Name: Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de In Vivo Gravações intracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a técnica de registro intracelular para determinar a sensibilidade espectral de fotorreceptores em olhos compostos de borboletas in vivo. Este método permite prever a capacidade de visão de cores do inseto.

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Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma caixa de areia no...

As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléctrodo dentro ou sobre o olho de um animal, aplicando-se um estímulo de luz e medindo a variação de tensão como a soma de todas as respostas de células vizinhas 3-6. Se alguém está interessado especificamente na caracterização sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras individuais, muitas vezes vários tipos de células respondem simultaneamente em diferentes pontos fortes para um dado estímulo; assimpode ser difícil determinar a sensibilidade de tipos específicos de células a partir de dados do ERG especialmente se houver vários tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente semelhantes no olho. Uma possível solução é criar transgênicos Drosophila com o gene fotorreceptor (opsina) de interesse expressa nas células maioria R1-6 no olho e depois executar ERGs 7. Desvantagens potenciais deste método incluem não a baixa expressão da proteína fotorreceptor 8, eo período de tempo longo para a geração e triagem de animais transgênicos. Para os olhos, com menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintos, a adaptação do olho com filtros coloridos podem ajudar com a redução da contribuição de alguns tipos de células para o ERG, permitindo assim a estimativa da sensibilidade espectral máximos 9. gravação intracelular é uma outra técnica em que uma multa eletrodo espeta uma célula e um estímulo é aplicado. Os registros de eletrodos só isso indivA resposta de células idual para que a gravar e analisar várias células individuais podem produzir sensibilidades específicas de fisiologicamente diferentes tipos de células 10-14. Embora o nosso protocolo centra-se na análise de sensibilidade espectral, os princípios básicos da intracelular de gravação com eletrodos pontiagudos são modificáveis ​​para outras aplicações. Usando uma preparação diferente de uma amostra, por exemplo, e usando eléctrodos de quartzo afiadas, um pode gravar a partir de mais profundo no lobo óptica ou outras regiões do cérebro, de acordo com a questão que se coloca. Por exemplo, os tempos de resposta de células fotorreceptoras individuais 15, a actividade de células na óptica lóbulos 16 (lâmina, medula ou lobula 17), cérebro 18 ou outros gânglios 19 também podem ser gravadas com técnicas semelhantes, ou estímulos de cor pode ser substituído com polarização 20 -22 ou movimento estímulos 23,24. Fototransdução, o processo pelo qual a luzenergia é absorvida e transformada em um sinal eletroquímico, é uma característica antiga comum a quase todos os dias atuais filos animais 25. O pigmento visual encontrado em células fotorreceptoras e responsável por iniciar fototransdução visual é rodopsina. Rodopsinas em todos os animais são constituídos por uma proteína opsina, um membro da família G transmembranar sete do receptor acoplado à proteína, e um cromóforo associado que é derivada de uma molécula de retina ou semelhantes 26,27. Opsina sequência de aminoácidos e estrutura cromóforo afectar a absorvência da rodopsina para diferentes comprimentos de onda de luz. Quando um fotão é absorvido pelo cromóforo a rodopsina torna-se activa, iniciando uma cascata de proteína G na célula que, em última análise conduz à abertura de canais iónicos ligados à membrana 28. Diferentemente da maioria dos neurônios, células fotorreceptoras sofrer alterações potenciais graduados que podem ser medidos como uma mudança relativa na amplitude da resposta com a mudança de estímulo luminoso. Tipicamente, uma dadaTipo de fotorreceptores expressa apenas um gene da opsina (embora existam exceções 8,10,29-31). visão de cores sofisticada, do tipo encontrado em muitos vertebrados e artrópodes, é conseguido com um olho complexo de centenas ou milhares de células fotorreceptoras cada expressando mais uma ou ocasionalmente tipos rodopsina. A informação visual é capturado por comparação das respostas sobre o mosaico de fotorreceptores via de sinalização a jusante neural complexo no olho e no cérebro, resultando na percepção de uma imagem completa a cores e com movimento. Depois de medir as respostas de matérias de uma das células fotorreceptoras para diferentes comprimentos de onda da luz de gravação via intracelular, é possível calcular a sensibilidade espectral. Este cálculo baseia-se no princípio de Univariance, o que indica que a resposta de uma célula de fotorreceptores é dependente do número de fotões que absorve, mas não sobre as propriedades particulares dos fotões que absorve 32. Qualquer fotões que é absorbed por rodopsina irão induzir o mesmo tipo de resposta. Na prática, isto significa que a amplitude de resposta em bruto de uma célula irá aumentar devido a um aumento na intensidade da luz (mais fotões de absorver), ou a uma mudança no comprimento de onda para a sua sensibilidade de pico (maior probabilidade de rodopsina absorvendo esse comprimento de onda). Nós fazemos uso deste princípio em relacionar as respostas celulares a uma intensidade conhecida e ao mesmo comprimento de onda de respostas em diferentes comprimentos de onda e na mesma intensidade, mas sensibilidade relativa desconhecida. Os tipos de células são frequentemente identificado pelo comprimento de onda a que os seus picos de sensibilidade. Aqui nós mostramos um método para gravação e análise de sensibilidade espectral de fotorreceptores no olho de uma borboleta intracelular, com um foco em tornar este método mais acessível à comunidade científica em geral. Embora a gravação intracelular continua a ser comum na literatura, particularmente com respeito à visão de cores em insetos, encontramos that descrições de materiais e métodos são geralmente demasiado curto para permitir a reprodução da técnica. Nós apresentamos este método em formato de vídeo com o objectivo de permitir sua replicação mais fácil. Descrevemos também a técnica de utilização de equipamento de fácil obtenção e acessível. Abordamos ressalvas comuns que muitas vezes não são relatados, que retardam a investigação ao otimizar uma técnica nova e complexa.

