Name: Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a analisar a homeostase e diferenciação de adipócitos em modelos de obesidade e diabetes tipo II. Este método utiliza técnicas de histologia e imunohistoquímica para investigar apoptose induzida por hipóxia.

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Os autores gostariam de agradecer amavelmente Dr. J. Luther e K. Ubieta para preparar os dados e Dr. B. Grötsch pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).

<ol><li>Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).</li>
<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+function%2C+type+2+diabetes%2C+and+metabolism+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482(2012).</li>
<li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li>
<li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008(2013).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+fat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li>
<li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots%3B+implications+for+pathophysiology+or+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fra-2%2FAP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li>
<li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein%3A+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li>
<li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li>
<li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li>
<li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+%28Cre-ERT2%29+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li>
<li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li>
<li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+%28C57BL%2F6J+versus+FVB%2FN%29+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells%3A+physiological+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li>
<li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747(2013).</li>
<li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li>
<li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li>
<li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF%2FLIF-receptor+signalling+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li>
<li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimonidazole%3A+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li>
<li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li>
<li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li>
<li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+medical+science%22%5BJournal%5D)">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li>
<li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia%3A+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li>
<li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Adipócitos são caracterizados fenotipicamente pelo seu tamanho, números e área, revelando hiperplasia dos adipócitos e hipertrofia, induzida pelo armazenamento excessivo de energia devido ao excesso de nutrição 5. Estes eventos que levam a desregulação de ácidos graxos e subsequentes síndromes metabólicas são também afirma de aumento da massa gorda com metabolismos preservadas, que também é referido como a expansão de gordura &quot;saudável&quot;. Por exemplo, Kusminski et al. 21 mostraram que ratos com expansão de gordura enorme permanecem metabolicamente saudáveis, sugerindo que a expansão de gordura não está necessariamente ligada a síndromes metabólicas e precisa ser cuidadosamente determinados para avaliar as características dos adipócitos. O tecido adiposo (TA) desempenha um papel central na regulação do metabolismo do corpo. AT é o maior órgão endócrino que possa influenciar dislipidemia, aterosclerose, hiperinsulinemia e hiperglicemia 3. Avaliando AT homeostase e da m molecularecanismos regulam que poderia permitir uma melhor compreensão dos distúrbios do sistema metabólico. Portanto, desvendar os mecanismos que regulam a diferenciação dos adipócitos, o tamanho dos adipócitos e massa almofada de gordura iria ajudar a desenvolver novos tratamentos terapêuticos para transtornos de obesidade. Usando in vivo e in vitro, é possível determinar o papel de impactos de alimentos e de expressão de genes em diferenciação de adipocitos e actividade. Para determinar a homeostase AT, determinação do equilíbrio entre a diferenciação de adipócitos, proliferação e apoptose, tal como sugerido pelo nosso protocolo é tão importante como a analisar a glucose e insulina resposta metabólica 22-24. Expression profiling análises de genes envolvidos na adipogénese, a lipogénese, a lipólise, absorção de