Name: Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a usar câmaras de fluxo microfluídico com sangue reconstituído para modelar hemostase e avaliar a função de plaquetas armazenadas em colágeno. Este método permite estudar a qualidade de concentrados plaquetários para transfusão.

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Os autores não têm agradecimentos.

Este protocolo segue as diretrizes éticas institucionais para a pesquisa em amostras humanas e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores envolvidos. Aprovação para as experiências descritas aqui foi obtido do conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Antuérpia. Nota: as indicações de temperatura são sempre temperatura ambiente, a menos que especificado. Configuração 1. Preparação Fluxo Câmara <ol><li> Lanes preparando, Tubing and Pins <ol><li> Vortex a suspensão de colagénio vigorosamente e diluir 20/01 na solução de glucose isotónica fornecido pelo fornecedor para uma concentração final de 50 ug / ml. Nota: Nós usamos colágeno de tendão equino, composta principalmente de tipo fibrilas I. O tipo I de colagénio equino é muitas vezes referida como &quot;Horm&quot; colagénio e é o padrão de ouro para este tipo de ensaio 9, tanto por razões históricas, bem como biológicos. Tipo de colagénio III humano também pode ser utilizado, mas the fibrilas revestimento e menos bem a resposta de plaquetas não é tão forte. Outras superfícies de revestimento também pode ser utilizado, por exemplo Factor de von Willebrand (vWF), fibrinogénio, fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 ou combinações destes 16. </li><li> Tome um novo biochip descartável de recipiente do provedor. As dimensões dos biochips utilizados aqui são 0.4W x 0,1H x 20L em mm 3. </li><li> Pipeta de 0,8 ul para a pista (s) do biochip microfluídico em uma extremidade do chip e marcar como saída. Certifique-se que a pista está cheia 5 / 6º com o colágeno contendo solução de revestimento preparada no ponto 1.1.1. Certifique-se de que não existem bolhas de ar. NOTA: Os canais são parcialmente revestido para evitar a acumulação de fibras de colagénio na entrada do canal (ver discussão). </li><li> Incubar a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite num recipiente fechado e humidificada. </li><li> Bloquear os canais revestidos por pipetagem de tampão de bloqueio (1,0% (w v) de soro / albumina bovina umd 0,1% (w / v) de glucose em 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) solução salina tamponada (HBS; 0,9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) na outra extremidade e Mark como entrada. Certifique-se de que a faixa está completamente cheia com o tampão de bloqueio evitando bolhas de ar. </li><li> Cortar tubos em igual comprimento (12 cm). Use um por pista e se conectar cada tubo com um alfinete. Por exemplo, um experimento comparando duas condições, realizados em duplicado exigirá quatro trechos de tubulação e quatro pinos para ser preparado. </li><li> Lavar a tubagem com água destilada, utilizando uma seringa e uma agulha G 26 ou os conectores de acompanhamento. </li><li> Saturar o tubo com tampão de bloqueio. Armazenar em um recipiente fechado e humidif içado, durante um mínimo de 1 hora. </li></ol></li><li> Preparando Bomba e Manifold <ol><li> Lavar a bomba e manifold com água destilada, remover bolhas de ar. </li><li> Aspirar o tampão de bloqueio para fora da pista (s) biochip usando a ponta 10 ul fixo na saída. Limpe a superfície doo biochip com um pó de precisão livre limpeza e álcool desnaturado para remover impressões e poeira. </li><li> Fixar o biochip em um estágio do microscópio automatizado. Se mais de uma faixa é usada simultaneamente em uma corrida, conectar o divisor colector de oito pistas para a saída biochip. Nota: O divisor colector de oito pistas é uma peça de hardware (Figura S1) ligado à bomba e ao biochip. Ele permite a operação de todas as pistas (oito) disponíveis no biochip um ou uma combinação de pistas que podem ser no software que acompanha definidos pelo operador. </li><li> Use os pinos na tubulação para corrigi-los na entrada biochip. Colocar a outra extremidade da tubagem (sem pinos) num tubo de ensaio cónico de 1,5 ml cheio com HBS. Lavar todos os tubos e as suas faixas ligadas com 1 ml de HBS de usar a bomba, de modo a remover o restante tampão de bloqueio e fracamente aderente colagénio. