Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

O objetivo geral desses experimentos é rastrear e caracterizar rapidamente as enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e liberação de corante tem utilidade para a descoberta funcional de novos antimicrobianos com atividade lítica contra alvos específicos, como uma bactéria patogênica de interesse. As principais vantagens dessas técnicas são que elas são simples de executar, proporcionam flexibilidade para variação de parâmetros experimentais e podem ser realizadas com equipamentos de laboratório comumente encontrados na maioria dos laboratórios de microbiologia.

Antes de iniciar o ensaio de difusão em microlâminas, a concentração da enzima antimicrobiana a ser avaliada deve ser determinada usando um kit de ensaio de proteína BCA, de acordo com o protocolo do fabricante. Efectuar uma diluição em série da enzima antimicrobiana, utilizando PBS como tampão de reacção. Dispense a proteína em tubos de microcentrífugas individuais e ajuste os volumes para 20 mililitros usando PBS.

Em seguida, prepare uma solução de agarose a 0,5% dissolvendo 0,25 gramas de agarose em 50 mililitros de PBS. Aqueça esta solução até ferver até que a agarose esteja completamente dissolvida. Determine a água perdida durante o processo de fusão por peso e adicione de volta à solução.

Para inibir o crescimento bacteriano contaminante durante a incubação do ensaio, adicione 15 microlitros de azida de sódio a 10% em água à solução de agarose e ajuste a temperatura da solução para 50 graus Celsius em banho-maria. Se forem utilizadas células viáveis como substrato, omitir a azida sódica da solução de agarose. Descongele o substrato bacteriano morto pelo calor no gelo.

Ressuspenda o substrato bacteriano em 12 mililitros da solução de agarose para corresponder aproximadamente à turbidez de um padrão de turbidez de equivalência de McFarland 2.0. Compare as turbidez das soluções visualizando uma linha preta em um fundo branco através das soluções, adicionando substrato bacteriano à agarose até que a turbidez aproximada seja alcançada. Imediatamente, mas com cuidado, pipete três mililitros da solução de substrato de agarose para cada microlâmina, certificando-se de que a solução não transborde da microlâmina.

Depois que as lâminas solidificarem, use uma broca de cortiça de 4,8 milímetros de diâmetro para perfurar três poços na camada de substrato de agarose de cada microlâmina. Adicione 20 microlitros de cada diluição serial de proteína ajustada aos respectivos poços. Use albumina de soro bovino em um poço de controle negativo.

Como controle positivo, use enzimas bacteriolíticas conhecidas apropriadas para o substrato, como a lisozima. Incube as lâminas em uma câmara de umidade a 37 graus Celsius, ou a temperatura ideal de atividade da enzima. A duração da incubação depende da concentração e da atividade específica da enzima antimicrobiana.

Um tempo de reação típico é de aproximadamente 16 horas. Quando a incubação estiver completa, observe as lâminas sob luz indireta e capture imagens do ensaio de revelação. Use uma câmera digital reflex de lente única com lente de 60 milímetros a uma distância focal de aproximadamente 30 centímetros.

No ensaio de liberação de corante a ser demonstrado no próximo segmento, o substrato é covalentemente ligado ao corante Remazol Brilliant Blue R ou RBB. Comece este protocolo fazendo uma solução RBB de 200 miliMolar. Dissolva 1,25 gramas de RBB em uma solução de hidróxido de sódio recém-preparada.

Em seguida, ressuspenda as células bacterianas mortas pelo calor a uma concentração de 0,5 gramas de peso úmido em 30 mililitros de solução RBB. Para peptidoglicano purificado, ressuspenda o peptidoglicano a uma concentração de 0,3 gramas de peso úmido em 30 mililitros de solução de RBB. Como as etapas subsequentes são as mesmas, independentemente do substrato usado, a marcação será demonstrada apenas para as células bacterianas.

Incube a mistura de reação em uma plataforma rotativa por seis horas a 37 graus Celsius com uma mistura suave. Após seis horas, transfira a mistura de reação para uma incubadora de quatro graus Celsius e incube por mais 12 horas com uma mistura suave. Quando a incubação estiver completa, colher o substrato tingido por centrifugação a 3000 x g durante 30 minutos.

Transvase a solução de corante do sedimento de substrato. Ressuspender completamente o pellet em água Tipo I, seguida de centrifugação. Regue as células marcadas com corante três a cinco vezes dessa maneira para remover o corante solúvel ligado não covalentemente dos substratos.