ácidos gordos, hipoxia, apoptose e a proliferação em adipócitos primários e TA visceral é um método de alto rendimento para a obtenção de uma visão geral sobre a homeostase de adipócitos e a sua possibilidade de disfunção.candidatos interessantes deve ser ainda analisada ao nível proteico por western blot ou coloração imuno-histológica. Para obter os melhores resultados através do sistema de PCR em tempo real com corantes de cianina não simétricos, as concentrações de ADNc que variam de 1 a 10 ng de iniciadores e as concentrações óptimas variando de 50 a 900 nm, deve ser testado para minimizar a amplificação não específica. Os componentes críticos são os iniciadores; para cada ensaio, as curvas de fusão têm de ser rigorosamente controladas para assegurar a especificidade e exclui a formação de dimeros de iniciadores. Portanto, utilizando-se um controlo negativo com H2O em vez de cDNA é recomendado. Além disso, comerciais disponíveis corantes de cianina não simétricas são fornecidos como misturas principais que contêm um corante de referência passiva (tais como ROX) para proporcionar um sinal de referência interno. O sinal de ADNc é normalizada durante a análise de dados para os sinais de ROX para corrigir as flutuações do sinal bem-a-poço. Outro ponto a ser considerado, a fim de estabelecer um good qPCR sistema é a escolha do gene de manutenção. Para cada condição, vários genes de manutenção são utilizados, por exemplo, HPRT, β-actina, GAPDH, β-2-MG ou HSP90. Proteínas HIF estabilizados por meio de condições de hipóxia são master reguladores que determinam não só adipócitos sobrevivência, mas também alterações metabólicas, tais como glucose, tolerância à insulina e do metabolismo lipídico 11,25,26. Para determinar áreas de hipóxia na almofada de gordura, HIF-1α é determinado no AT secções por imuno-histoquímica. Desde proteínas HIF são rapidamente degradados dentro de 5 a 10 minutos, sob condições de normóxia, o processo e a fixação da almofada de gordura para análise histológica deve ser rigorosamente controladas para evitar um tempo de latência. Portanto, para assegurar a hipoxia não só através de coloração de HIF, pimonidazole é utilizado para determinar as áreas hipóxicas em AT. Pimonidazole é capaz de distribuir em tecidos, tal como já foi mostrado na ossos 27, E efectivamente marcar as áreas hipóxicas através da ligação a proteínas contendo tiol especificamente em células hipóxicas, que é ainda detectados em secções histológicas de ligação do anticorpo específico 28. No entanto, outros marcadores e métodos podem ser utilizados para analisar a via de hipóxia. Por exemplo, o envolvimento da enzima prolil hidroxilase (PHD), que induzem a hidroxilação de resíduos de prolina sob normoxia, bem como a proteína de von Hippel-Lindau (VHL), que reconhecem prolinas hidroxilados e induzir o poli-ubiquitinação de mediar proteossómica HIF degradação, precisam ser analisados ​​para obter uma visão completa da via de 29,30. Além disso, a detecção de ubíqua HIFs também iria determinar a estabilidade da proteína e degradação que podem ser alterar 31,32. Além disso, a proliferação de Ki67 e apoptose por coloração TUNEL são determinados in vivo através da coloração de cortes histológicos AT. A quantificação da proliferação de Ki67 e umpoptosis por TUNEL ou V coloração Anexina através de análise de citometria de fluxo é também levada a cabo 33. A proliferação pode, evidentemente, ser medido por outras técnicas, tais como as análises do ciclo celular dos adipócitos, o que não é tratado na medição das células positivas Ki67. Além disso, o estudo apoptose por TUNEL pode ser completado por FACS análise de anexina V e TOP-PR-3, que vai determinar os níveis de necrose versus o processo de morte celular apoptose. A apoptose é um processo fundamental para o programa de morte celular, o que é importante para a AT homeostase. Com efeito, a desregulação da apoptose de adipócitos tem sido implicado anteriormente em processos que contribuem para a obesidade e lipodistrofia 34. Além disso, em 2011, Keuper et ai. Ligada a inflamação do tecido adiposo a apoptose de adipócitos. Eles mostraram que os macrófagos induziu apoptose em pré-adipócitos e adipócitos, que por sua vez atrair macrófagos. O recrutamento de macrófagos acelera a inflamação, que contributes a síndromes metabólicas, tais como glicose e insulina tolerância 35. No entanto, a apoptose de adipócitos ainda é um fenómeno pouco estudada, apesar da hipótese de que a apoptose induzida por adipócitos pode causar a redução de peso. O presente protocolo