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de amostras de sangue <ol><li> Coleta e separação desangue total fresco de um voluntário saudável. 17 <ol><li> Recolher os primeiros mililitros de sangue em tubos evacuados contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante e exclusivamente utilizar esta amostra para contagem de sangue completo (CBC) com um analisador hematológico automático. </li><li> Recolher um volume de sangue de um anticoagulante adequado, utilizando tubos de vácuo. anticoagulantes padrão para experimentos câmara de fluxo são heparina ou hirudina quando fibrina formação não faz parte do protocolo de estudo e citrato de sódio quando é. Nota: a heparina foi utilizada como anticoagulante para todas as experiências descritas nos resultados. Nota: A quantidade de sangue depende do número de experiências para ser executado. Cerca de um tubo (7 ml) por 3 vias. </li><li> Colocar os tubos num rotor pendente reconstituição sangue. Nota: O ensaio deve ser concluído no prazo de 3 horas de flebotomia. </li><li> Centrifuga-se durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico em plaquetas (PRP). Não use a pausa centrífuga para não perturbar o pellet ligeiramente comprimido. <ol><li> Quando mais do que um tubo foi recolhida, reunir o sangue num tubo de centrifugação cónico. Nota: A centrifugação pode ser feito mais lentamente ou menos longo, dependendo do rendimento de PRP e &quot;contaminação&quot; diferencial de células preferidos. </li></ol></li><li> Retirar e descartar o PRP e creme leucocitário produzindo concentrado de hemácias com poucas plaquetas. Nota: A contagem das plaquetas na fracção de glóbulos vermelhos embalados é de 13 ± 5 x 10 3 por ul (média ± DP, n = 12) em média nas nossas mãos. </li></ol></li><li> Reconstituição de sangue <ol><li> Descongelar grupo sanguíneo AB (Rhesus D negativo) o plasma a 37 ° C durante 5 min e 20 seg por 4 ml. </li><li> Determinar o hematócrito dos glóbulos vermelhos empacotados em 2.1.5 preparados usando um analisador hematológico automático. </li><li> Determinar a concentração de plaquetas no banco de sangue preparadas plaquetas concentrado thaT vai ser utilizado para reconstituir a fracção de glóbulos vermelhos acima. </li><li> Calcule o volume de concentrado de hemácias e concentrado de plaquetas que irão produzir 40% de hematócrito e 250 x 10³ plaquetas / ul em uma amostra de 1 ml. Nota: Outros títulos de células alvo pode ser definido arbitrariamente, dependendo do protocolo do estudo. </li><li> Transferência embalado células vermelhas do sangue e de plasma para um tubo fresco, utilizando uma ponta de pipeta cortada e adicionar concentrado de plaquetas até um volume de amostra de 1 ml é atingida. Nota: Dependendo das variáveis ​​estudadas, a fração de plasma deve ser igual em todas as amostras reconstituídas porque plasma tem uma influência significativa sobre a taxa de formação de trombos. Por exemplo, repetido de congelação-descongelação ou plasma retirado de doadores diferentes ou em diferentes anticoagulantes podem influenciar o resultado. </li><li> Misture o sangue reconstituído suavemente por inversão e realizar um CBC. </li><li> Prepara-se uma amostra de controlo &quot;em branco&quot;, na qual o volume da fracção de plaquetas é substituídopelo mesmo volume de 0,9% (m / v) de cloreto de sódio em água para determinar a concentração de plaquetas endógenas (isto é, não-bancárias de sangue plaquetas) no sangue reconstituído usando um CBC. </li></ol></li><li> Marcação <ol><li> Pipeta de 1 ml reconstituído sangue num tubo de ensaio contendo 1 ul de 5 mM de calceína AM (5 uM de concentração final). Nota: Outros corantes celulares podem ser usados ​​14. </li><li> Misture delicadamente por inversão. </li><li> Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de usar. </li></ol></li></ol> 3. Perfusão Assay <ol><li> Concentre o objectivo de as fibras de colagénio aderiram ao fundo das pistas. O ideal é usar as configurações de contraste de interferência diferencial (DIC) de contraste de fase ou para esta estratégia de focalização. Selecione &#39;Z atual definido para as regiões