Para as lavagens finais, transfira a porção do pellet que será usada no ensaio de liberação de corante para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. O sobrenadante da última lavagem deve ser límpido, enquanto o substrato permanece azul. Armazene o substrato tingido suspenso em uma quantidade mínima de água a 20 graus Celsius até que esteja pronto para uso.

Para se preparar para o ensaio de liberação de corante, deixe o substrato tingido congelado retornar à temperatura ambiente e lave duas vezes com o tampão de ensaio que foi determinado empiricamente para a enzima. PBS é usado neste caso. Calcule o volume da suspensão de substrato necessário multiplicando o volume de reação de 200 microlitros pelo número de ensaios de liberação de corante a serem realizados.

Para preparar a suspensão do substrato, primeiro adicione o substrato tingido ao volume apropriado de PBS. Faça uma diluição de um para um e faça uma medição inicial da densidade óptica em 595 nanômetros, usando PBS como um branco. Adicionar quantidades incrementais do substrato tingido à suspensão até obter uma densidade óptica de 2,0 a 595 nanômetros.

Nesta demonstração, o ensaio de liberação de corante será usado para determinar as condições ideais de incubação para um antimicrobiano proteico. Primeiro, prepare uma suspensão antimicrobiana de proteína estoque ajustando a concentração para um miligrama por mililitro usando PBS conforme descrito no texto do protocolo. Em seguida, diluir a suspensão antimicrobiana de proteínas de reserva até uma concentração de 100 nanogramas por microlitro.

Esta concentração dá uma massa de reação final de um micrograma de proteína por volume adicionado à reação do ensaio. Realize os ensaios de reação em tubos de microcentrífugas de 0,5 mililitro para a faixa térmica a ser avaliada. Para cada condição térmica, adicione 10 microlitros da proteína estoque a 200 microlitros de suspensão de substrato preparada.

Incubar em um termociclador por oito horas com mistura por inversão uma vez por hora. Após a incubação, interrompa as reações adicionando 25 microlitros de etanol a cada tubo de microcentrífuga. Para remover o substrato insolúvel não digerido, centrifugue a 3000 x g por dois minutos.

Depois disso, tomando cuidado para não romper o pellet de substrato não digerido, transfira 150 microlitros do sobrenadante de reação para cada mistura de reação para uma microplaca de fundo plano de 96 poços. Para quantificar a atividade enzimática, use um espectrofotômetro de microplacas para medir a absorbância do sobrenadante em 595 nanômetros. O aumento da absorbância pelo corante solúvel liberado no sobrenadante a partir do substrato marcado é uma medida quantitativa da atividade enzimática.

O ensaio de difusão em microlâminas foi usado para avaliar qualitativamente a atividade de um antimicrobiano proteico desconhecido contra o substrato de células inteiras de Salmonella enterica morta pelo calor. O antimicrobiano foi adicionado em quantidades crescentes dos poços A a F, e o PBS foi usado para controles negativos. Após seis horas, foi observado o tamanho da zona clara de hidrólise que se formou ao redor de cada poço.

A alta atividade enzimática está qualitativamente relacionada a uma zona maior, enquanto a baixa atividade enzimática está qualitativamente relacionada a uma zona menor. O ensaio quantitativo de liberação de corante foi usado para determinar a temperatura de reação ideal para um antimicrobiano proteico. Como visto pelas quantidades de cor azul nos sobrenadantes de reação e pelas unidades de atividade derivadas das medições de absorbância a 595 nanômetros, 35 graus Celsius é a temperatura ideal.

O ensaio de liberação de corante também foi usado para determinar a faixa de atividade de um antimicrobiano proteico desconhecido contra o substrato morto pelo calor de Bacillus subtilis. Uma comparação com a faixa de atividade da alfa-quimotripsina revelou que a enzima antimicrobiana desconhecida tem quase o dobro da afinidade pelo substrato. Além disso, enquanto a atividade da alfa-quimotripsina começa a se estabilizar em torno de 0,3 microgramas, a atividade da enzima desconhecida continuou a aumentar em todas as quantidades de enzimas.

Uma vez dominado, o ensaio de difusão em microlâminas pode ser concluído em 30 minutos. O ensaio de liberação de corante pode ser concluído em uma hora. Os tempos de incubação para cada ensaio dependerão da atividade enzimática e de suas concentrações.

Expandindo esses procedimentos, o método de liberação de corante pode ser modificado para determinar as influências químicas que afetam a atividade enzimática da enzima antimicrobiana, manipulando aspectos da reação, como pH e salinidade do tampão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear e caracterizar rapidamente as enzimas quanto à atividade antimicrobiana usando os ensaios de difusão de microlâminas e liberação de corante.