenadante a 595 nm usando um espectrofotómetro de microplacas. O aumento da absorvância pelo corante solúvel libertada para o sobrenadante do substrato marcado é uma medida quantitativa da actividade enzimática. Nota: A alteração na absorvância é representada por unidades de actividade (AU), em que 1 UA resultados em um aumento de 0,01 para a densidade óptica do sobrenadante da reacção de libertação do corante a 595 nm. Uma reacção em branco, incubou-se com todos os componentes da reacção, com excepção da enzima, é utilizada para subtrair qualquer corante que liberta do substrato RBB-rotulado, devido à incubação. A temperatura enzimática óptima fornece a medição unidade de atividade de pico. </li><li> Repita os passos através 4.2.1 4.2.7 utilizando vários tampões de incubação, para determinar as condições de tampão óptimas para a enzima antimicrobiana. em tstes ensaios, utilizar PBS. </li></ol></li><li> Utilizando o ensaio de corante de libertação para determinar a concentração mínima activa na temperatura óptima de incubação para uma proteína antimicrobiana <ol><li> Efectuar uma diluição em série da suspensão da proteína antimicrobiana usando o tampão de ensaio. A gama de diluição série irá variar com a actividade da enzima antimicrobiana. A diluição em série usado nestes ensaios produziram quantidades de proteína final de ensaio de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 jag e 10 ug. </li><li> Execute cada ensaio de reação em uma microplaca de fundo de 48 poços plana. Para cada condição de ensaio, adicionar 10 ul de suspensão a respectiva proteína de 200 ul de suspensão de substrato preparado. Ajustar qualquer variação de volume da solução de proteína adicionada à reacção de 10 ul usando tampão de reacção. </li><li> Selar a microplaca com filme placa de vedação para evitar a variação de volume devido à evaporação. Incubar numa incubadora agitadora a o óptimo determinado notemperatura cubation para a proteína antimicrobiana dada durante 16 horas com agitação. </li><li> Após a incubação, prender a reacção por adição de 25 ul de etanol a cada poço e remover o substrato não digerido por centrifugação a 3000 xg durante 2 min. </li><li> Transferir 150 ul do sobrenadante de cada mistura de reacção para a reacção a uma microplaca de 96 poços de fundo plano, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento do substrato não digerido. </li><li> Para quantificar a actividade enzimática, medir a absorvância do sobrenadante a 595 nm usando um espectrofotómetro de microplacas. Uma reacção em branco, incubou-se com todos os componentes da reacção, com excepção da enzima, é utilizada para subtrair qualquer corante que liberta do substrato RBB-rotulado, devido à incubação. O aumento da absorvância pelo corante solúvel libertada para o sobrenadante do substrato marcado proporciona uma medida quantitativa de actividade enzimática. Nota: A variação de absorvância é representado por unidades de actividade (UA), onde 1 Resultados da UA emum aumento de 0,01 para a densidade óptica do sobrenadante da reacção de libertação do corante a 595 nm. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Anand, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+marine+bacteria+associated+with+sponges+from+the+waters+off+the+coast+of+South+East+India%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India.</a> Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).</li>
<li>Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+of+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins of gram-positive bacteria.</a> Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li>
<li>Riley, M. A., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecological+role+of+bacteriocins+in+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ecological role of bacteriocins in bacterial competition.</a> Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).</li>
<li>Tenover, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antimicrobial+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria.</a> Am J Med. 119, S3-S10 (2006).</li>
<li>Farris, M. H., Steinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitrecin+A%2C+an+endolysin-like+bacteriolytic+enzyme+from+a+newly+isolated+soil+streptomycete%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete.</a> Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).</li>
<li>Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysostaphin+Endopeptidase+Resistance+Gene+%28epr%29+Specifies+Modification+of+Peptidoglycan+Cross+Bridges+in+Staphylococcus+simulans+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 61, 2811(1995).</li>
<li>Srivastava, K. K., Siddique, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+peptidoglycan+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes.</a> Infect Immun. 7, 700-703 (1973).</li>
<li>Heilmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+peptidoglycan+of+the+cell+walls+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa.</a> Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchumann%2C+P+%22Taxonomy+of+Prokaryotes%22">Taxonomy of Prokaryotes</a>. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).</li>
<li>Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metachromatic+agar-diffusion+methods+for+detecting+staphylococcal+nuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity.</a> Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).</li>
<li>Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dye+release+assay+for+determination+of+lysostaphin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dye release assay for determination of lysostaphin activity.</a> Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).</li>
<li>Osserman, E. F., Lawlor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+urinary+lysozyme+%28muramidase%29+in+monocytic+and+monomyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia.</a> J Exp Med. 124, 921-952 (1966).</li>
<li>Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+quantitation+of+antigens+by+single+radial+immunodiffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion.</a> Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).</li>
<li>Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+lysozyme+using+Micrococcus+luteus+labeled+with+a+blue+dye%2C+Remazol+brilliant+blue+R%2C+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Pharm+Bull.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate.</a> Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).</li>
<li>Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymogram+with+Remazol+brilliant+blue-labeled+Micrococcus+lysodeikticus+cells+for+the+detection+of+lysozymes%3A+example+of+a+new+lysozyme+activity+in+Formosan+termite+defense+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions.</a> Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).</li>
<li>Pettersson, B., Eriksson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+spectrophotometric+assay+of+endoglycanase+activities+using+dyed%2C+amorphous+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides.</a> Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).</li>
<li>Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+chitin+stained+with+Remazol+Brilliant+Blue+R%2C+a+useful+substrate+to+select+chitinolytic+microorganisms+and+to+evaluate+chitinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases.</a> J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. O MITRE Corporation é uma empresa sem fins lucrativos que opera vários centros de pesquisa e desenvolvimento financiados pelo governo federal (FFRDCs).