telha selecionados&#39; no software experimento para corrigir digitalmente os Z-posições selecionadas. </li><li> Seleccionar uma região de interesse (ROI) na pista (XY) no software do experimento microscope que será gravado durante o experimento. Nota: O ROI pode ser de qualquer área de superfície escolhido arbitrariamente dentro de uma pista de perfusão. É aconselhável não para analisar a formação de trombos perto da entrada e saída de uma pista de modo a evitar efeitos laterais do perfil de fluxo variável nessa região, mesmo que esta seja relativamente pequena. A área de superfície ROI deve conter um número significativo de plaquetas ou de trombos para permitir o nivelamento do sinal. Neste protocolo do ROI é um agregado digitalmente costurado de três tamanhos iguais imagens lado-a-lado, resultando em 0,62 milímetros 2 no meio da pista de 2 cm de comprimento. </li><li> Misturar suavemente as amostras por inversão e posicionar estes junto ao biochip na fase automatizado. </li><li> Colocar o tubo que está ligado com a entrada do biochip nos tubos de ensaio contendo as amostras de sangue reconstituído. </li><li> Lançar a bomba a 50 dyne / cm 2 (ou outras tensões de cisalhamento como desejado) para esses canais ligados a tubos de ensaiocontendo as amostras de sangue reconstituídos utilizando o software da bomba. Nota: Outros tensões de corte pode ser utilizado. </li><li> gravar imagens a cada 15 segundos durante 5 minutos em tempo real usando o software de aquisição e experiência do microscópio. Nota: Outra série temporal pode ser utilizado, dependendo do set-up experimental. Nota: Em geral, utilizar uma ampliação de 100X (objectiva 10X e 10X lentes), mas superior (ou inferior) de ampliação pode ser facilmente utilizado como uma alternativa. </li></ol> 4. Lave Fora <ol><li> Lavar todos os tubos ligados à tomada e ligado ao colector ou multicanal bomba usando água destilada, seguido de hipoclorito de sódio (lixívia) 0,5% (v / v) e, finalmente, NaOH a 0,1 M em água. Descartar o tubo preso à entrada biochip como resíduos perigosos. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Determinar a cinética de crescimento do trombo com o software de análise de imagem. Os comandos a seguir são específicos para ZEN2012. <ol&gt; <li> Abra a Análise plugin de imagem para determinar a cobertura da superfície das plaquetas. </li><li> Defina o limite de fluorescência na guia Analisar interactivo para definir a intensidade dos pixels que se correlaciona com um sinal positivo, ou seja, uma das plaquetas aderiram ou plaquetas aderentes. </li><li> Use Criar tabelas para gerar automaticamente uma planilha que conterá as áreas de superfície separadas (em mm 2) desses &quot;objetos&quot; que contêm pixels com um sinal entre os limiares selecionados. Isto é realizado para cada ponto de tempo. Nota: Uma vez que os limiares de fluorescência ter sido escolhido, o software de análise detecta automaticamente &#39;objetos&#39; no campo de visão que preenchem os critérios. Esses objetos são trombos, pequenos agregados de plaquetas ou plaquetas individuais e abranger uma série de pixels. Cada objeto é listado na planilha separadamente. </li><li> Guarde estas planilhas no formato XML e abri-los em um programa de planilhapara outros cálculos. </li><li> Total de áreas da superfície dos objectos seleccionados por soma e dividir o resultado pela área total do campo de medição (uM 2). Isto vai produzir a cobertura de superfície relativa (%). Fazê-lo para cada ponto de tempo. </li><li> Traçar estas coberturas de superfície em função do tempo de perfusão e calcular a inclinação por regressão linear, obtendo-se a cinética de crescimento de trombos que condição particular. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Experimentos câmara de fluxo microfluidicos são uma excelente ferramenta para investigar a função das plaquetas no fluxo sanguíneo e são usados ​​para avaliar a hemostasia in vitro em vários contextos experimentais. Apesar de pobre normalização interlaboratory 9, demonstra-se que dentro do nosso laboratório a variação experimental é aceitável. Isto permite comparar de forma confiável amostras (pareados) dentro de um determinado estudo. Este foi validado utilizando o fenômeno bem documentado de lesão ...