<table><tbody><tr><td>Pupas</td><td></td><td></td> de borboleta <td>Várias espécies locais disponíveis precisam de licenças do USDA para envio. Carolina Bio Supply tem várias espécies de insetos que podem ser encomendadas dentro dos EUA sem a necessidade de licenças adicionais Grande</td></tr><tr><td>cilindro</td><td></td><td></td> de plástico <td>Qualquer câmara que permaneça umidificada funcionará</td></tr><tr><td>Alfinetes de insetos, tamanho 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Mel de Algaroba do Deserto Trader</td><td>Joe's</td><td></td><td>Qualquer solução de mel ou sacarose funcionará</td></tr><tr><td>Lâmpada de Arco Xenon</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel agora faz parte da Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel agora faz parte da Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel agora faz parte da Newport</td></tr><tr><td>Corporation Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel agora faz parte da Newport Corporation</td></tr><tr><td>Transportador Ferroviário, Pequeno (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel agora faz parte da Newport</td></tr><tr><td>Corporation Adaptador de Rosca, 8-32 Macho para 1/4-20 Macho, pacote de 10</td><td>Poste</td> de Montagem Óptica <td>Newport Corporation TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>, 1.0 pol., 0.5 pol. Dia. Aço Inoxidável, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Poste Óptico Antiderrapante, 2 pol., 0.5 pol. Postes de diâmetro, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Montagem de lente fixa, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Montagem de lente fixa, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de lente condensadora</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Lente de sílica convexa, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Roda de filtro de seis posições, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de montagem de roda de filtro</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Lente de sílica côncava, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de colimador</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de feixe colimador</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Conversor de Virola, Terminação SMA para 11 mm Ferrola Padrão</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Este adaptador permite que a fibra óptica se encaixe no suporte do colimador&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu; m de diâmetro UV-vis fibra obtic cabo</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel é agora uma parte da Newport Corporation</td></tr><tr><td>Obturador com unidade de acionamento</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Sílica Fundida Metálica ND Filtro, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Sílica Fundida Metálica ND Filtro, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Sílica Fundida Metálica ND Filtro, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND de sílica fundida UV, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílica fundida UV, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND metálico de sílica fundida UV, lâmpada 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal Ocean</td><td>Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td>Ocean Optics</td><td>Software USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de interferência, 300 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>, 310 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>, 320 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>, 330 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>, 340 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>, 350 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>, 360 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr>, <tr><td>370 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>, 380 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>, 390 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>, 400 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>, 410 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>, 420 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>, 430 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>, 440 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>, 450 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>, 460 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>, 470 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>, 480 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>, 492 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>, 500 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>, 510 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>, 520 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>, 532 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr>, <tr><td>540 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>, 550 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>, 560 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>, 570 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>, 580 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>, 589 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>, 600 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>, 610 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>, 620 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>, 632 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>, 640 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>, 650 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>, 660 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>, 671 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>, 680 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>, 690 nm&nbsp;</td>Filtro passa-banda de interferência <td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr>Gaiola <td></td><td></td><td>de Faraday</td><td>Qualquer estrutura metálica que possa ser aterrada e que se encaixe na configuração experimental funcionará.</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio, 6X, 12X, 25X, 50X ampliação</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Qualquer estereomicroscópio servirá</td></tr><tr><td>Suporte de microscópio com braço oscilante e base pesada</td><td>Instrumentos</td><td></td> McBain <td>Qualquer base pesada com braço servirá</td></tr><tr><td>Braço</td><td></td><td></td> cardan <td>Construído sob medida, Veja <forte>Figura 4</forte></td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidade Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Para espécime de iluminação</td></tr><tr><td>Guia de luz de pescoço de ganso Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Qualquer guia de luz de pescoço de ganso servirá</td></tr><tr><td>Mesa</td><td></td><td></td><td></td>de mármore</tr><tr><td>Mesa</td><td></td><td></td> de madeira elevada <td>O furo deve ser cortado através desta mesa para que a caixa de areia possa descansar na mesa de mármore embaixo</td></tr><tr><td>Caixa de madeira cheia de areia</td><td></td><td></td><td>personalizada, qualquer caixa com areia</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estágio de amostra Fios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de clipe jacaré para aterramento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fio</td><td></td><td></td><td></td>de cobre isolado</tr><tr><td>Fio de prata, 0,125 mm de diâmetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>cabos</td> <td>BNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pré-amplificador com cabeçote</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Redutor de ruído</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscópio, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, sem sonda</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Software Labchart</td><td>Instrumentos ADI</td><td>Gráfico 5</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de pulsos de 10 MHz</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas de vidro</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borosilicados com filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td><td></td><td>de plástico com fenda</td></tr><tr><td>Cera</td><td></td><td></td><td></td>de baixa temperatura de fusão</tr><tr><td>Solda Ferro</td><td>Plataforma Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com base magnética de bola e soquete</td><td>Hama foto e vídeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aço carbono de borda dupla, lâmina de barbear quebrável</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação dos fotorreceptores celular sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; in vivo</em&gt; gravações intracelulares