utiliza abordagens imuno-histoquímica para estudar fenómeno diferente, como a proliferação, apoptose e hipóxia in vivo. Portanto, o tecido foi fixada com formaldeído a 4%, o que é um passo crítico. Um tempo de fixação do tecido prolongado leva à mudança dos epitopos, que se tornam não acessíveis para o anticorpo. Em contraste, um curto tempo de fixação aumenta a sensibilidade dos epítopos para os reagentes. O tempo óptimo é recomendado de fixação 24 h. Além disso, a espessura das secções também influencia os anticorpos que se ligam aos seus epitopos; espessura óptima situa-se entre 2 e 5 um. As secções mais espessas do que 5 um se obter resultados falsos positivos devido a locais de ligação aumentadas. Em contraste, sexões mais fino do que 2 um conter locais de ligação e menos áreas positivas não são bem definidas. Outros factores importantes são o próprio anticorpo, tempo de incubação, concentração e temperatura, mesmo, que influenciam a qualidade da ligação para os epitopos específicos. Portanto, a validação concentração e tempo de incubação de anticorpo é necessário para cada condição. Para concluir o estudo, nós fornecemos uma in vitro adipócitos protocolo de diferenciação, o que poderia ser prorrogado por tratamentos diferentes, a estimulação ou co-culturas. Ao usar em culturas de adipócitos in vitro, é possível determinar defeitos de diferenciação de adipócitos e funções. Para obter resultados confiáveis, como para todas as células primárias, o comportamento saudável e aparência das ADSCs e adipócitos é muito importante. A granularidade, vacuolations e / ou descolamento citoplasmática são sinais de deterioração, indicando meio inadequado, contaminação microbiana ou senescência das primáriascélulas. Este protocolo é utilizando adipócitos isolados a partir do tecido almofada de gordura, que é também possível utilizar células estaminais mesenquimais isoladas da medula óssea, como descrito por outros protocolos 36. A mais recente inclui células progenitoras do estroma, o que pode refletir problemas de diferenciação adicionais que ocorrem na fase muito inicial de diferenciação dos adipócitos, isso pode ser desperdiçada em nosso protocolo atual. Além disso, ADSCs pode ser expandido rapidamente (mais de 10 vezes dentro de uma semana), e ADSCs cultivadas a longo prazo após algumas passagens ainda mantêm a sua pluripotência mesenquimais 37,38. Outra vantagem usando ADSCs é que se pode facilmente mudar para humana, uma vez que ADSCs podem ser colhidas de pacientes por lipoaspiração, que é um método simples e minimamente invasivo. Como AT influencia vários outros órgãos de forma endócrina, o protocolo deve ser alargado a adipocinas. Adipocinas, tais como leptina, adiponectina, factor de necrose tumoral-α (TNF), umaND resistina, segregada por adipócitos são conhecidos por afectar as doenças metabólicas, controlando o metabolismo da gordura, homeostase energética e 39 da sensibilidade à insulina. Por conseguinte, as análises do soro e secretoma adipócito deve ser realizada. No caso da EM, disfunção adipocitoquinas e citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-6, pode levar a distúrbios de órgãos tais como o fígado e o pâncreas, e da função do músculo 4. A fim de excluir a disfunção de órgãos sistémica, modelos animais ou culturas de células podem ser testadas quanto à sua resposta à glicose estimulação e absorção. Aqui nós fornecemos um protocolo para analisar o estado básico da AT e adipócitos in vivo e in vitro para revelar os mecanismos moleculares da homeostase dos adipócitos e funcionalidade.

De acordo com o relatório de 2014 da Organização Mundial da Saúde, 39% da população adulta do mundo está acima do peso, e 13% é obesa 1. Num futuro próximo, as pessoas com excesso de peso será composto por uma proporção significativa da população idosa. Uma característica importante da obesidade e envelhecimento é desregulação de gordura em relação a mortalidade e morbidade 2. Adipocinas, as proteínas segregadas pelo tecido adiposo (TA), pode desencadear síndromes metabólicas, tais como obesidade e diabetes do tipo 2 3. As doenças metabólicas são na sua maioria causadas por acumulação de energia excessiva nas gotículas lipídicas dos adipócitos, o que resulta em pelo expansão 4. É, portanto, de interesse para determinar as causas e os mecanismos moleculares de expansão a fim de encontrar possibilidades para controlá-lo. Over-nutrição leva à expansão AT, que é regulada por dois eventos: o armazenamento excessivo de energia para as gotículas lipídicas de adipócitos, um processolevando