Hemostasia requer a atividade combinada e regulado de células, proteínas, íons e tecidos em um contexto espaço-temporal restrito 1. actividade não controlada pode conduzir a hemorragia ou trombose e morbidade ou mortalidade num espectro de distúrbios relacionados com a coagulação do sangue. Um experimento de câmara de fluxo microfluídico é uma técnica desafiadora que imita hemostasia in vitro. Esta abordagem permite a investigação da interação complexa de processos que fazem parte de hemostasia com um papel de liderança para as plaquetas do sangue. A seguir a lesão vascular, as plaquetas aderem às proteínas de matriz subendotelial exposta (glico) para evitar a perda de sangue. Após a adesão, activação e agregação de plaquetas em resposta a auto- e paracrino sinalização que, finalmente, conduz à formação de uma rede de plaquetas, estabilizado por fibrina e resultando num firme, ferida trombo 2 de vedação. Diferentemente da maioria dos outros testes de função plaquetária, experimentos com câmaras de fluxo tomar em consideração o parâmetro físico do fluxo sanguíneo e, portanto, a influência de reologia nas células que participam biomoléculas e 3,4. experimentos câmara de fluxo geraram conhecimentos marco na hemostasia e trombose variando parâmetros-chave que influenciam hemostático (sub) processos, incluindo os perfis de matriz adesiva, reologia e fluxo, composição celular, presença de toxinas ou drogas, força iônica e muitos mais. Nas últimas duas décadas, o baixo rendimento experimentos câmara de fluxo que exigem grandes volumes de amostras (10-100 ml) evoluíram para câmaras microfluídicos, muitas vezes consistem em câmaras de placas paralelas pequenas e incluindo a tecnologia moderna para perfusão de sangue total em condições de cisalhamento controladas 5. Microscaling aumentou significativamente ensaio de rendimento principalmente porque a configuração de hardware tem simplificado e menos volume (sangue) é necessário, tornando a experiência mais acessível e Versatile. Por exemplo, o sangue a partir de pequenos animais de laboratório pode agora ser utilizado sem a necessidade de sacrificar os animais. As amostras de sangue de ratos geneticamente modificados têm, portanto, auxiliado na identificação de moléculas-chave promover ou inibir a hemostasia e em novos conhecimentos básicos 6. Laboratórios de pesquisa especializados, muitas vezes ainda usam câmaras de fluxo personalizado feito por exemplo, de polidimetilsiloxano (PDMS) 7, que polimeriza em moldes litografadas que pode ser blueprinted por software. A câmara resultante é barato e descartável e pode ser facilmente desmontado para análise post hoc. Além disso, basicamente, qualquer construção de embarcações, incluindo bifurcações ou curvas fechadas podem ser construídas no comando. Esta vantagem é também a sua desvantagem desde normalização já era o principal problema com experimentos câmara de fluxo, e PDMS personalizado feito câmaras não têm ajudado isso. No topo desta questão em particular, revestimento (condições), sondas fluorescentes, anticoagulante, temperaturaratura e tempo entre a amostragem e análise são todos mal padronizado 8. Padronização dessas variáveis ​​é um desafio, mas, no entanto, necessário para permitir a comparação de resultados entre laboratórios. Este tópico é o assunto principal da Sociedade Internacional sobre Trombose e Hemostasia na subcomissão Científico e Normalização em Biorheology 9,10. Os concentrados de plaquetas (PC) são transfundidas em pacientes que sofrem de várias doenças que provocam trombocitopenia e / ou sangramento. Mas plaquetas no PC são conhecidos para dessensibilizar, especialmente em função do tempo de armazenamento 11, um processo de deterioração associada ao envelhecimento e vulgarmente referidos como lesão de armazenagem de plaquetas. Às vezes é alegado que essas plaquetas restaurar em circulação, uma vez transfundido 12, mas as evidências para isso é escasso. Além disso, a funcionalidade de plaquetas que formam um PC não é rotineiramente testadas porque a relação entre tais ensaios eeficácia terapêutica ou profilática não está claro 13. câmaras de fluxo microfluídicos oferecem um meio para investigar a função plaquetária no PC para otimizar a cadeia de manipulações entre a recolha ea emissora. É uma ferramenta de pesquisa poderosa para (pareados) comparações diretas de PC como já anteriormente publicados 14,15 e é descrito aqui.

