Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas In Vitro
19 de março de 2016
A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.
O objetivo geral deste experimento é mimetizar a transfusão de plaquetas in vitro e testá-la usando hemostasia em colágeno, com fluxo hidrodinâmico e microscopia em tempo real. Pacientes com trombocitopenia são tratados com concentrados de plaquetas armazenados. Nosso método destina-se a ajudar a responder questões-chave no campo da trombose e hemostasia, com ênfase específica na qualidade e função desses concentrados de plaquetas armazenados.
O valor agregado dessa técnica é que ela imita o fluxo sanguíneo e, portanto, leva em consideração as influências reológicas nas células e biomoléculas participantes. O método atual avalia a ligação plaquetária ao colágeno. Pode, no entanto, também ser aplicado a outros tecidos adesivos, incluindo placa aterosclerótica, células endoteliais ou proteínas específicas da matriz, como o fator de Von Willebrand e o fibrinogênio.
Comece preparando o biochip. Vortex e dilua um estoque de colágeno de um a 20 na solução isotônica de glicose do fabricante até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Em seguida, pipete 0,8 microlitros nas pistas de um novo biochip descartável.
Preencha todas as pistas em uma extremidade do chip e marque-a como a extremidade de saída. Em seguida, inspecione o chip para certificar-se de que cada pista esteja preenchida 5/6 do caminho com a solução e sem bolhas de ar. Em seguida, incube o chip a quatro graus Celsius por quatro horas ou durante a noite em um recipiente umidificado e fechado.
Mais tarde, bloqueie os canais codificados pipetando o buffer de bloqueio na outra extremidade das pistas. Em seguida, para cada pista, corte comprimentos de tubos de 12 centímetros e prenda um pino em cada comprimento de tubo para torná-los fixos ao biochip. Enxágue os comprimentos dos tubos com água destilada de uma seringa e um conector.
Em seguida, sature-os com tampão de bloqueio e feche-os em um recipiente umidificado por pelo menos uma hora. Em seguida, prepare a bomba e o coletor. Primeiro, enxágue a bomba e o coletor com água destilada para remover quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, anexe o biochip ao estágio do microscópio automatizado. Coloque uma extremidade dos comprimentos em um tubo de 1,5 mililitro cheio de HBS e, em seguida, prenda-os com a outra extremidade às entradas do biochip. Coloque os pinos do coletor nas saídas do biochip.
Em seguida, enxágue o sistema com HBS usando a bomba. Qualquer tampão bloqueador remanescente ou colágeno mal aderido será removido. Isso completa os preparativos da câmara de fluxo.
Comece reunindo coletas de sangue recentes de voluntários saudáveis em um tubo de centrífuga cônico. Gire a amostra por cerca de 15 minutos a 250 Gs.Do não use o freio, pois isso perturbará a fase inferior frouxamente compactada. Remova e descarte o plasma rico em plaquetas e o revestimento leucocitário.
Guarde o concentrado de glóbulos vermelhos contendo o menor número possível de plaquetas, para fazer o sangue reconstituído. Agora, comece a descongelar quatro mililitros de plasma tipo AB a 37 graus Celsius por cinco minutos e 20 segundos. Enquanto isso, determine o hematócrito do concentrado de glóbulos vermelhos preparados usando um analisador hematológico automatizado.
Em seguida, determine a concentração de plaquetas de um concentrado de plaquetas preparado para banco de sangue para usar na reconstituição do sangue total. Calcule os volumes necessários para um mililitro de sangue reconstituído com 40% de hematócrito e 250.000 plaquetas por microlitro. Agora, usando uma ponta de pipeta cortada, transfira o volume necessário de glóbulos vermelhos, plasma e concentrado de plaquetas para a concentração desejada e um volume final de um mililitro.
Misture o sangue reconstituído com inversões suaves e faça um hemograma completo. Em seguida, pegue um tubo de microcentrífuga preparado contendo Calceína AM e adicione um mililitro de sangue reconstituído a ele. Misture o sangue com corante usando inversões suaves.
Em seguida, incube o sangue reconstituído por cinco minutos a 37 graus Celsius. No software, selecione a região de interesse na pista de perfusão. Concentre-se nas fibras de colágeno aderidas na parte inferior das faixas com ampliação de 100x.