O ensaio de difusão MicroSlide e no ensaio de corante-release fornecem vantagens para detectar e caracterizar antimicrobianos proteínas não identificadas anteriormente. Estes métodos rápidos e sensíveis permitir o rastreio de alto rendimento de bibliotecas de código do organismo para a identificação de enzimas de interesse antes de investir maiores recursos de pesquisa. Como enzimas alvo de alto nível são identificados, variações dos ensaios de detecção pode ser usado para detectar rapidamente a enzima ou para determinar as características bioquímicas da enzima. Por exemplo, durante um regime de vários passos de purificação de proteína, o ensaio de difusão microlâmina pode detectar rapidamente fracções que continham a enzima de interesse. Além disso, optima de reacção para a enzima pode ser determinada alterando os tampões de reacção e temperaturas de incubação no ensaio de libertação de corante. O intervalo de massa enzima necessária para a detecção no ensaio de difusão microlâmina é uma função da enzima caracteristics. limitações de detecção do ensaio geralmente requerem a utilização de maiores quantidades de enzima do que o ensaio de corante de libertação. Neste estudo, a comparação dos limites de detecção do ensaio de difusão microlâmina (Figura 1) para o ensaio de corante de libertação (Figura 4) ilustrou que o ensaio de difusão microlâmina é uma técnica menos sensível do que o ensaio de corante de libertação. Quando a concentração de enzima não é uma preocupação, o ensaio MicroSlide permite a triagem inicial rápida de bibliotecas para a produção de proteínas antimicrobianos contra substratos alvo com baixas exigências de trabalho e de equipamento. Embora exigindo mais esforço e equipamento, o ensaio de corante de libertação é mais sensível e reprodutível, obtendo-se resultados quantitativos que permitem a comparação entre ensaios de corante de libertação do mesmo ou de diferentes enzimas para um determinado substrato. Os dois métodos são facilmente realizados na maioria dos laboratórios microbiológicos sem necessidade de instrumentação altamente especializado. Na representaçãoensaios tivas, a enzima de controlo, α-quimotripsina, foi detectada em quantidades tão baixas quanto 100 ng (Figura 5) utilizando o ensaio de corante de libertação, enquanto o valor mínimo detectado no ensaio de difusão microlâmina foi de 1 mg (dados não mostrados). Fornecendo utilidade como um ensaio para a detecção qualitativa enzimas antimicrobianos, um número de variações do ensaio de difusão foram relatados 11,13. Ao rever estes ensaios, o ensaio de difusão MicroSlide foi desenvolvido para sua relativamente alta sensibilidade como uma tela inicial e por sua facilidade de observância reação. Modificado a partir do trabalho de Lachica et al. 11, na qual camadas de agarose foram usadas para detectar a produção de nucleases por estirpes de Staphylococcus aureus, o ensaio de difusão MicroSlide opera de forma semelhante ao método de imunodifusão radial 14 como a proteína difunde-se a partir do bem para a de agarose contendo o substrato. O immunodiffu radialmétodo sion interrompe a expansão da zona de imunoprecipitação quando o sistema atinge um equilíbrio de formação de complexo entre o antigénio e o anticorpo de difusão dentro da agarose. Em contraste, o substrato no ensaio de difusão microlâmina é inicialmente digerido pela proteína antimicrobiana de difusão numa zona em contínua expansão de lise em torno do poço. O diâmetro crescente da zona continua até que a enzima perde actividade ou o substrato é esgotado. A taxa de produção da zona de lise é acelerado como a pureza, e, assim, a actividade específica, da enzima ou a concentração da enzima adicionada ao poço aumenta. Para avaliar quantitativamente a actividade enzimática da proteína antimicrobianos contra morta pelo calor B. subtilis, foi escolhido o ensaio de corante-release. ensaios colorimétricos utilizando Remazol brilhante corante azul R (RBB) marcado com substratos permitir a avaliação versátil e sensível de proteínas activi antimicrobianaty. A hidrólise enzimática de substrato resultados RBB-rotulados na libertação de produtos solúveis azuis que podem ser facilmente medida por um espectrofotómetro a 595 nm. Diversas variações do ensaio de libertação de corante RBB, desenvolvidas para caracterizar outras proteínas, enzimas antimicrobianos mostrar a flexibilidade deste ensaio para aplicação com outros substratos. Por exemplo, para determinar os efeitos da actividade de lisostafina bacteriolíticos, Zhou, et al., Relataram um ensaio de corante de libertação utilizando células de estafilococos RBB-tingido e estafilococos peptidoglicano como substratos 12. Numa modificação da aplicação do presente ensaio de corante de libertação RBB, RBB-rotulados substrato Micrococcus luteus foi proposto para utilização como um meio rápido e sensível para o diagnóstico e a tela para as doenças tais como a infecção bacteriana e a presença de um carcinoma maligno, que pode ser correlacionada com os níveis de expressão de lisozima em soro de sangue humano 15. Além disso, os substratos de células bacterianas RBB-marcados ter umalso sido utilizada num método para a detecção zimograma de lisozima 16. Demonstramos o limite de detecção reduzido, conveniência, e a reprodutibilidade do ensaio de corante de libertação, permitindo a rápida rastreio da biblioteca para a produção da enzima. As modificações do ensaio permitir para ensaios de caracterização jusante quantitativos bioquímicos, incluindo efeitos da temperatura, pH, salinidade e, bem como os efeitos de outras enzimas proteolíticas sobre a actividade de proteínas antimicrobianas 6. Além disso, o ensaio de corante de libertação quantitativa pode ser utilizado para comparar as actividades de várias enzimas para um determinado substrato. O ensaio de libertação de corante RBB relatou utilidade para enzimas com actividade contra polissacáridos em adição à caracterização e a detecção de agentes antimicrobianos de proteína. Pettersson e Eriksson relatado um ensaio para detectar a actividade endoglicanase usando amorfos, grânulos de polissacarídeos RBB-tingidos de celulose, xilana, manana, e bilheteem 17. Em uma expansão destes resultados, um método sensível para detecção de enzimas quitinase produzidos por Bacillus thuringiensis Bt-107 foi desenvolvido utilizando quitina coloidal marcado com RBB 18. A partir destes e outros estudos, as fontes disponíveis comercialmente de substratos tingidos RBB-surgiram para utilização na detecção da actividade glicolítica, incluindo aquelas contra a queratina, amilopectina, amilose, glicogénio, laminarina, d-xilano, Azo-glucano de cevada, e amido. Neste estudo, que demonstram a utilidade do ensaio de corante de libertação em um formato de microplacas, reduzindo o volume de substrato de RBB-marcados e enzima requerida para produzir o resultado colorimétrico. Tal como ilustrado na Figura 4 e na Figura 5, o ensaio de corante de libertação de microplacas proporciona um limite de detecção inferior do que o ensaio de difusão microlâmina para a detecção de actividade enzimática. No que diz respeito ao uso rápido, conservação do trabalho, e facilidade de interpretação, o micensaio de difusão roslide fornece utilidade em telas de alto rendimento iniciais para a presença de actividade antimicrobiana, bem como a indicação da presença de proteína antimicrobiana nos passos de isolamento e purificação de proteínas a jusante. A combinação destes dois ensaios complementam um ao outro na triagem inicial e final caracterização de novos agentes antimicrobianos proteínas