a hipertrofia (aumento no tamanho dos adipócitos), e aumentou a adipogénese, também conhecida como hiperplasia 5 adipócito. Adipogênese é um processo de diferenciação de células estaminais multipotentes mesenquimais (MSC) em adipócitos. Em primeiro lugar, MSCs desenvolver em pré-adipócitos durante a fase de compromisso. Em segundo lugar, pré-adipócitos diferenciar ainda mais para adquirir as características de adipócitos maduros e funcionais 6. Vários factores de transcrição foram identificados como reguladores mestre para a determinação de pré-adipócitos, tais como a proteína de dedo de zinco 423 (Zfp423) e factor de células B precoce 1 (Ebf1). Considerando que induz Zfp423 compromisso inicial, Ebf1 é necessário para a geração de células progenitoras de adipócitos 6. Diferenciação terminal é rigorosamente controlada por uma cascata de transcrição, através do qual γ PPAR (PPARy) é o factor de transcrição essencial 7. Outros factores de transcrição chave são o / proteína de ligação potenciador CCAAT (CMembros da família / EBP) (ou seja, C / EBPα, C / EBP, e C / EBPδ), fatores Krüppel-like (KLFs), cAMP elemento de resposta a ligação às proteínas (CREB) e da resposta inicial de crescimento de 20 (Krox20) 6. Recentemente, tem sido demonstrado que a proteína-1 (AP-1) a família activador está envolvido no processo de diferenciação de adipocitos 8,9. A família de AP-1 é formado por um complexo de proteína dimérica, constituída por Fos, Jun e / ou activação de factor de transcrição (ATF) membros. antigénio relacionado com Fos-1 e 2 (Fra-1 e Fra-2) são capazes de regular a diferenciação de adipocitos. Fra-1 prejudica a diferenciação de adipocitos por inibição da C / EBPα 8, enquanto que Fra-2 rotatividade controlos adipócito 9. Fra-2, assim, não só diminui o número de adipócitos reprimindo a expressão PPARγ2 durante a diferenciação dos adipócitos, mas também diminui adipócitos apoptose através da repressão direta dos fatores de hipoxia-induzida expressão (HIFs). A família de HIF é um heterodimeric complexo de factor de transcrição, composto de HIF-1α, HIF-2α e HIF-1β. Os heterodímeros constituídos por uma proteína sensível ao oxigénio HIF-α (HIF-1α ou HIF-2α) e a subunidade HIF-1β oxigénio-10 insensível. Durante a normoxia, proteínas HIF-α são poli-ubiquitinylated e finalmente são degradadas por proteassomas 11. Sob condições hipóxicas, ocorrendo em pelo durante a expansão, proteínas HIF-α não são hidroxilados. Eles, portanto, tornam-se estabilizados e formar dímeros com o HIF-1β constitutivamente expresso. Activação da transcrição de genes controlados por os elementos de resposta do HIF está envolvido na regulação da angiogénese, metabolismo, e inflamação 12. Com efeito, o HIF-1α promove AT disfunção através da indução de tolerância à glicose, inibindo o gasto de energia e da utilização periférica de lípidos, bem como pelo aumento do nível de leptina e HFD-induzida esteatose hepática 13. Além disso, o HIF-1α regula adipocyte a apoptose in vivo e in vitro 9. O presente protocolo descreve métodos para estudar AT status para desvendar as características moleculares da homeostase dos adipócitos em ratos adultos. Ele mostra como a apoptose, proliferação e diferenciação de adipócitos in vivo e in vitro pode ser regulado por hipoxia. Para fazer isso, usamos ratos com adipócitos eliminação específica de Fra-2 gerado pelo cruzamento de ratinhos que transportam as Fra-2 alelos floxed com FABP4-CreERT ratos 9. Ao utilizar ratinhos ERT FABP4-Cre, a supressão é específico de adipocitos e induzível por injecção 14 tamoxifeno. Para o modelo de adulto, as injecções intra-peritoneal de tamoxifeno são realizadas ao longo de 5 dias consecutivos, começando com a idade de 6 semanas. Assim, os ratos são submetidos a uma dieta rica em gordura ou-dieta normal durante 6 semanas antes da análise é feita. Os ratos utilizados neste estudo eram do sexo masculino com base em um fundo C57BL6 para evitar hormonas femininas, tais como estrogénios, Mostrado para regular a distribuição de gordura corporal 15. Usando um outro fundo genético também pode alterar o fenótipo metabólico, devido a diferenças relacionadas com a tensão em gestão lipídico 16. Este protocolo demonstra como analisar AT sob hipóxia usando histologia e como quantificar a apoptose dos adipócitos, proliferação e diferenciação in vivo utilizando imunohistoquímica e gene análises de perfis. O estudo é completado por experiências in vitro, que mostram como a analisar a diferenciação de adipócitos primários e apoptose alterada por exposição a hipoxia.

