Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Os objetivos gerais desses experimentos são analisar a homeostase e diferenciação dos adipócitos e investigar os mecanismos de hipóxia e apoptose dos adipócitos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo metabólico, como obesidade e diabetes tipo II. A principal vantagem desta técnica é que eles são procedimentos básicos e baratos é que a análise da biologia dos adipócitos em seu modelo particular de estudos.

Nicole Hannemann, uma estudante de doutorado do meu laboratório, demonstrará os procedimentos. Para quantificar a hipóxia in vivo, primeiro determine o peso corporal do camundongo. Em seguida, injetar 60 mg por kg de peso corporal de pimonidazol hiroccloreto sólido por via intraperitoneal.

Após 45 minutos, prenda os membros do animal e abra a cavidade peritoneal. Colha as almofadas de gordura perigonadal esquerda e direita da cavidade e remova os tecidos gonadais das almofadas. Em seguida, pese o tecido para determinar a relação entre a almofada de gordura e o peso corporal em gramas.

Para realizar a análise histológica da homeostase dos adipócitos, primeiro desparafinizar os cortes de tecido adiposo com três lavagens de cinco minutos em xileno, seguidas de duas reidratações de dois minutos em etanol a 100% e duas reidratações de dois minutos em etanol a 96%. Em seguida, lave as seções em água destilada por cinco minutos e core-as com hematoxilina por 10 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as seções em água por mais cinco minutos, seguido de uma coloração de 30 segundos com solução de eosina.

Lave as seções conforme demonstrado. Em seguida, desidrate as seções em etanol a 96% e etanol a 100% duas vezes cada por dois minutos. Seguido por três incubações de xileno de cinco minutos.

Em seguida, monte as seções com um agente de montagem anidro. Para análise imuno-histoquímica dos tecidos, desparafinizar os cortes como acabamos de demonstrar, seguido de uma digestão de 30 minutos com solução de trabalho de proteinase K a 37 graus Celsius. No final da digestão, enxágue os tecidos em PBS e bloqueie a peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3% em PBS por 10 minutos.

Após duas lavagens subsequentes de cinco minutos em PBS, bloqueie qualquer ligação de anticorpo não específico com 10% de soro em PBS. Em seguida, incube os tecidos e os anticorpos de interesse a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue as seções com três lavagens de cinco minutos em PBS.

Em seguida, incubar os tecidos com os anticorpos secundários biotinilados apropriados por uma hora à temperatura ambiente. Durante os últimos 30 minutos do período de marcação de anticorpos secundários, equilibre 50 microlitros de solução de avidina com 50 microlitros de peroxidase H biotinilada por seção por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as seções duas vezes por cinco minutos cada em PBS e trate os tecidos com 100 microlitros de complexo de avidina biotina ABC à temperatura ambiente.

Após 45 minutos, lavar as secções duas vezes em PBS e incubar os tecidos na solução de substrato de peroxidase até que a coloração atinja o nível de intensidade adequado. Agora lave as seções por cinco minutos com água destilada e contra-core as células com hematoxilina por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a contra-coloração, lave os lenços em água novamente.

Em seguida, desidrate as seções e use um agente de montagem anidro para montar as amostras com lamínulas. As seções podem então ser avaliadas sob um microscópio de campo claro. Comece destacando a pele do camundongo macho adulto da parte superior da perna, lombo e flanco, prendendo a pele à medida que é removida.

Em seguida, colha o tecido adiposo subcutâneo posterior ao redor dos linfonodos inguinais localizados na base das patas traseiras para cultura dos adipócitos. Para analisar a diferenciação adipogênica, coloque a cultura de células adiposas diferenciadas sob uma capela e lave suavemente as células com PBS. Em seguida, fixe as células em dois mL de formalina a 10% por 60 minutos.

Ao final da fixação, lave as células em água e trate a cultura com dois mililitros de isopropanol a 60% por cinco minutos, seguidos de dois mililitros de solução de trabalho de óleo vermelho O. Após cinco minutos, enxágue as células com água da torneira até que a água saia limpa. E contra-core as células com hematoxilina, como acabamos de demonstrar.

As células podem então ser avaliadas sob um microscópio de contraste de fase com uma ampliação de 100 vezes. Os lipídios dos adipócitos aparecerão vermelhos e os núcleos parecerão azuis. Aqui, são mostradas seções da almofada de gordura de camundongos com dieta normal e rica em gordura.

A quantificação do tamanho e da área dos adipócitos demonstra claramente a hipertrofia dos adipócitos após seis semanas de uma dieta rica em gordura, como evidenciado pelo aumento do tamanho dos adipócitos nos animais tratados com dieta rica em gordura. Em camundongos que foram tratados com o marcador hipóxico pimonidazol, o aumento do estado hipóxico do tecido adiposo é acompanhado por um aumento nos adipócitos alfa HIF1 positivos. Além disso, a coloração em túnel de seções adiposas de companheiros de ninhada knock out e controle demonstra que um aumento na apoptose dos adipócitos se correlaciona com a presença de hipóxia e expressão do fator 1 alfa induzível por hipóxia.

Como esperado, a expressão de Hif1a nos adipócitos aumenta após 24 horas de hipóxia. Além disso, a quantificação de genes-alvo Hif por QPCR indica que o aumento da expressão de Hif1a em condições hipóxicas leva a um aumento na expressão de mRNA de Inos. O silenciamento de Hif1 ou 2 alfa por interferência de RNA, no entanto, resgata os adipócitos da apoptose em condições hipóxicas, confirmando o papel regulador sensorial da hipóxia do Hif alfa na apoptose dos adipócitos.

Seguindo esses procedimentos, todos os ensaios, como determinar a resistência à glicose e à insulina, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre alterações metabólicas e disfunção dos adipócitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar análises histológicas de estudos de apoptose e hipóxia de adipócitos.