O ideal é usar contraste de fase ou contraste de interferência diferencial. Escolha a opção Definir Z atual para regiões de ladrilhos selecionadas para corrigir digitalmente as posições Z selecionadas. O foco óptico antes da perfusão deve estar no colágeno de amelobilasto, mas isso pode ser complicado.
Uma alternativa é definir o foco do microscópio nas plaquetas aderentes iniciais. Agora, misture delicadamente as amostras e posicione-as ao lado do biochip. Em seguida, coloque o tubo conectado à faixa observada no sangue reconstituído.
Em seguida, usando o software que controla a bomba, aplique uma pressão de 50 dinas por centímetro quadrado para mover a amostra de sangue para a pista e iniciar o experimento. Durante o experimento, grave imagens a cada 15 segundos por cinco minutos. Determine a cinética de crescimento do trombo usando um software de análise de imagem.
Nesse caso, o Zen 2012 é utilizado. Comece abrindo a análise de imagem do plug-in para determinar a cobertura da superfície das plaquetas. Defina o limite de fluorescência na guia interativa de análise para definir a intensidade do pixel que se correlaciona com um sinal positivo, que viria de plaquetas aderentes.
Em seguida, use criar tabelas para gerar automaticamente uma planilha com uma lista das áreas de superfície dos sinais positivos para cada ponto de tempo. Salve essas planilhas no formato XML e abra-as em um programa de planilhas para cálculos adicionais. Em cada ponto de tempo, calcule as áreas totais da superfície dos objetos selecionados e expresse esse valor como a porcentagem da superfície que é coberta.
Em seguida, plotar os dados em função do tempo de perfusão e calcular a inclinação por regressão linear. Isso modela a cinética de crescimento do trombo dessa condição experimental específica. Três amostras idênticas de sangue total reconstituído foram perfundidas simultaneamente sobre superfícies revestidas de colágeno.
Isso resultou em um coeficiente de variação de 8,7%, sugerindo variação intra-ensaio e intralaboratorial aceitável para comparação do teste. A transfusão foi simulada pela reconstituição do sangue com o componente deficiente. Várias reconstituições foram realizadas com concentrações plaquetárias decrescentes.
Como esperado, contagens de plaquetas mais baixas resultaram em menor adesão em função do tempo de perfusão. Em seguida, foi investigado o efeito da diminuição da temperatura após a coleta de sangue e durante a perfusão. Descobriu-se que os trombos se acumulavam mais lentamente quando o sangue era resfriado à temperatura ambiente.
Em comparação com uma amostra mantida a 37 graus Celsius durante todo o estudo. Durante a circulação, as plaquetas se ligam aos locais de lesão dos vasos em condições de estresse absoluto da parede elevada. Como esperado, a variação da taxa absoluta nas câmaras de fluxo microfluídico alterou a adesão plaquetária total.
Essas condições também alteram a cinética de crescimento do trombo. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de câmara de fluxo microfluídico usando sangue reconstituído para testar a qualidade e a função dos concentrados de plaquetas armazenados. Essa técnica pode ser feita em cerca de sete horas.
Experimentos com câmara de fluxo microfluídico abriram caminho para pesquisadores no campo da transfusão de plaquetas explorarem o impacto das variáveis de doação, preparação e armazenamento. Um exemplo relevante é a inativação de patógenos. Demos o exemplo de apenas um sujeito experimental.
No entanto, variações na concentração de cálcio, tensão pura e revestimentos de superfície podem ser usados para abordar diferentes questões de pesquisa. Semelhante a este procedimento, outras medições em câmaras de fluxo microfluídico podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, o desempenho das plaquetas armazenadas para coagulação no fluxo.
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Visão Geral
Este estudo investiga a transfusão de plaquetas e a hemostasia utilizando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídicas. Destaca o impacto das lesões de armazenamento plaquetário na função hemostática in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hematologia
- Trombose
- Hemostase
Contexto
- Pacientes com trombocitopenia recebem concentrados de plaquetas armazenados.
- As lesões associadas ao armazenamento de plaquetas podem afetar a função hemostática.
- Compreender a função plaquetária é essencial para melhorar os resultados das transfusões.
- Os métodos atuais avaliam as interações das plaquetas com colágeno e outros tecidos adesivos.
Objetivo do Estudo
- Simular a transfusão de plaquetas in vitro.
- Avaliar a função hemostática sobre colágeno sob fluxo hidrodinâmico.