<table><tbody><tr><td>Solução de RNAlater</td> Solução de <td>estabilização de RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purificado Mouse Anti-Humano Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Clone B56 (RUO)</td></tr><tr><td>Clone B56 de Rato Purificado Anti-Humano Ki-67 (RUO)</td><td>550609</td><td>Marcador</td><td></td>de proliferação</tr><tr><td>FITC Anexina V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3 clivada Sinalização</td><td>celular</td> de mAb de coelho <td>9664S</td><td>Clone 5A1E</td></tr><tr><td>Caspase-3 clivada (Asp175) (5A1E) Marcador de mAb de coelho</td><td>9664</td> Marcador <td></td>de <td>apoptose</td></tr><tr><td>Lipofectamine2000 Reagente&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodeto</td><td>T3605</td><td>Contracoloração nuclear, coloração de ácido nucleico de cianina monomérica, Excitação&frasl; Emissão: 642&frasl; 661 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s hemalum</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>hematoxilina</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, solução monofásica de isotiocianato de guanidina e fenol</td></tr><tr><td>Kit Cerâmico Percellys 1.4&nbsp; mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>tubos contendo grânulos cerâmicos (1,4 mm)</td><td></td></tr> <tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>homogeneizador</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alfa</td><td>Anticorpo Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Anticorpo, 16H4L13</td><td>700505</td><td>Marcador</td><td></td> de hipóxia</tr><tr><td>In Situ Kit de detecção de morte celular, Fluoresceína</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>Marcação de extremidade de nick (TUNEL) de dUTP-biotina mediada por TdT&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução Eosin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1&nbsp; unidade/&micro; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado anti-mouse IgG (H + L)</td> <td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado anti-mouse IgG (H + L)</td> <td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Meio de montagem com DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mecanismo do regulamento de números de adipócitos em adultos organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considerando que o tecido adiposo (TA) é um órgão endócrino, ele pode influenciar o metabolismo de todo o corpo. O armazenamento excessivo de energia leva à desregulação dos adipócitos, que por sua vez induz a secreção anormal de adipocinas, desencadeando síndromes metabólicas como obesidade, dislipidemia, hiperglicemia, hiperinsulinemia, resistência à insulina e diabetes tipo 2. Portanto, investigar os mecanismos moleculares por trás da desregulação dos adipócitos pode ajudar a desenvolver novas estratégias terapêuticas. Nosso protocolo descreve métodos para avaliar o mecanismo molecular afetado por condições hipóxicas do TA, que se correlaciona com a apoptose de adipócitos em camundongos adultos. Este protocolo descreve como analisar o TA in vivo por meio do perfil de expressão gênica, bem como da análise histológica da diferenciação, proliferação e apoptose de adipócitos durante a exposição à hipóxia, verificada por meio da coloração de células hipóxicas ou proteína HIF-1α. Além disso, a análise in vitro da diferenciação de adipócitos e suas respostas a vários estímulos completa a caracterização das vias moleculares por trás de uma possível disfunção dos adipócitos que leva a síndromes metabólicas.