Os agentes antimicrobianos desempenham um papel essencial no direcionamento de uma ampla gama de microrganismos, como vírus, fungos e bactérias. As atividades antimicrobianas produzidas por várias bactérias variam em especificidade alvo de amplo espectro a espécie-específica, incluindo patógenos bacterianos clinicamente relevantes 1. Na natureza, compostos antimicrobianos proteicos como bacteriocinas e lisinas representam um arsenal microbiano de ferramentas para autodefesa, replicação e aquisição de nutrientes 2,3. Servindo como mediadores da dinâmica populacional dentro das comunidades microbianas, os antimicrobianos proteicos fornecem uma vantagem competitiva ao organismo produtor sobre as espécies sensíveis e não produtoras 4. Como enzimas recombinantes e probióticos, essas proteínas também têm uma importância econômica e social, pois a necessidade de novas fontes de controle de patógenos aumenta a cada nova expansão da resistência antimicrobiana na população bacteriana 5.
As primeiras avaliações de antimicrobianos proteicos recém-descobertos incluem a determinação das características físicas básicas inerentes à enzima. Métodos para triagem rápida de potenciais antimicrobianos permitem a seleção de candidatos com atividades hidrolíticas contra os substratos-alvo desejados. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio quantitativo de liberação de corante permitem o uso de uma variedade de substratos na detecção de hidrólise enzimática. Para enzimas antimicrobianas proteicas com atividade contra a parede celular bacteriana, a versatilidade desses ensaios permite uma triagem rápida e eficaz, qualitativa e quantitativa contra células bacterianas viáveis (somente ensaio de microlâmina), substratos de células bacterianas inteiras mortas pelo calor ou peptidoglicano purificado da bactéria alvo. Esses ensaios têm utilidade na descoberta de enzimas antimicrobianas para uso em campos como terapêuticas alternativas, suplementos alimentares e inibidores da produção de biofilme.
O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante são métodos demonstrados para detecção e caracterização de novos antimicrobianos proteicos. O ensaio de difusão em microlâminas fornece uma estimativa relativa (qualitativa) da atividade antimicrobiana e permite uma inferência mínima da concentração e atividade da enzima. Usando este método, a atividade é prontamente visualizada como o desenvolvimento de uma zona de lise com a ausência de atividade, resultando na falta de formação de zonas. A taxa de desenvolvimento da zona e o diâmetro da zona são indicativos da quantidade e pureza da enzima presente na amostra; no entanto, essa taxa e a qualidade da limpeza do substrato dentro da zona também podem ser afetadas pela presença de contaminantes, pela integridade da reação de hidrólise e pelo tipo de substrato. Contaminantes interferentes podem afetar a taxa de difusão enzimática do poço, enquanto hidrólise incompleta ou variação do tipo de substrato pode resultar em uma zona turva de lise 6.
O ensaio de liberação de corante avalia quantitativamente a quantidade de produtos de corante R azul brilhante de Remazol ligados covalentemente liberados no sobrenadante de reação do substrato hidrolisado enzimaticamente. O método tem apenas uma ligeira variabilidade associada a uma diferença no substrato, permitindo assim maior sensibilidade para detecção de hidrólise em comparação com o ensaio de difusão em microlâminas. Essas propriedades permitem que o método tenha utilidade na caracterização das propriedades bioquímicas da enzima e na padronização do ensaio para comparação entre diferentes enzimas antimicrobianas.
Neste protocolo, fornecemos métodos para realizar o ensaio básico de difusão de microlâminas e o ensaio de liberação de corante, demonstrando a escala dos limites de detecção e variabilidade para cada um. Os ensaios são usados para realizar avaliações básicas de um antimicrobiano proteico desconhecido purificado do sobrenadante da cultura de um isolado bacteriano de solo não caracterizado. As atividades observadas contra substratos de células bacterianas nos ensaios permitem a comparação das atividades de reação entre um antimicrobiano proteico não caracterizado anteriormente e a α-quimotripsina, uma enzima proteolítica de controle. Esses protocolos fornecem uma base para a aplicação das duas técnicas que podem ser expandidas e modificadas para acomodar aplicações variadas.