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis ​​a esta configuração.

Para muitos elementos da configuração de gravação, uma descrição escrita não fornece detalhes suficientes. A Figura 1 é um esquema dos componentes envolvidos na configuração completa de gravação. Na Figura 2, os espectros são traçados para a luz branca e cada um filtro de interferência para dar um sentido de por que é necessário um factor de correcção eo que é necessário para calcular essa correção. A Figura 3 mostra fotos e um diagrama do braço Cardan que é us...

A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

O objetivo geral deste método de gravação intracelular é determinar a sensibilidade espectral de células fotorreceptoras individuais no olho composto de um inseto in vivo. Este método pode nos indicar se os comprimentos de onda de luz aos quais uma célula é sensível são afetados por pigmentos filtrantes. A principal vantagem desta técnica é que, ao conhecermos as sensibilidades espectrais de fotorreceptores individuais, podemos prever qual faixa de cores um animal é capaz de ver.Para se preparar para a gravação, ligue a lâmpada de xenônio pelo menos 45 minutos antes do experimento e ligue o puxador de microeletrodos pelo menos 30 minutos antes de puxar os eletrodos de vidro. Em seguida, ligue todos os equipamentos de gravação. Certifique-se de que o obturador esteja fechado por padrão, para que nenhuma luz passe pelo cabo de fibra óptica.Em seguida, puxe microeletrodos finos de vidro borossilicato utilizando o puxador de microeletrodos. Encha os eletrodos por trás com cloreto de potássio 3 molar. Para preparar o espécime, sob o microscópio, fixe uma borboleta individual dentro de um pequeno tubo de plástico com cera quente, de modo que a cabeça fique imóvel e projetada para fora de uma das extremidades do tubo.Em seguida, fixe a probóscide, as antenas e as asas com cera. Depois disso, pressione o abdômen com um pedaço de cera seca. Mantenha o tubo umidificado colocando um pedaço de tecido úmido dentro dele, atrás do abdômen do espécime.Certifique-se de que o espécime esteja completamente imóvel. Em seguida, fixe o tubo usando um pequeno pedaço de cera em uma plataforma pequena com junta esfero-cônica que esteja presa a uma base magnética. Sob um microscópio estereoscópico, insira um fio de prata na cabeça através da parte bucal, como eletrodo de referência.Antes do experimento, fixe permanentemente o fio à plataforma. Em seguida, corte um pequeno orifício na córnea esquerda usando uma lâmina de barbear e feche o orifício com vaselina para evitar a dessecação. Assim que a córnea for cortada, insira o eletrodo de registro no olho o mais rapidamente possível, pois o hemolinfa no olho endurecerá rapidamente, tornando impossível a inserção de um eletrodo.Se possível, realize a dissecação no equipamento onde será feita a gravação. Em seguida, conecte o fio de terra do estágio de cabeçote ao eletrodo de referência na plataforma do espécime, utilizando os clipes de jacaré. Fixe o eletrodo no suporte do eletrodo.Posteriormente, insira o fio de prata na solução de cloreto de potássio no microeletrodo. Utilize uma fonte de luz com braço flexível para iluminar o espécime sob um estereoscópio enquanto abaixa o eletrodo no olho. Ajuste o suporte do eletrodo para que o microeletrodo fique diretamente acima do orifício previamente cortado na córnea.Em seguida, abaixe o microeletrodo no olho utilizando o micromanipulador, até que um circuito seja completado. Uma vez dentro do olho, afaste o estereoscópio para fora da gaiola de Faraday. Desligue a fonte de luz que ilumina o espécime e mantenha o inseto no escuro por 10 a 20 minutos para adaptação à escuridão.Verifique a resistência do eletrodo aplicando uma corrente de um nanoampère e observando a mudança na voltagem. A resistência deve estar tipicamente na faixa entre 100 e 250 megaohms. Em seguida, ative o gerador de pulsos para emitir um flash de luz durante toda a duração do experimento e direcione o cabo de fibra óptica em direção ao olho.Verifique no osciloscópio a alteração de tensão com cada flash de luz. Uma alteração negativa na tensão indica que o eletrodo ainda não entrou na