Mostramos como determinar adipócito homeostase in vivo e in vitro, usando o exemplo de Fra-2 fl / FL ratinhos FABP4-CreERT comparados com crias da mesma ninhada de tipo selvagem. Nosso protocolo define como o aumento da expressão de HIF por hipoxia está correlacionada com a disfunção do adipócito, tal como indicado pelo aumento da apoptose de adipócitos. camundongos aumento do tamanho dos adipócitos e área em dieta rica em gordura (DFH) tratados Sobre-nutrição, entre outros factores, resulta em hipertrofia de adipócitos, devido a um armazenamento de energia excessiva nas gotículas lipídicas. O tamanho dos adipócitos e a área é um indicador de hipertrofia. Seções da almofada de gordura do normal (ND; Figura 6A) e dieta rica em gordura (HFD; Figura 6b) ratos, bem como quantificações do tamanho dos adipócitos e na área mostram claramente a hipertrofia dos adipócitos após seis semanass de DH, o que é indicado pelo aumento do tamanho dos adipócitos nos ratinhos tratados HFD (Figura 6C e D). O aumento da hipoxia no tecido adiposo (TA) de adulto Fra-2 fl / FL-FABP4 CreERT ratinhos leva a um aumento do nível de HIF-1α e apoptose de adipócitos Para determinar o estado in vivo de hipoxia em AT, A partir de 2-fl / FL ratinhos FABP4-CreERT são analisados ​​6 semanas após Fra-2 deleção com a idade de 12 semanas e comparados com crias da mesma ninhada de tipo selvagem. Pimonidazole é administrada aos ratos por via intraperitoneal como um marcador eficaz hipoxia; que é não tóxico e capaz de distribuir em AT. Adipócitos hipóxicos no AT in vivo são definidos pela coloração de anticorpos imuno-histoquímica (Figura 7a). Além disso, o aumento do estado hipóxico do AT em ratinhos é acompanhada por um aumento positivo ADIP HIF-1αocytes como indicado pela coloração imuno-histoquímica Figura 7b), o que é confirmado pela quantificação dos níveis de expressão de HIF-1α e seus Objectivos genes 9. Além disso, a coloração TUNEL de seções a de Fra-2 fl / fl ratos FABP4-CreERT e littermates controle (Figura 7C) mostra que o aumento da apoptose dos adipócitos está correlacionada com a presença de hipóxia e de expressão HIF-1α. A expressão aumentada de HIF-1α em adipócitos primários através de hipoxia induzida apoptose de adipócitos Para a análise dos adipócitos apoptose in vitro, usamos adipócitos gerados a partir de almofadas de gordura subcutânea conforme já descrito 20. Como esperado, a expressão de HIF-1α nos adipócitos é aumentada após 24 horas de hipoxia (Figura 8a). Para analisar melhor as atividades de HIF-1α, os níveis de ARN de alvo HIFgenes tais como Inos (indutível da sintase do óxido nítrico) são quantificados por qPCR. A Figura 8B mostra que a expressão aumentada de HIF-1α sob condições hipóxicas leva ao aumento do nível de ARNm Inos. Uma vez que já foi demonstrado in vivo (Figura 8) que a expressão aumentada de HIF-1α em adipócitos se correlaciona com um aumento da apoptose de adipócitos, a apoptose também é quantificada em culturas in vitro por coloração com anexina V sob condições hipóxicas. Consistente com os dados in vivo (Figura 7), um aumento do nível de HIF-1α é acompanhada por um aumento da apoptose de adipócitos induzida por condições hipóxicas (Figura 8b). Além disso, para provar que a apoptose induzida por hipoxia HIF-é dependente; HIF-1α ou HIF-2α é silenciada pela interferência de RNA em adipócitos derivados de tipo selvagem ou Fra-2 camundongos deficientes. O aumento da apoptose de adipócitos é restaurada por silenciamento de HIF-1α ou HIF-2α como mostrado por Anexina<html> Coloração V na Figura 8b, provando que o sensor de hipoxia HIF-α regula a apoptose de adipócitos. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> Figura 6: Aumento do tamanho dos adipócitos e área na dieta rica em gorduras os ratos (HFD) (a, b) H &amp; E coloração de secções de almofada de gordura perigonadal de ratinhos de tipo selvagem machos alimentados com dieta normal (ND) (a) ou alta. dieta -fat (HFD) (b) durante 6 semanas. As barras representam a 500 um. (C, d) quantificações de tamanho dos adipócitos (C) e na área (d) a partir da almofada de gordura perigonadal de ratinhos de tipo selvagem, alimentados com ND (a) ou DH (b) durante 6 semanas. n = 10. Os dados são apresentados como valores médios ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando Student t -test. *** P &lt;0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> Figura 7: Aumento do nível HIF-1α e apoptose em adipócitos de adulto FRA-2 fl / fl ratos FABP4-CreERT. A hipoxia (a), e HIF-1α (b) coloração em AT de Fra-2 fl / FL ratinhos FABP4-creERT e crias da mesma ninhada de controlo machos de 6 semanas após a injecção tamoxifeno macho. Ampliação 20X, insira 40X. Setas pretas indicam áreas de hipóxia e células positivas HIF-1α. (C) coloração TUNEL em Fra-2 fl / fl ratos FABP4-CreERT e littermates controle em 6 semanas após a injeção de tamoxifeno. Ampliação 20X, insira 40X. Setas pretas indicam células positivas TUNEL. Este valor foi modificado a partir de Luther etal. