Multi-alvo Chromogenic Whole-mount In Situ Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios Drosophila Os embriões

O objetivo geral do Chromogenic Multi-target WISH é facilitar o mapeamento dos padrões de distribuição de mRNA em embriões intactos de Drosophila. Com este método, as localizações de mRNA de três genes diferentes podem ser comparadas diretamente dentro do mesmo embrião. O WISH multicolorido pode ser usado para gerar mapas de expressão gênica em organismos em desenvolvimento de maneira rápida e confiável. Isso pode fornecer pistas importantes sobre interações regulatórias genéticas, desenvolvimento ativo e embrionário ou organogênese. A principal vantagem dessa técnica é que os padrões de expressão de mRNA de diferentes genes são visualizados em cores distintas e contrastantes. Dessa forma, sites de expressão exclusivos e sobrepostos podem ser destacados com alta precisão. Usando procedimentos padrão, colete, descorione, fixe e desvitellinize os embriões necessários. Armazene-os em metanol no freezer até que sejam necessários. Agora, comece com os embriões em temperatura ambiente. Encaixe uma inserção no primeiro poço de uma placa de 12 poços e adicione dois mililitros de metanol. Transfira a quantidade desejada de embriões para o inserto que é usado para transportar os embriões durante todo o procedimento. Agora, reidrate os embriões usando incubações de três minutos em uma série decrescente de metanol. Comece com 75% de metanol em PBS. Siga com 50% de metanol em PBS-T. Em seguida, use 25% de metanol em PBS-T e termine com duas incubações em PBS-T puro. Em seguida, prefixe os embriões em 4% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Remova o fixador usando quatro lavagens em PBS-T. Durante as etapas de lavagem, descongele e prepare as soluções de trabalho para proteinase K e glicina. Após as lavagens, permeabilize os embriões em Proteinase K recém-preparada por três minutos em temperatura ambiente. Pare a reação usando duas lavagens de um minuto na glicina recém-preparada. Em seguida, fixe os embriões em 4% de paraformaldeído feito em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave o paraformaldeído com quatro lavagens em PBS-T três minutos cada. Em seguida, transfira os embriões para o tampão de pré-hibridização. Eles podem ser armazenados no freezer até que sejam necessários. Comece distribuindo os embriões em tampão pré-hi em tubos de dois mililitros. Alíquota cerca de 15 microlitros de embriões depositados em cada tubo. Agora, incubar os embriões em um 65