<table><tbody><tr><td>Tubo de vácuo BD com EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>tubo de vacutainer BD com heparina</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vacutainer BD com citrato de sódio</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin Tubo de sangue</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer BD Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Agulha de coleta de sangue com suporte pré-acoplado</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 100-1.000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Tubo 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de precisão</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Nomeado em Figura S1 A como 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>Tubing</td><td></td><td>Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Nomeado em Figura S1 B como 'Tubo descartável'Vena8</td></tr> <tr><td>Agulhas</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Nomeado em Figura S1 B como 'Pin'Conectores</td></tr> <tr><td>para cabos de entrada simples de biochips</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Nomeado em <forte>Figura S1</forte> B como 'Tubo reutilizável' e 'Divisor'Caixa</td></tr> <tr><td>umidificada</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Software bomba microfluídica</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Ensaio</td></tr><tr><td>Horm Colágeno Takeda</td><td>/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Colágeno nativo do tendão equino (tipo I) Solução isotônica de glicose para diluir o colágeno é suplementada</td></tr><tr><td>HEPES tamponado com solução salina (HBS)</td> <td>em casa preparação</td><td>em casa 10</td><td>mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) solução salina tamponada (0,9% (p/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio</td><td>em casa preparação</td><td>em casa</td><td>1,0% (p/v) de albumina de soro bovino e 0,1% (p/v) de glicose em HBS</td></tr><tr><td>Calceína AM</td><td>Sondas moleculares</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante 10%</td> <td>em casa preparação</td><td>em casa preparação</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>em casa preparação</td><td>em casa</td> preparação em casa <td></td></tr><tr><td>Álcool desnaturado</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>com Multiflow8. Nomeado em Figura S1 A como 'Bomba' e 'Manifold'Microscópio</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>equipado com um colibri-LED e câmera CCD de alta resolução</td></tr><tr><td>Microscópio de software&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N / A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Analisador de hematologia</td><td>Sysmex</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Plaquetas incubater</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Incubação banho-maria</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Marca</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Roller Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de acoplamento estéril</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Selador de tubos</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluídico fluxo chambers utilizando sangue reconstituído ao modelo hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

As plaquetas sanguíneas preparadas para transfusão perdem gradualmente a função hemostática durante o armazenamento. A função plaquetária pode ser investigada usando uma variedade de experimentos in vitro (indiretos), mas nenhum deles é tão abrangente quanto as câmaras de fluxo microfluídico. Nesse protocolo, a reconstituição do sangue fresco trombocitopênico com plaquetas armazenadas no banco de sangue é utilizada para simular a transfusão de plaquetas. Em seguida, a amostra reconstituída é perfundida em câmaras de fluxo microfluídico que mimetizam a hemostasia em proteínas expostas da matriz subendotelial. Os efeitos da doação de sangue, transporte, separação de componentes, armazenamento e inativação de patógenos podem ser medidos em projetos experimentais pareados. Isso permite uma comparação confiável do impacto que cada manipulação na preparação de componentes sanguíneos tem na hemostasia. Nossos resultados demonstram o impacto do ciclo de temperatura, taxas de cisalhamento, concentração de plaquetas e duração de armazenamento na função plaquetária. Em conclusão, este protocolo analisa a função das plaquetas do banco de sangue e isso ajuda na otimização da cadeia de processamento, incluindo flebotomia, transporte, preparação de componentes, armazenamento e transfusão.

Para demonstrar a variação intra-ensaio, três amostras de sangue total reconstituído idênticos foram perfundidos simultaneamente sobre as superfícies de colagénio revestido (Figura 1). Isto resultou em um coeficiente de variação de 8,7%. Esta estatística sugere intra-ensaio aceitável e variação intralaboratorial permitindo comparação fiável entre amostras relacionadas. A entrada da câmara de fluxo comercial de...