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> Figura 8:. Expressão HIF-1α Aumento e adipócitos apoptose em adipócitos primários induzidos por hipoxia (a), em tempo real A análise de PCR dos níveis de mRNA Inos alvo HIFs HIF-1α e em adipócitos primários colocados em câmaras hipóxicas analisados ​​nos pontos de tempo indicados. (B) Quantificação da apoptose por coloração anexina V FACS em adipócitos primários isolados de Fra-2 fl / fl ratos FABP4-CreERT ou controles do tipo selvagem transfectadas com controle sh ou plasmídeo sh contra HIF-1α ou HIF-2α e colocados sob hipóxia (1% de O2) durante 24 h. Este valor foi modificado a partir de Luther et al. <sup&gt; 9. Os dados são apresentados como valores médios ± análise estatística SD foi utilizado o teste t de Student. * P &lt;0,05 e ** P &lt;0,01 foram aceitos como significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O tecido adiposo (TA) pode influenciar a homeostase de todo o corpo, portanto, entender os mecanismos moleculares de diferenciação e função dos adipócitos é importante. Fornecemos um protocolo para obter novos insights sobre esses processos, analisando a homeostase, diferenciação e exposição à hipóxia dos adipócitos como um modelo para a apoptose induzida de adipócitos.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Os objetivos gerais desses experimentos são analisar a homeostase e a diferenciação de adipócitos e investigar os mecanismos da hipóxia e da apoptose de adipócitos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do metabolismo, como obesidade e diabetes tipo II. A principal vantagem dessa técnica é que se trata de procedimentos básicos e de baixo custo, que permitem a análise da biologia do adipócito no modelo específico de estudo.Nicole Hannemann, uma estudante de doutorado do meu laboratório, demonstrará os procedimentos. Para quantificar a hipóxia in vivo, primeiramente determine o peso corporal do camundongo. Em seguida, injete 60 mg por kg de peso corporal de pimonidazol hidrocloridrato sólido por via intraperitoneal.Após 45 minutos, prenda as patas do animal e abra a cavidade peritoneal. Colete os tecidos adiposos perigonadais esquerdo e direito da cavidade e remova os tecidos gonadais dos fragmentos adiposos. Em seguida, pese o tecido para determinar a razão entre o fragmento adiposo e o peso corporal em gramas.Para realizar a análise histológica da homeostase de adipócitos, desparafine primeiro as seções de tecido adiposo com três lavagens de cinco minutos em xilol, seguidas por duas reidratações de dois minutos em etanol 100% e duas reidratações de dois minutos em etanol 96%. Em seguida, lave as seções em água destilada por cinco minutos e cora-as com hematoxilina por 10 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, lave novamente as seções em água por mais cinco minutos, seguido por uma coloração de 30 segundos com solução de eosina.Lave as seções conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, desidrate as seções em etanol 96% e etanol 100%, duas vezes cada, por dois minutos. Siga com três incubações de cinco minutos em xilol.Em seguida, monte as seções com um agente de montagem anidro. Para análise imunohistoquímica dos tecidos, desparafine as seções conforme acabou de ser demonstrado, seguido por uma digestão de 30 minutos com solução de trabalho de proteinase K a 37 graus Celsius. Ao final da digestão, lave os tecidos em PBS e bloquee a peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3% em PBS por 10 minutos.Após duas lavagens subsequentes de cinco minutos em PBS, bloquee a ligação não específica de anticorpos com soro a 10% em PBS. Em seguida, incube os tecidos e os anticorpos de interesse a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue as seções com três lavagens de cinco minutos em PBS.Em seguida, incubar os tecidos com os anticorpos secundários biotinilados