célula. Mova o cabo de fibra óptica ao redor do espécime até que seja observada uma resposta máxima de tensão.Para gerar uma resposta luminosa despolarizante, movimente o micromanipulador para frente e para trás, o que resulta em pequenos movimentos verticais do eletrodo, enquanto toca levemente na base do suporte do eletrodo ou utiliza a função de vibração no pré-amplificador. Continue fazendo pequenos ajustes até que uma resposta luminosa despolarizante apareça no osciloscópio. Em seguida, ajuste o cabo de fibra óptica para encontrar o sinal despolarizante máximo.Realize pequenos ajustes com um micromanipulador e use a função de zumbido no amplificador conforme necessário para garantir que o eletrodo esteja gravando de forma estável a célula. Um registro estável deve apresentar pouca ou nenhuma alteração no potencial de repouso, baixo ruído de fundo e uma resposta despolarizante consistentemente grande. É essencial obter um registro estável no qual o potencial de repouso da membrana não seja ruidoso e não mude ao longo do tempo.As respostas devem ser grandes e positivas, sem hiperpolarização. Uma vez que a configuração esteja estável, abra o software e feche a caixa de diálogo chamada Galeria de Experimentos para abrir uma janela pop-up com quatro canais. Ajuste a escala de tensão no canto superior direito da janela do software para 500 milivolts.Em seguida, clique em Iniciar no canto inferior direito para começar a gravação. Minimize os canais três e quatro e ajuste as escalas X e Y. Em seguida, permita que o software seja executado durante toda a duração do experimento.Para a estimulação com luz branca, registre até 10 respostas individuais, com a roda de filtros ND ajustada na densidade óptica (DO) mais alta que ainda elicie uma resposta. Aqui, a mudança na resposta é mostrada em 3,0 DO e 2,0 DO. Em seguida, registre o mesmo número de respostas de 3,5 a 0,0 DO, em todas as combinações, a fim de fornecer uma curva logarítmica de intensidade de resposta. Antes de registrar a resposta da célula a todos os comprimentos de onda utilizando os filtros de interferência, localize primeiramente rapidamente o comprimento de onda de pico.Sem nenhum filtro ND no trajeto da luz, coloque um filtro que transmite UV e observe brevemente a amplitude da resposta. Repita o procedimento com um filtro que transmite luz azul, um filtro que transmite luz verde e um filtro que transmite luz vermelha, o que deve fornecer uma ideia de onde estará a resposta de pico. Registre sob o comprimento de onda do filtro que fornece a resposta máxima antes de mudar para outro filtro de interferência.Entre as gravações com filtros subsequentes, permita que a célula responda a um ou dois flashes de luz branca sem qualquer filtro no trajeto da luz, a fim de ajudar a monitorar se a resposta de pico está se degradando ao longo do tempo. Em seguida, grave com outros filtros de interferência e permita até 10 respostas por filtro. Este é um exemplo de uma grande alteração de tensão negativa observada logo antes de entrar na célula.É mostrado aqui um registro limpo, com pouco ruído de fundo e uma grande resposta despolarizante, tipicamente de pelo menos 40 milivolts. E aqui há um exemplo de um registro ruim, devido à alteração do potencial negativo após o pico principal. Este é outro exemplo de um registro inadequado.O potencial de repouso está passando por grandes flutuações, e a grande quantidade de ruído de fundo pode obscurecer a amplitude da resposta. Este é um exemplo representativo da sensibilidade espectral derivada de uma única gravação. Os tipos celulares são classificados pela sensibilidade máxima em um comprimento de onda semelhante e pela forma geral do espectro de sensibilidade.Os mesmos tipos celulares são então médios, e a sensibilidade média é representada com barras de erro padrão em cada comprimento de onda. Este gráfico mostra as sensibilidades espectrais de três tipos celulares típicos encontrados em um inseto. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas.Após este procedimento, podem ser realizados experimentos comportamentais para determinar se todos os tipos de células fotorreceptoras contribuem ou não para a discriminação de cores.