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

O objetivo geral deste experimento é simular in vitro a transfusão de plaquetas e testá-la por meio da hemostasia em colágeno, com fluxo hidrodinâmico e microscopia em tempo real. Pacientes com trombocitopenia são tratados com concentrados de plaquetas armazenados. Nosso método tem a finalidade de ajudar a responder perguntas fundamentais na área de trombose e hemostasia, com ênfase específica na qualidade e função desses concentrados de plaquetas armazenados.O valor agregado desta técnica é que ela simula o fluxo sanguíneo e, portanto, leva em consideração as influências da reologia sobre as células e biomoléculas participantes. O método atual avalia a ligação de plaquetas ao colágeno. No entanto, também pode ser aplicado a outros tecidos adesivos, incluindo placa aterosclerótica, células endoteliais ou proteínas matriciais específicas, como o fator de Von Willebrand e o fibrinogênio.Inicie preparando o biochip. Vortexe e dilua um estoque de colágeno na proporção de um para 20 na solução isotônica de glicose do fabricante, obtendo uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Em seguida, pipete 0,8 microlitro nos canais de um biochip descartável novo.Encha todas as fileiras em uma extremidade do chip e marque esta como a extremidade de saída. Em seguida, inspecione o chip para garantir que cada fileira esteja preenchida até cinco sextos com a solução e sem bolhas de ar. Incube, então, o chip a quatro graus Celsius por quatro horas ou durante a noite, em um recipiente fechado e umidificado.Posteriormente, bloquee os canais codificados pipetando o tampão de bloqueio na outra extremidade das canaletas. Em seguida, para cada canaleta, corte segmentos de tubo com 12 centímetros de comprimento e fixe um pino em cada segmento para torná-los acopláveis ao biochip. Enxágue os segmentos de tubo com água destilada usando uma seringa e um conector.Em seguida, sature-os com o tampão bloqueador e feche-os em um recipiente umidificado por pelo menos uma hora. Depois, prepare a bomba e o coletor. Primeiro, enxágue a bomba e o coletor com água destilada para remover quaisquer bolhas de ar.Em seguida, fixe o biochip ao estágio do microscópio automatizado. Coloque uma extremidade dos comprimentos em um tubo de 1,5 mililitro cheio com HBS e, depois, conecte a outra extremidade às entradas do biochip. Insira os pinos do manifold nas saídas do biochip.Em seguida, lave o sistema com HBS utilizando a bomba. Qualquer tampão bloqueador remanescente ou colágeno mal aderido será assim removido. Isso conclui os preparativos da câmara de fluxo.Inicie reunindo coletas recentes de sangue de voluntários saudáveis em um tubo cônico para centrífuga. Centrifugue a amostra por cerca de 15 minutos a 250 Gs. Não utilize o freio, pois ele irá perturbar a fase inferior fracamente compactada. Remova e descarte o plasma rico em plaquetas e a camada de buffy coat.Guarde os glóbulos vermelhos concentrados contendo o menor número possível de plaquetas, para preparar o sangue reconstituído. Agora, comece a descongelar quatro mililitros de plasma do tipo AB a 37 graus Celsius durante cinco minutos e 20 segundos. Enquanto isso, determine o hematócrito dos glóbulos vermelhos concentrados preparados utilizando um analisador hematológico automatizado.Em seguida, determine a concentração de plaquetas de um concentrado de plaquetas preparado por banco de sangue para uso na reconstrução do sangue total. Calcule os volumes necessários para um mililitro de sangue reconstruído com 40% de hematócrito e 250.000 plaquetas por microlitro. Agora, utilizando uma ponteira de pipeta cortada, transfira os volumes necessários de hemácias, plasma e concentrado de plaquetas até a concentração desejada e um volume final de um mililitro.Misture o sangue reconstituído com inversões suaves e realize uma contagem sanguínea completa. Em seguida, pegue um tubo de microcentrífuga preparado contendo Calcein AM e adicione um mililitro de sangue reconstituído a ele. Misture o sangue com o corante utilizando inversões suaves.Em seguida, incubar o sangue reconstituído por cinco minutos a 37 graus Celsius. No software, selecionar a região de