apropriados por uma hora à temperatura ambiente. Durante os últimos 30 minutos do período de marcação com o anticorpo secundário, equilibrar 50 microlitros de solução de avidina com 50 microlitros de peroxidase H biotinilada por seção durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as seções duas vezes por cinco minutos cada em PBS e tratar os tecidos com 100 microlitros do complexo ABC de avidina-biotina à temperatura ambiente.Após 45 minutos, lave as seções duas vezes em PBS e incube os tecidos na solução substrato de peroxidase até que a coloração atinja o nível apropriado de intensidade. Agora, lave as seções por cinco minutos com água destilada e contra-colora as células com hematoxilina por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a contra-coloração, lave novamente os tecidos em água.Em seguida, desidrate os cortes e utilize um meio de montagem anidro para montar as amostras com lamínulas. Os cortes podem então ser avaliados em microscópio de campo claro. Comece por destacar a pele do camundongo macho adulto da coxa superior, lombo e flanco, fixando a pele conforme for removida.Em seguida, colete o tecido adiposo subcutâneo posterior ao redor dos linfonodos inguinais localizados na base das patas traseiras para o cultivo dos adipócitos. Para analisar a diferenciação adipogênica, coloque o cultivo de células adiposas diferenciadas sob uma cabine de segurança e lave suavemente as células com PBS. Em seguida, fixe as células em dois mL de formalina 10% por 60 minutos.No final da fixação, lave as células em água e trate o cultivo com dois mililitros de isopropanol a 60% durante cinco minutos, seguido por dois mililitros da solução de trabalho de vermelho de óleo O. Após cinco minutos, enxágue as células com água da torneira até que a água saia límpida. E contra-estaine as células com hematoxilina conforme acabou de ser demonstrado.As células podem então ser avaliadas em um microscópio de contraste de fase com uma ampliação de 100 vezes. Os lipídios dos adipócitos aparecerão vermelhos e os núcleos aparecerão azuis. Aqui são mostradas seções do coxim adiposo de camundongos com dieta normal e dieta rica em gordura.A quantificação do tamanho e da área dos adipócitos demonstra claramente a hipertrofia adipocitária após seis semanas de dieta rica em gordura, evidenciada pelo aumento do tamanho dos adipócitos nos animais tratados com dieta rica em gordura. Em camundongos tratados com o marcador de hipóxia pimonidazol, o aumento do estado hipóxico do tecido adiposo é acompanhado por um aumento nos adipócitos positivos para HIF1 alfa. Além disso, a coloração TUNEL em seções de tecido adiposo de animais knock out e controles da mesma ninhada demonstra que o aumento na apoptose adipocitária correlaciona-se com a presença de hipóxia e expressão do fator indutível por hipóxia 1 alfa.Como esperado, a expressão de Hif1a em adipócitos aumenta após 24 horas de hipóxia. Além disso, a quantificação de genes-alvo de Hif por QPCR indica que o aumento da expressão de Hif1a em condições hipóxicas leva a um aumento na expressão de mRNA de Inos. O silenciamento de Hif1a ou 2a por interferência de RNA, no entanto, resgata os adipócitos da apoptose em condições hipóxicas, confirmando o papel regulador sensorial de hipóxia de Hif alfa na apoptose de adipócitos.Após seguir estes procedimentos, todos os ensaios, como a determinação de glicose e resistência à insulina, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre alterações metabólicas e disfunção de adipócitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar análises histológicas de estudos de apoptose e hipóxia em adipócitos.

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

A cultura agregada madura de membrana (MAAC) é um novo método para cultivar adipócitos humanos maduros. Aqui detalhamos como isolar adipócitos do adipose humano e como configurar o MAAC.

Isolamento e Cultura de Adipócitos Maduros Humanos Usando culturas agregadas de adipócitomaduros de membrana (MAAC)

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra.  Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

Aprenda a analisar a homeostase e diferenciação de adipócitos em modelos de obesidade e diabetes tipo II. Este método utiliza técnicas de histologia e imunohistoquímica para investigar apoptose induzida por hipóxia.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

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