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve o protocolo para registro eletrofisiológico da atividade fotorreceptora no olho de uma Drosophila imobilizada, permitindo a medição precisa das mudanças de voltagem em resposta a estímulos luminosos.

Registro eletrofisiológico das respostas de voltagem de fotorreceptores retinianos de Drosophila a estímulos luminosos

O vídeo demonstra o registro da atividade elétrica nos neurônios fotorreceptores do omatídio de Drosophila, estabelecendo uma configuração de célula inteira. Ele destaca a ativação de canais potenciais de receptores transitórios por pulsos de luz, resultando em solavancos quânticos mensuráveis.

Gravações de grampo de voltagem de célula inteira de fotorreceptores de Drosophila

Este vídeo demonstra o procedimento para registro intracelular in vivo de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta e determinação da sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Esta técnica permite o estudo da sensibilidade de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos.

Registro intracelular in vivo da sensibilidade espectral de células fotorreceptoras em uma borboleta

Fonte: Wagner, K. et al., Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas com eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra a visualização do tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas TRPL marcadas com eGFP. Ele detalha a preparação de moscas transgênicas para imagens, a captura de imagens de fluorescência de células fotorreceptoras e a quantificação do tráfego de TRPL medindo a...

Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Um protocolo para o estudo da dessensibilização e recuperação da sensibilidade de fotorreceptores de lagostins em função do tempo circadiano é apresentado.

Dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins após a entrega de um estímulo leve

Apresentamos um protocolo para caracterizar eletrofisilogicamente fotopigmentações bie estáveis: (i) explorando os deslocamentos de carga dentro das moléculas de fotopigment após a absorção de fótons e sua enorme quantidade nos fotorreceptores, e (ii) explorando as diferenças de absorção-espectros dos estados de fotopigmento de rhodopsina e metarhodopsina. Esses protocolos são úteis para rastrear mutações que afetam sistemas de fotopigment biestabilidade.

Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Aprenda a técnica de registro intracelular para determinar a sensibilidade espectral de fotorreceptores em olhos compostos de borboletas in vivo. Este método permite prever a capacidade de visão de cores do inseto.

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de

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