interesse na via de perfusão. Focar nas fibras de colágeno aderidas ao fundo das vias em uma ampliação de 100x.De preferência, utilize contraste de fase ou contraste de interferência diferencial. Escolha a opção definir corrente Z para regiões selecionadas em mosaico para fixar digitalmente as posições Z selecionadas. O foco óptico antes da perfusão deve estar sobre o colágeno de ameloblastos, mas isso pode ser difícil.Uma alternativa é ajustar o foco do microscópio nas plaquetas aderidas inicialmente. Agora, misture suavemente as amostras e posicione-as ao lado do biochip. Em seguida, coloque a tubulação conectada à via observada no sangue reconstituído.Em seguida, utilizando o software de controle da bomba, aplique uma pressão de 50 dyn/cm² para mover a amostra de sangue para dentro do canal e iniciar o experimento. Durante o experimento, registre imagens a cada 15 segundos durante cinco minutos. Determine a cinética de crescimento do trombo utilizando um software de análise de imagens.Neste caso, utiliza-se o Zen 2012. Inicie abrindo a análise de imagem do plugin para determinar a cobertura superficial das plaquetas. Defina o limiar de fluorescência na aba analisar interativa para estabelecer a intensidade dos pixels que se correlaciona com um sinal positivo, proveniente das plaquetas aderidas.Em seguida, utilize a função de criação de tabelas para gerar automaticamente uma planilha com uma lista das áreas superficiais dos sinais positivos para cada ponto temporal. Salve essas planilhas no formato XML e abra-as em um programa de planilhas para cálculos adicionais. Em cada ponto temporal, calcule as áreas superficiais totais dos objetos selecionados e expresse esse valor como a porcentagem da superfície que está coberta.Em seguida, plote os dados em função do tempo de perfusão e calcule a inclinação por regressão linear. Isso modela a cinética de crescimento do trombo para aquela condição experimental específica. Três amostras idênticas de sangue total reconstituído foram perfundidas simultaneamente sobre superfícies revestidas com colágeno.Isso resultou em um coeficiente de variação de 8,7%, sugerindo variação intraensaio e intralaboratorial aceitável para comparação dos testes. A transfusão foi simulada pela reconstituição do sangue com o componente deficiente. Várias reconstituições foram realizadas com concentrações decrescentes de plaquetas.Conforme esperado, contagens mais baixas de plaquetas resultaram em menor adesão em função do tempo de perfusão. Em seguida, foi investigado o efeito da diminuição da temperatura após a coleta de sangue e durante a perfusão. Observou-se que os trombos se formavam mais lentamente quando o sangue era resfriado até a temperatura ambiente.Em comparação com uma amostra mantida a 37 graus Celsius durante todo o estudo. Durante a circulação, as plaquetas se ligam a locais de lesão vascular em condições de estresse cisalhante elevado na parede. Como esperado, variar a taxa de cisalhamento nas câmaras de fluxo microfluídicas alterou a adesão plaquetária total.Essas condições também alteram a cinética do crescimento do trombo. Após assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como realizar experimentos em câmara de fluxo microfluídica utilizando sangue reconstituído para testar a qualidade e a função de concentrados de plaquetas armazenados. Esta técnica pode ser realizada em aproximadamente sete horas.Experimentos com câmara de fluxo microfluídica abriram caminho para pesquisadores na área de transfusão de plaquetas explorarem o impacto de variáveis de doação, preparação e armazenamento. Um exemplo relevante é a inativação de patógenos. Apresentamos um exemplo de apenas um assunto experimental.No entanto, variações na concentração de cálcio, tensão de cisalhamento e revestimentos de superfície podem ser utilizadas para abordar diferentes questões de pesquisa. Semelhantes a este procedimento, outras medições em câmaras de fluxo microfluídicas podem ser realizadas para responder perguntas adicionais. Por exemplo, o desempenho de plaquetas armazenadas na coagulação sob fluxo.

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

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