<table><tbody><tr><td>Microplaca de fundo plano de 48 poços com tampa de baixa evaporação</td><td>Becton Dickinson</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de fundo plano de 96 poços (Costar 3595)</td><td>Corning, Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-quimotripsina</td><td>MP Biomedicals</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 168</td><td>American Type Culture Collection</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Broca de cortiça Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Humboldt</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de equivalência McFarland (2.0)</td><td>Microlâminas Fisher Scientific</td><td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>Caldo nutriente</td><td></td><td>Fisher</td> Scientific 22-38-103 Fisher Scientific S25959B <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> peptidoglicano de Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (1x)</td>Kit de ensaio de proteína <td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT espectrofotômetro de microplacas</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corante R azul brilhante Remazol (RBB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica subsp. enterica</td><td>American Type Culture Collection</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>azida de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Titer Tops filme de polietileno adesivo pré-cortado</td><td>Diversified Biotechnology</td><td>T-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução de agarose 50 ml PBS 0,25 g de agarose</td><td></td><td></td><td>Adicione 10% de azida de sódio à solução de PBS/agarose fundida</td></tr><tr><td>meio de caldo nutritivo 4 g de caldo de nutrientes 500 ml de água</td><td></td><td></td><td></td>tipo I</tr><tr><td>250 mM solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1 g de NaOH 99 ml de água</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tipo I200 mM de corante R azul brilhante de remazol (RBB) 1,25 g RBB 98,75 ml de solução</td><td></td><td></td><td></td> de NaOH a 250 mM</tr></tbody></table>

qualitativos e quantitativos os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos proteína

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

As avaliações iniciais de grandes bibliotecas microbianas para potenciais produtores de novas proteínas antimicrobianas requerem métodos qualitativos e quantitativos para rastrear enzimas-alvo antes de investir maior esforço e recursos de pesquisa. O objetivo deste protocolo é demonstrar dois ensaios complementares para a realização dessas avaliações iniciais. O ensaio de difusão em microlâminas fornece uma tela de detecção inicial ou simples para permitir a avaliação qualitativa e rápida da atividade proteolítica contra uma variedade de substratos-alvo bacterianos viáveis e mortos pelo calor. Como contrapartida, o aumento da sensibilidade e reprodutibilidade do ensaio de liberação de corante fornece uma plataforma quantitativa para avaliar e comparar as influências ambientais que afetam a atividade hidrolítica dos antimicrobianos proteicos. A capacidade de rotular substratos específicos de cultura de células mortas pelo calor com o corante R azul brilhante Remazol expande essa capacidade de adaptar o ensaio de liberação de corante para caracterizar a atividade enzimática de interesse.

