Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas In Vitro

O objetivo geral deste experimento é mimetizar a transfusão de plaquetas in vitro e testá-la usando hemostasia em colágeno, com fluxo hidrodinâmico e microscopia em tempo real. Pacientes com trombocitopenia são tratados com concentrados de plaquetas armazenados. Nosso método destina-se a ajudar a responder questões-chave no campo da trombose e hemostasia, com ênfase específica na qualidade e função desses concentrados de plaquetas armazenados.

O valor agregado dessa técnica é que ela imita o fluxo sanguíneo e, portanto, leva em consideração as influências reológicas nas células e biomoléculas participantes. O método atual avalia a ligação plaquetária ao colágeno. Pode, no entanto, também ser aplicado a outros tecidos adesivos, incluindo placa aterosclerótica, células endoteliais ou proteínas específicas da matriz, como o fator de Von Willebrand e o fibrinogênio.

Comece preparando o biochip. Vortex e dilua um estoque de colágeno de um a 20 na solução isotônica de glicose do fabricante até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Em seguida, pipete 0,8 microlitros nas pistas de um novo biochip descartável.

Preencha todas as pistas em uma extremidade do chip e marque-a como a extremidade de saída. Em seguida, inspecione o chip para certificar-se de que cada pista esteja preenchida 5/6 do caminho com a solução e sem bolhas de ar. Em seguida, incube o chip a quatro graus Celsius por quatro horas ou durante a noite em um recipiente umidificado e fechado.

Mais tarde, bloqueie os canais codificados pipetando o buffer de bloqueio na outra extremidade das pistas. Em seguida, para cada pista, corte comprimentos de tubos de 12 centímetros e prenda um pino em cada comprimento de tubo para torná-los fixos ao biochip. Enxágue os comprimentos dos tubos com água destilada de uma seringa e um conector.

Em seguida, sature-os com tampão de bloqueio e feche-os em um recipiente umidificado por pelo menos uma hora. Em seguida, prepare a bomba e o coletor. Primeiro, enxágue a bomba e o coletor com água destilada para remover quaisquer bolhas de ar.

Em seguida, anexe o biochip ao estágio do microscópio automatizado. Coloque uma extremidade dos comprimentos em um tubo de 1,5 mililitro cheio de HBS e, em seguida, prenda-os com a outra extremidade às entradas do biochip. Coloque os pinos do coletor nas saídas do biochip.

Em seguida, enxágue o sistema com HBS usando a bomba. Qualquer tampão bloqueador remanescente ou colágeno mal aderido será removido. Isso completa os preparativos da câmara de fluxo.

Comece reunindo coletas de sangue recentes de voluntários saudáveis em um tubo de centrífuga cônico. Gire a amostra por cerca de 15 minutos a 250 Gs.Do não use o freio, pois isso perturbará a fase inferior frouxamente compactada. Remova e descarte o plasma rico em plaquetas e o revestimento leucocitário.

Guarde o concentrado de glóbulos vermelhos contendo o menor número possível de plaquetas, para fazer o sangue reconstituído. Agora, comece a descongelar quatro mililitros de plasma tipo AB a 37 graus Celsius por cinco minutos e 20 segundos. Enquanto isso, determine o hematócrito do concentrado de glóbulos vermelhos preparados usando um analisador hematológico automatizado.

Em seguida, determine a concentração de plaquetas de um concentrado de plaquetas preparado para banco de sangue para usar na reconstituição do sangue total. Calcule os volumes necessários para um mililitro de sangue reconstituído com 40% de hematócrito e 250.000 plaquetas por microlitro. Agora, usando uma ponta de pipeta cortada, transfira o volume necessário de glóbulos vermelhos, plasma e concentrado de plaquetas para a concentração desejada e um volume final de um mililitro.

Misture o sangue reconstituído com inversões suaves e faça um hemograma completo. Em seguida, pegue um tubo de microcentrífuga preparado contendo Calceína AM e adicione um mililitro de sangue reconstituído a ele. Misture o sangue com corante usando inversões suaves.

