Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de In Vivo Gravações intracelulares

O objetivo geral deste método de registro intracelular é determinar a sensibilidade espectral de células fotorreceptoras individuais em um olho composto de inseto in vivo. Este método pode nos dizer se os comprimentos de onda da luz aos quais uma célula é sensível são afetados pela filtragem de pigmentos. A principal vantagem dessa técnica é que, conhecendo as sensibilidades espectrais dos fotorreceptores individuais, podemos prever a gama de cores que um animal pode ver.

Para se preparar para a gravação, ligue a lâmpada de xenônio pelo menos 45 minutos antes do experimento e ligue o extrator de microeletrodos pelo menos 30 minutos antes de puxar os eletrodos de vidro. Em seguida, ligue todo o equipamento de gravação. Certifique-se de que o obturador esteja fechado por padrão, para que nenhuma luz passe pelo cabo de fibra óptica.

Em seguida, puxe microeletrodos finos de vidro borossilicato usando o extrator de microeletrodos. Preencha os eletrodos com cloreto de potássio de três molares. Para preparar a amostra, sob o microscópio, fixe uma borboleta individual dentro de um pequeno tubo de plástico com cera quente, de modo que a cabeça fique imóvel e saliente de uma extremidade do tubo.

Em seguida, fixe a tromba, antenas e asas com cera. Depois disso, segure o abdômen com um pedaço de cera seco. Mantenha o tubo umidificado colocando um lenço úmido dentro dele, atrás do abdômen da amostra.

Certifique-se de que a amostra esteja completamente imóvel. Em seguida, monte o tubo usando um pequeno pedaço de cera em uma pequena plataforma com uma junta esférica que é presa a uma base magnética. Sob um microscópio de dissecação, insira um fio de prata na cabeça através da parte da boca, como eletrodo de referência.

Antes do experimento, fixe permanentemente o fio à plataforma. Em seguida, faça um pequeno orifício na córnea esquerda usando uma lâmina de barbear e sele o orifício com vaselina para evitar a dessecação. Assim que a córnea for cortada, insira o eletrodo de registro no olho o mais rápido possível, porque a hemolinfa no olho endurecerá rapidamente e impossibilitará a inserção de um eletrodo.

Se possível, execute a dissecação no equipamento onde a gravação será realizada. Em seguida, conecte o fio terra do estágio principal ao eletrodo de referência na plataforma da amostra, usando as garras jacaré. Monte o eletrodo no suporte do eletrodo.

Em seguida, insira o fio de prata na solução de cloreto de potássio no microeletrodo. Use uma fonte de luz com acessórios de pescoço de ganso para iluminar a amostra sob um estereoscópio enquanto abaixa o eletrodo no olho. Ajuste o suporte do eletrodo para que o microeletrodo fique diretamente acima do orifício previamente cortado na córnea.

Em seguida, abaixe o microeletrodo no olho usando o micromanipulador, até que um circuito seja concluído. Uma vez no olho, balance o estereoscópio para fora da gaiola de Faraday. Desligue a fonte de luz que ilumina a amostra e deixe o inseto no escuro por 10 a 20 minutos para adaptação ao escuro.

Verifique a resistência do eletrodo aplicando uma corrente de nanoamperes e observando a mudança na tensão. A resistência normalmente deve estar na faixa entre 100 e 250 megaohms. Em seguida, ative o gerador de pulso para fornecer um flash de luz durante o experimento e direcione o cabo de fibra óptica em direção ao olho.

Verifique o osciloscópio quanto à mudança de tensão a cada flash de luz. Uma mudança negativa na tensão significa que o eletrodo ainda não entrou na célula. Mova o cabo de fibra óptica ao redor da amostra até que uma resposta máxima de tensão seja observada.

Para gerar uma resposta de luz despolarizante, gire o micromanipulador para frente e para trás, o que resulta em pequenos movimentos verticais do eletrodo, enquanto bate levemente na base do porta-eletrodo ou usa a função buzz no pré-amplificador. Continue a fazer pequenos ajustes até que uma resposta de luz despolarizante apareça no osciloscópio. Em seguida, ajuste o cabo de fibra óptica para encontrar o maior sinal de despolarização.

Faça pequenos ajustes com um micromanipulador e use a função de zumbido no amplificador conforme necessário, para garantir que o eletrodo esteja gravando a célula de forma estável. Uma gravação estável deve ter pouca ou nenhuma alteração no potencial de repouso, baixo ruído de fundo e uma resposta despolarizante consistentemente grande. É essencial ter um registro estável onde o potencial de membrana em repouso não seja ruidoso e não mude com o tempo.

As respostas devem ser grandes e positivas, sem hiperpolarização. Quando a configuração estiver estável, abra o software e feche a caixa de diálogo chamada Galeria de Experimentos"para abrir uma janela pop-up com quatro canais. Ajuste a escala de tensão no canto superior direito da janela do software para 500 milivolts.

Em seguida, clique em Iniciar no canto inferior direito para iniciar a gravação. Minimize os canais três e quatro e ajuste as escalas X e Y. Em seguida, permita que o software seja executado durante o experimento.

Para estimulação de luz branca, registre até 10 respostas individuais, com a roda de filtro ND ajustada no OD mais alto que ainda provoca uma resposta. Aqui, a mudança na resposta é mostrada em 3,0 OD e 2,0 OD. Em seguida, registre o mesmo número de respostas de 3,5 a 0,0 OD, em cada combinação, para fornecer uma curva de intensidade logarítmica de resposta. Antes de registrar a resposta da célula a todos os comprimentos de onda usando os filtros de interferência, primeiro encontre rapidamente o comprimento de onda de pico.

Sem nenhum filtro ND no caminho da luz, coloque um filtro transmissor de UV e observe brevemente a amplitude de resposta. Repita o procedimento com um filtro transmissor azul, um filtro transmissor verde e um filtro transmissor vermelho, o que deve dar uma ideia de onde estará a resposta de pico. Grave sob o comprimento de onda do filtro que fornece a resposta máxima antes de mudar para outro filtro de interferência.

Entre a gravação com filtros subsequentes, permita que a célula responda a um ou dois flashes de luz branca sem nenhum filtro no caminho da luz, a fim de ajudar a monitorar se a resposta de pico está se degradando ao longo do tempo. Em seguida, grave com outros filtros de interferência e permita até 10 respostas por filtro. Este é um exemplo de uma grande mudança de tensão negativa que é vista pouco antes de entrar em uma célula.

Aqui é mostrada uma gravação limpa, que tem pouco ruído de fundo e uma grande resposta despolarizante, normalmente de pelo menos 40 milivolts. E aqui está um exemplo de uma gravação ruim, devido à mudança potencial negativa após o pico principal. Este é outro exemplo de uma gravação ruim.

O potencial de repouso está passando por grandes flutuações e a grande quantidade de ruído de fundo pode obscurecer a amplitude da resposta. Este é um exemplo representativo de sensibilidade espectral derivada de uma única gravação. Os tipos de células são classificados por pico de sensibilidade em um comprimento de onda semelhante e forma geral do espectro de sensibilidade.

Os mesmos tipos de células são então calculados e a sensibilidade média é plotada com barras de erro padrão em cada comprimento de onda. Este gráfico mostra as sensibilidades espectrais de três tipos típicos de células encontradas em um inseto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de duas horas.

Seguindo este procedimento, experimentos comportamentais podem ser realizados para determinar se todos os tipos de células fotorreceptoras contribuem ou não para a discriminação de cores.