- Investigar a qualidade e funcionalidade de concentrados de plaquetas armazenados.
Métodos Utilizados
- Técnicas de reconstituição sanguínea.
- Câmaras de fluxo microfluídicas para microscopia em tempo real.
- Avaliação da ligação de plaquetas ao colágeno.
- Aplicação a outros tecidos adesivos, como placa aterosclerótica.
Resultados Principais
- Demonstrou os efeitos das lesões de armazenamento na função plaquetária.
- Forneceram informações sobre as capacidades hemostáticas das plaquetas armazenadas.
- Mostrou a relevância do fluxo hidrodinâmico na avaliação das interações plaquetárias.
- Destacou aplicações potenciais para diversos tecidos adesivos.
Conclusões
- O estudo oferece um método inovador para avaliar a eficácia da transfusão de plaquetas.
- Os achados podem orientar práticas clínicas relacionadas ao armazenamento e à transfusão de plaquetas.
- Pesquisas futuras podem expandir as implicações para trombose e hemostasia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D da indústria biofarmacêutica avaliem a eficácia da transfusão de plaquetas em condições de fluxo fisiologicamente relevantes, preenchendo uma lacuna crítica na avaliação pré-clínica da qualidade dos produtos sanguíneos. Ao simular a hemostase em câmaras microfluídicas utilizando sangue reconstituído, o método fornece leituras quantitativas e em tempo real da função plaquetária, que apoiam decisões de avançar ou não avançar (go/no-go) no desenvolvimento de terapias transfusionais. A abordagem reduz os riscos no avanço translacional ao vincular variáveis de armazenamento a desfechos funcionais, aumentando assim a confiança preditiva no desempenho de produtos plaquetários.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas relativas à função plaquetária e ao impacto da lesão de armazenamento na hemostasia.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos em concentrados de plaquetas sob condições controladas de tensão de cisalhamento e temperatura.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar concentração de plaquetas, duração do armazenamento e ciclagem térmica com a cinética de crescimento do trombo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente de compostos moduladores de plaquetas ou intervenções de armazenamento.
- Reprodutibilidade: Fornece medidas quantitativas da cobertura superficial com baixa variação intraensaio (CV de 8,7%), permitindo avaliação confiável de compostos.
- Escalabilidade: Permite testes multiplexados de três amostras idênticas de sangue reconstituído simultaneamente sobre superfícies revestidas com colágeno.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela cenários de tratamento da trombocitopenia usando sangue reconstituído para imitar a transfusão clínica de plaquetas.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao medir a função hemostática sobre colágeno sob fluxo hidrodinâmico.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta decisões de avanço ao quantificar o impacto da doação de sangue, transporte, separação de componentes, armazenamento e inativação de patógenos na função plaquetária.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a avaliação pré-clínica, permitindo a avaliação contínua da qualidade do produto plaquetário ao longo da cadeia de processamento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre lesões decorrentes do armazenamento de plaquetas e a elucidação de vias da hemostasia sob fluxo.
- Triagem: Oferece sistemas prontos para ensaios e reprodutíveis para avaliar a adesão plaquetária e a cinética do crescimento de trombos.
- Análises: Gera cinética quantitativa do crescimento de trombos por meio de análise de imagem e regressão linear, permitindo comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao simular transfusão e medir desfechos funcionais em condições de cisalhamento relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para avaliar a qualidade de produtos plaquetários sob múltiplas variáveis de armazenamento e etapas de processamento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva na função plaquetária ao reduzir a ambiguidade mecanicista nos efeitos da lesão por armazenamento.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos controlados de perfusão, bloqueio e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao associar duração do armazenamento, temperatura e taxa de cisalhamento aos resultados funcionais das plaquetas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de otimizações no processamento de plaquetas com base em dados empíricos de hemostasia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação de microfluídica, reconstituição sanguínea e microscopia em tempo real.
- Depende de estágio microscópico automatizado, sistema de bomba com múltiplas saídas e biochips biocompatíveis.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos valores de hematócrito, concentração de plaquetas e pressão de perfusão.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes taxas de cisalhamento, perfis de temperatura e revestimentos de superfície (por exemplo, colágeno, FVW, fibrinogênio).
- As limitações práticas incluem a necessidade de preenchimento dos canais isento de bolhas de ar e manutenção precisa do foco em Z durante a perfusão.