O ensaio de difusão MicroSlide e no ensaio de corante-release quantitativa são métodos eficazes para o rastreio e medição investigações iniciais de novos antimicrobianos proteínas. Cada ensaio tem vantagens e limitações; No entanto, quando realizado em conjunto, eles permitem o rastreio inicial rápida e caracterização de base de um agente antimicrobiano. O ensaio de difusão MicroSlide permite de forma eficiente para a pesquisa rápida de bibliotecas microbianas, produzindo proteína antimicrobianos. Quando os níveis de concentração da enzima é de preocupação, a sensibilidade de detecção de constrangimentos podem limitar o ensaio, o que requer uma maior quantidade de enzima a ser adicionada à reacção bem que o ensaio de corante de libertação. Tal como ilustrado na Figura 1, as propriedades qualitativas do ensaio permitir que o observador para comparar quantidades relativas de enzimas presentes dentro de cada poço. Figura 1A (25? g de enzima), o bordo de ataque da zona exibe lise turva ou incompleta do substrato, enquanto que a zona mais próxima do poço exibe um substrato de lise mais completa. Este fenómeno, um produto de diminuição da concentração do enzima de difusão na vanguarda, dificulta a medição exacta do diâmetro da zona. Como os poços B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 g), e F (0,1 ug) são observadas na Figura 1, o diâmetro da zona de lise completa dissipa à extinção correlacionando-se com a diminuição da quantidade de enzima. Para condição F (0,1 ug), a concentração de enzima dentro da agarose é inferior ao limite que permita a difusão da enzima para ser visualizado como ele se move através da agarose, a hidrólise do substrato. O ensaio de difusão MicroSlide também foi executado usando purificados Bacillus subtilis Peptidoglycan como substrato (Figura 2). Enquanto a zona é menos definida do que aqueles observados com células inteiras de Salmonella enterica devido à relutância dos peptidoglicanos para suspender uniformemente no agarose, a hidrólise do peptidoglicano pela enzima antimicrobianos desconhecido é aparente. O ensaio de libertação de corante é um ensaio mais sensível e versátil do que o ensaio de difusão microlâmina, permitindo que um limite de detecção inferior e variação dos factores ambientais que afectam a reacção enzimática. Em ensaios representativos, a temperatura foi alterada para determinar a temperatura óptima para a enzima antimicrobiana, determinada para ser de 35 ° C em PBS (Figura 3). Este óptimo é visto claramente nos sobrenadantes de reacção como o aumento das quantidades de cor azul (Figura 3B), bem como representada em unidades de actividade derivadas de medições de absorvância a 595 nm (Figura 3A). oversatilidade do ensaio de corante de libertação permite ao investigador que variam não só as temperaturas, mas também o tampão de reacção e os componentes do tampão de determinar rapidamente as condições de incubação óptimo para uma dada enzima. O nível de enzima desconhecido antimicrobiana (Figura 4) e a enzima de controlo α-quimotripsina (Figura 5) actividade foram medidos à temperatura de incubação ideal determinada de 35 ° C em PBS contra substrato morta pelo calor Bacillus subtilis RBB-rotulados. A comparação dos resultados da Figura 4 e Figura 5 indica que a enzima antimicrobianos desconhecido tem quase duas vezes a afinidade para o B. substrato subtilis. Além disso, o controlo α-quimotripsina não digerir completamente o B. morta pelo calor subtilis substrato dentro do poço (dados não mostrados). A actividade do controlo α-quimotripsina começa a chapearau cerca de 0,3 ug, em comparação com o aumento contínuo em unidades de actividade em todas as quantidades de enzimas para a enzima antimicrobianos desconhecido (Figura 4 e Figura 5). Isto pode indicar que a enzima desconhecido tem uma maior actividade sustentada ou que há um maior número de locais de clivagem disponível para a enzima dentro do B. substrato subtilis. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> Figura 1:. Actividade da Enzima contra Salmonella enterica Total substrato celular O ensaio de difusão microlâmina foi utilizado para avaliar qualitativamente a actividade antimicrobiana de uma proteína desconhecida contra Salmonella enterica subsp morta pelo calor entérica (ATCC 10708).. As massas de proteína antimicrobiana do desconhecido suspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) que foram adicionadas aos respectivos poçosas lâminas incluídos 25 ug (poço A), 15 ug (bem B), 10 ug (bem C), 5 ug (D bem), 1 ug (bem E), e 0,1 ug (bem F). PBS foi usado para os controlos negativos dos ensaios. Zonas de lise foram fotografadas após uma incubação de 6 horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> Figura 2:. Actividade da Enzima contra o Bacillus subtilis celular peptidoglicano da parede O ensaio de difusão microlâmina foi utilizado para avaliar qualitativamente a actividade antimicrobiana de uma proteína desconhecida com peptidoglicano de Bacillus subtilis 168. Suspendido em 20 ul de PBS, 10? G do antimicrobiano desconhecido foi adicionado a bem Um dos microslides. PBS foi usado como um negativode controlo para o ensaio (bem B). A zona de lise foi fotografada após um período de incubação de 6 horas a 37 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> Figura 3:. Temperatura de reacção óptima para uma proteína antimicrobiana A versatilidade do ensaio de libertação de corante permite a variação de parâmetros físicos e químicos, tais como temperaturas e tampões de incubação, para determinar as suas influências sobre a actividade da enzima de interesse 6. Conforme ilustrado nesta figura, a actividade antimicrobiana da proteína desconhecida (1 ug) foi avaliada em PBS contra Bacillus subtilis mortas pelo calor RBB-rotulados sob uma gama de temperaturas de incubação. Exibidas como unidades de actividade (UA) em (A), a absorção da RBB-bound produtos libertada para o sobrenadante após a hidrólise foi medida a 595 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas. Em cada condição de temperatura, reacções sem enzima adicionada foram usadas para subtrair os efeitos de qualquer corante libertado que resultou da incubação às várias temperaturas. Os sobrenadantes de reacção correspondentes a cada temperatura de incubação foram fotografadas antes da medição de absorbância (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> Figura 4:. Gama de actividade para uma proteína antimicrobiana A gama de actividade para o antimicrobiano proteína desconhecida foi medida como unidades de actividade após incubações durante a noite para 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, e 1000 ng , tal como medido pelo BCA Protensaio ein (A). Para estas reacções, o RBB-rotulados B. subtilis nível do substrato foi aumentada para se obter uma densidade óptica de 5,0 a 595 nm para assegurar que a reacção com a maior quantidade de enzima (1,000 ng) não hidrolisam completamente todo o substrato disponível dentro do período de incubação da reacção. As reacções de controlo sem enzima adicionada foram usadas para subtrair os efeitos de qualquer corante libertado causada por si só a incubação. Os sobrenadantes de reacção correspondentes a cada quantidade de enzima foram fotografadas antes de medições de absorvância (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> Figura 5:. Gama de actividades para α-Quimotripsina A gama de actividade para α-quimotripsina foi medida como activunidades ity após incubações durante a noite para 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1000 ng de enzima (A). Para estas reacções, o RBB-rotulados B. subtilis nível do substrato foi aumentada para se obter uma densidade óptica de 5,0 a 595 nm para assegurar que a reacção com a maior quantidade de enzima (1,000 ng) não hidrolisam completamente todo o substrato disponível dentro do período de incubação da reacção. As reacções de controlo sem enzima adicionada foram usadas para subtrair os efeitos de qualquer corante libertado causada por si só a incubação. Os sobrenadantes de reacção correspondentes a cada quantidade de enzima foram fotografadas antes de medições de absorvância (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos protocolos para rastrear e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante utilizam substratos bacterianos alvo para avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

