Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

O objetivo geral desta técnica é identificar alterações na regulação neural da motilidade colônica em camundongos utilizando imagem de vídeo. Esta técnica pode ajudar a responder perguntas fundamentais relacionadas ao campo da neurociência entérica, como por exemplo se mutações genéticas sutis em genes neuronais afetam a motilidade colônica. A principal vantagem desta técnica é que o tecido está isolado, na ausência de entrada do sistema nervoso central, e, como resultado, o método permite investigar o envolvimento do sistema nervoso entérico no controle da motilidade gastrointestinal.

Essa técnica estende-se ao tratamento de doenças neurodesenvolvimentais, como o autismo, pois mutações genéticas que alteram a função sináptica no cérebro também podem alterar a motilidade intestinal. Comece utilizando pinça cirúrgica e tesoura para fazer uma incisão através da epiderme sobrejacente às camadas musculares abdominais inferiores. Abra a cavidade abdominal ao longo da linha média até o esterno.

Umedeça o tecido com soro fisiológico e use a pinça para levantar suavemente o ceco quatro a cinco centímetros acima do abdômen. Em seguida, com tesoura de dissecação fina, remova o mesentério, tomando cuidado para não manipular, esticar ou cortar o tecido gastrointestinal. Remova a bexiga, os testículos e quaisquer outros tecidos excedentes.

Em seguida, utilizando tesoura de dissecação grossa, faça duas incisões verticais a aproximadamente 0,5 centímetros da linha média no osso pélvico em cada lado do cólon, e use a tesoura fina para separar o reto dos tecidos pélvicos adjacentes. Remova o mesentério do cólon e lave o tecido do cólon inteiro em um béquer contendo solução salina fisiológica. Para remover os pellets fecais e outros conteúdos intestinais, primeiro corte aproximadamente um centímetro da extremidade de uma pipeta de 200 microlitros e conecte a pipeta a uma seringa de cinco mililitros preenchida com solução salina fisiológica.

Em seguida, após remover o ceco e o reto, fixe um alfinete de entomologia na extremidade mais próxima do cólon, onde as estriações na mucosa são visíveis, para orientar o tecido. Agora, segure suavemente o tecido na extremidade proximal e insira a ponteira da pipeta na luz, lavando o cólon com salina fisiológica, direcionando o líquido para um recipiente de resíduos. Em seguida, com a mesma seringa e ponteira, remova qualquer resíduo dos tubos conectados a um banho de órgãos de duas câmaras, utilizando salina fisiológica fresca.

Configure o banho de órgãos de modo que as câmaras sejam continuamente superfundidas com solução salina fisiológica borbulhada com carbogênio e use um sensor de temperatura para confirmar regularmente que a temperatura da solução salina permaneça entre 33 e 37 graus Celsius. Use uma rolha de borracha com um tubo de vidro de cinco milímetros de diâmetro interno inserido pelo centro para manter a pressão no reservatório de entrada. Em seguida, submerja completamente um segmento de cinco a sete centímetros de cólon na câmara do banho de órgãos e use pinça e linha de algodão comum para canular a extremidade proximal do cólon ao tubo de entrada e a extremidade distal do cólon ao tubo de saída.

Após determinar a distância basal entre as cânulas proximal e distal do cólon, equilibre o tecido em solução salina fisiológica durante 30 minutos. Para registrar os movimentos intestinais, enquanto o cólon se aclimata, posicione uma câmera de vídeo a 10 a 15 centímetros acima da cuba orgânica em um suporte de laboratório padrão, e configure o software apropriado de captura de vídeo. Quando a câmera estiver pronta, grave quatro segmentos de vídeo de 15 minutos cada do cólon em condições controle.

Em seguida, realize a superfusão do fármaco de interesse no banho de órgãos por 30 a 60 minutos, capturando mais quatro segmentos de vídeo de 15 minutos cada. Por fim, substitua a solução tratada por salina fisiológica fresca e grave mais quatro segmentos de vídeo de 15 minutos durante o período de lavagem de uma hora. Mapas espaciais e temporais do cólon, em resposta aos diferentes períodos de tratamento, podem então ser gerados.

Para avaliar se mutações sinápticas alteram os complexos motores migratórios colônicos, ou CMMC, quando o sistema nervoso entérico é farmacologicamente perturbado, neste experimento, o antagonista dos receptores 5-HT3 e 4, tropisetrona, foi adicionado à câmara do banho de órgãos com preparação de cólon. Na presença de tropisetrona, camundongos NL3R451C exibiram uma diminuição na frequência de CMMC em comparação com seus irmãos selvagens. Embora nenhuma diferença significativa tenha sido observada entre a contratilidade de tipo selvagem e NL3R451C durante condições controladas, a tropisetrona reduziu significativamente a frequência de CMMC tanto em camundongos tipo selvagem quanto em NL3R451C.

Além disso, a tropisetrona impôs um efeito maior sobre a frequência dos CMMC em camundongos NL3R451C em comparação com animais selvagens. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em quatro horas se for realizada corretamente. Ao tentar esta técnica, certifique-se de que o banho de órgãos seja mantido em temperatura constante, tenha suprimento contínuo de carbogênio e o transbordamento de solução salina fisiológica seja evitado por meio de vácuo.

Após seguir este procedimento, outras técnicas, como imunocitoquímica, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como se há alterações nas proporções neuronais ou no número de células em camundongos que exibem motilidade colônica alterada. Desde seu desenvolvimento, este método tem permitido uma variedade de estudos sobre a motilidade intestinal em porquinhos-da-índia, coelhos, ratos e outras espécies, e, mais particularmente neste caso, em camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar alterações na regulação neuronal da motilidade colônica utilizando imagens em vídeo.