Em seguida, incube o sangue reconstituído por cinco minutos a 37 graus Celsius. No software, selecione a região de interesse na pista de perfusão. Concentre-se nas fibras de colágeno aderidas na parte inferior das faixas com ampliação de 100x.

O ideal é usar contraste de fase ou contraste de interferência diferencial. Escolha a opção Definir Z atual para regiões de ladrilhos selecionadas para corrigir digitalmente as posições Z selecionadas. O foco óptico antes da perfusão deve estar no colágeno de amelobilasto, mas isso pode ser complicado.

Uma alternativa é definir o foco do microscópio nas plaquetas aderentes iniciais. Agora, misture delicadamente as amostras e posicione-as ao lado do biochip. Em seguida, coloque o tubo conectado à faixa observada no sangue reconstituído.

Em seguida, usando o software que controla a bomba, aplique uma pressão de 50 dinas por centímetro quadrado para mover a amostra de sangue para a pista e iniciar o experimento. Durante o experimento, grave imagens a cada 15 segundos por cinco minutos. Determine a cinética de crescimento do trombo usando um software de análise de imagem.

Nesse caso, o Zen 2012 é utilizado. Comece abrindo a análise de imagem do plug-in para determinar a cobertura da superfície das plaquetas. Defina o limite de fluorescência na guia interativa de análise para definir a intensidade do pixel que se correlaciona com um sinal positivo, que viria de plaquetas aderentes.

Em seguida, use criar tabelas para gerar automaticamente uma planilha com uma lista das áreas de superfície dos sinais positivos para cada ponto de tempo. Salve essas planilhas no formato XML e abra-as em um programa de planilhas para cálculos adicionais. Em cada ponto de tempo, calcule as áreas totais da superfície dos objetos selecionados e expresse esse valor como a porcentagem da superfície que é coberta.

Em seguida, plotar os dados em função do tempo de perfusão e calcular a inclinação por regressão linear. Isso modela a cinética de crescimento do trombo dessa condição experimental específica. Três amostras idênticas de sangue total reconstituído foram perfundidas simultaneamente sobre superfícies revestidas de colágeno.

Isso resultou em um coeficiente de variação de 8,7%, sugerindo variação intra-ensaio e intralaboratorial aceitável para comparação do teste. A transfusão foi simulada pela reconstituição do sangue com o componente deficiente. Várias reconstituições foram realizadas com concentrações plaquetárias decrescentes.

Como esperado, contagens de plaquetas mais baixas resultaram em menor adesão em função do tempo de perfusão. Em seguida, foi investigado o efeito da diminuição da temperatura após a coleta de sangue e durante a perfusão. Descobriu-se que os trombos se acumulavam mais lentamente quando o sangue era resfriado à temperatura ambiente.

Em comparação com uma amostra mantida a 37 graus Celsius durante todo o estudo. Durante a circulação, as plaquetas se ligam aos locais de lesão dos vasos em condições de estresse absoluto da parede elevada. Como esperado, a variação da taxa absoluta nas câmaras de fluxo microfluídico alterou a adesão plaquetária total.

Essas condições também alteram a cinética de crescimento do trombo. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de câmara de fluxo microfluídico usando sangue reconstituído para testar a qualidade e a função dos concentrados de plaquetas armazenados. Essa técnica pode ser feita em cerca de sete horas.

Experimentos com câmara de fluxo microfluídico abriram caminho para pesquisadores no campo da transfusão de plaquetas explorarem o impacto das variáveis de doação, preparação e armazenamento. Um exemplo relevante é a inativação de patógenos. Demos o exemplo de apenas um sujeito experimental.

No entanto, variações na concentração de cálcio, tensão pura e revestimentos de superfície podem ser usados para abordar diferentes questões de pesquisa. Semelhante a este procedimento, outras medições em câmaras de fluxo microfluídico podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, o desempenho das plaquetas armazenadas para coagulação no fluxo.