O objetivo geral desses experimentos é triar e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O teste de difusão em microplaca e o ensaio de liberação de corante são úteis para a descoberta funcional de novos antimicrobianos com atividade lítica contra alvos específicos, como uma bactéria patogênica de interesse. As principais vantagens dessas técnicas são sua simplicidade de execução, a flexibilidade para variação dos parâmetros experimentais e a possibilidade de realização com equipamentos de laboratório comumente encontrados na maioria dos laboratórios de microbiologia.Antes de iniciar o ensaio de difusão em microplaca, a concentração da enzima antimicrobiana a ser avaliada deve ser determinada utilizando um kit de ensaio proteico BCA, de acordo com o protocolo do fabricante. Realize uma diluição em série da enzima antimicrobiana, utilizando PBS como tampão de reação. Distribua a proteína em tubos microcêntrifugos individuais e ajuste os volumes para 20 mililitros utilizando PBS.Em seguida, prepare uma solução de agarose a 0,5% dissolvendo 0,25 gramas de agarose em 50 mililitros de PBS. Aqueça esta solução até ferver até que a agarose esteja completamente dissolvida. Determine a perda de água durante o processo de fusão por meio de pesagem e reponha na solução.Para inibir o crescimento bacteriano contaminante durante a incubação do ensaio, adicione 15 microlitros de azida de sódio a 10% em água à solução de agarose e ajuste a temperatura da solução para 50 graus Celsius em banho-maria. Se células viáveis forem usadas como substrato, omita a azida de sódio da solução de agarose. Deixe o substrato bacteriano inativado pelo calor descongelar no gelo.Resuspenda o substrato bacteriano em 12 mililitros da solução de agarose para corresponder aproximadamente à turbidez de um padrão de turbidez equivalente a 2,0 McFarland. Compare as turbidezes das soluções visualizando uma linha preta sobre um fundo branco através das soluções, adicionando substrato bacteriano à agarose até que a turbidez aproximada seja alcançada. Imediatamente, mas com cuidado, pipete três mililitros da solução de substrato de agarose para cada microplaca, certificando-se de que a solução não transborde a microplaca.Após as lâminas terem solidificado, use um furador de cortiça com diâmetro de 4,8 milímetros para fazer três poços na camada de substrato de agarose de cada micro-lâmina. Adicione 20 microlitros de cada diluição seriada ajustada de proteína aos poços respectivos. Utilize albumina sérica bovina em um poço de controle negativo.Como controle positivo, utilize enzimas bacteriolíticas conhecidas, apropriadas para o substrato, como a lisozima. Incube as lâminas em uma câmara úmida a 37 graus Celsius, ou na temperatura ótima de atividade da enzima. A duração da incubação depende da concentração e da atividade específica da enzima antimicrobiana.Um tempo de reação típico é de aproximadamente 16 horas. Quando a incubação estiver concluída, observe as lâminas sob luz indireta e capture imagens do ensaio em desenvolvimento. Utilize uma câmera digital de lente única com uma lente de 60 milímetros a uma distância focal de aproximadamente 30 centímetros.No ensaio de liberação de corante demonstrado no próximo segmento, o substrato é ligado covalentemente ao corante Remazol Brilliant Blue R ou RBB. Inicie este protocolo preparando uma solução de RBB a 200 milimolares. Dissolva 1,25 gramas de RBB em uma solução recém-preparada de hidróxido de sódio.Em seguida, re-suspenda as células bacterianas mortas pelo calor numa concentração de 0,5 gramas de peso úmido em 30 mililitros de solução RBB. Para peptidoglicano purificado, re-suspenda o peptidoglicano numa concentração de 0,3 gramas de peso úmido em 30 mililitros de solução RBB. Como os passos subsequentes são os mesmos, independentemente do substrato utilizado, a marcação será demonstrada apenas para as células bacterianas.Incube a mistura de reação em uma plataforma rotativa por seis horas a 37 graus Celsius com mistura suave. Após seis horas, transfira a mistura de reação para uma incubadora a quatro graus Celsius e incube por mais 12 horas com mistura suave. Quando a incubação estiver concluída, recolha o substrato corado por centrifugação a 3000 x g por 30 minutos.Decante a solução de corante do pellet do substrato. Reuspenda completamente o pellet em água tipo I, seguido por centrifugação. Lave as células marcadas com corante três a cinco vezes desta maneira para remover o corante solúvel não ligado covalentemente dos substratos.Para as lavagens finais, transfira a porção do pellet que será utilizada no ensaio de liberação de corante para tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. O sobrenadante da última lavagem deve estar claro, enquanto o substrato permanece azul. Armazene o substrato corado suspenso em uma quantidade mínima de água a 20 graus Celsius até o momento do uso.Para preparar o ensaio de liberação de corante, deixe o substrato corado congelado atingir a temperatura ambiente e lave-o duas vezes com o tampão de ensaio determinado empiricamente para a enzima. Neste caso, utiliza-se PBS. Calcule o volume da suspensão de substrato necessário multiplicando o volume da reação de 200 microlitros pelo número de ensaios de liberação de corante a serem realizados.Para preparar a suspensão do substrato, primeiro adicione o substrato corado ao volume apropriado de PBS. Faça uma diluição um para um e realize uma medida inicial da densidade óptica em 595 nanômetros, utilizando PBS como branco. Adicione quantidades crescentes do substrato corado à suspensão até atingir uma densidade óptica de 2,0 em 595 nanômetros.Nesta demonstração, o ensaio de liberação de corante será utilizado para determinar as condições ideais de incubação para um antimicrobiano proteico. Primeiro, prepare uma suspensão estoque do antimicrobiano proteico ajustando a concentração para um miligrama por mililitro usando PBS conforme descrito no texto do protocolo. Em seguida, dilua a suspensão estoque do antimicrobiano proteico para uma concentração de 100 nanogramas por microlitro.Essa concentração fornece uma massa final de reação de um micrograma de proteína por volume adicionado à reação do ensaio. Realize os ensaios de reação em tubos microcêntrifuga de 0,5 mililitro para a faixa térmica a ser avaliada. Para cada condição térmica, adicione 10 microlitros da proteína estoque a 200 microlitros da suspensão de substrato preparada.Incube em um termociclador por oito horas, com mistura por inversão a cada hora. Após a incubação, interrompa as reações adicionando 25 microlitros de etanol a cada tubo microcêntrifuga. Para remover o substrato insolúvel não digerido, centrifugue a 3000 x g durante dois minutos.Após isso, tomando cuidado para não perturbar o pellet de substrato não digerido, transfira 150 microlitros do sobrenadante da reação de cada mistura de reação para uma microplaca de 96 poços com fundo plano. Para quantificar a atividade enzimática, utilize um espectrofotômetro de microplaca para medir a absorbância do sobrenadante a 595 nanômetros. O aumento da absorbância provocado pelo corante solúvel liberado no sobrenadante a partir do substrato marcado representa uma medida quantitativa da atividade enzimática.O ensaio de difusão em lâmina foi utilizado para avaliar qualitativamente a atividade de uma proteína antimicrobiana desconhecida contra uma matriz de células inteiras de Salmonella enterica mortas pelo calor. O agente antimicrobiano foi adicionado em quantidades crescentes dos poços A até F, e o PBS foi utilizado como controle negativo. Após seis horas, foi observado o tamanho da zona clara de hidrólise formada ao redor de cada poço.A alta atividade enzimática está qualitativamente relacionada a uma zona maior, enquanto a baixa atividade enzimática está qualitativamente relacionada a uma zona menor. O ensaio quantitativo de liberação de corante foi utilizado para determinar a temperatura de reação ideal para um antimicrobiano proteico. Conforme observado pelas quantidades de cor azul nos sobrenadantes da reação e pelas unidades de atividade derivadas das medidas de absorbância a 595 nanômetros, 35 graus Celsius é a temperatura ideal.O ensaio de liberação de corante também foi utilizado para determinar a faixa de atividade de uma proteína antimicrobiana desconhecida contra um substrato de Bacillus subtilis inativado pelo calor. Uma comparação com a faixa de atividade da alfa-quimotripsina revelou que a enzima antimicrobiana desconhecida possui quase o dobro da afinidade pelo substrato. Além disso, enquanto a atividade da alfa-quimotripsina começa a se estabilizar em torno de 0,3 microgramas, a atividade da enzima desconhecida continuou a aumentar em todas as quantidades testadas da enzima.Uma vez dominado, o ensaio de difusão em microplaca pode ser concluído em até 30 minutos. O ensaio de liberação de corante pode ser concluído em até uma hora. Os tempos de incubação para cada ensaio dependerão da atividade enzimática e das suas concentrações.Ampliando esses procedimentos, o método de liberação de corante pode ser modificado para determinar as influências químicas que afetam a atividade enzimática da enzima antimicrobiana, manipulando aspectos da reação, como pH do tampão e salinidade. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como triar e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana utilizando os ensaios de difusão em lâmina e de liberação de corante.

qualitative-quantitative-assays-for-detection-characterization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o ensaio de liberação de corante para quantificar a atividade enzimática de proteínas antimicrobianas. A proteína antimicrobiana degrada a parede celular marcada com corante da bactéria e libera as moléculas de corante tornando a solução azul. A absorbância da solução se correlaciona com a atividade enzimática da proteína antimicrobiana.

Um ensaio de liberação de corante para quantificar a atividade enzimática de proteínas antimicrobianas

Resistência adquirida aos antibióticos é um grande problema de saúde pública e é atualmente classificada pela OMS como uma das maiores ameaças à vida humana. Aqui descrevemos o uso da tecnologia do cantilever para quantificar a resistência antibacteriana, fundamental para a descoberta de novos agentes e poderosa contra bactérias resistentes a múltiplas drogas.

Nanomecânica de interações medicamentosas-alvo e de detecção de resistência antibacteriana

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

Este artigo descreve um método de microarray de proteína simples para perfilação humorais respostas imunes a um painel de 7-plex de altamente purificado antígenos de Clostridium difficile em soros humanos. O protocolo pode ser estendido para a determinação de respostas de anticorpos específicos em preparações de imunoglobulina intravenosa policlonal.

Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

O protocolo apresenta o Escherichia coli-baseado pressão seletiva incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) a lactococcal peptídeo antimicrobiano nisina. Suas propriedades podem ser alteradas durante a expressão recombinantes através de substituição com ncAAs desejado em meios de crescimento definido. As alterações resultantes na Bioatividade são mapeadas por ensaios de inibição de crescimento e de microscopia de fluorescência.

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

Antimicrobiana sinergia teste é usado para avaliar o efeito de dois ou mais antibióticos usados em combinação e é normalmente realizada por um dos dois métodos: a matriz do tabuleiro de damas ou o ensaio de matar tempo. Aqui, apresentamos um automatizado, jato de tinta impressora assistida quadriculado matriz sinergia técnica e um estudo clássico sinergia... matar tempo.

Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e identificação de bactérias resistentes a antibióticos da água e a caracterização molecular de seus genes de resistência a antibióticos (ARGs). O uso de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica) fornece informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em águas doces de Mumbai, Índia.

Isolamento e Identificação de Bactérias Resistentes a Antibióticos Transmitidos pela Água e Caracterização Molecular de seus Genes de Resistência a Antibióticos

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda...

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Aprenda ensaios de difusão em microslide e liberação de corante para triagem rápida de enzimas antimicrobianas. Estes métodos simples permitem avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática contra bactérias patogênicas.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Explorar mais vídeos