Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

O objetivo geral deste experimento é entender a regulação metabólica direta do ER Alpha no câncer de mama, usando dados de transcriptoma, sistroma e metaboloma em todo o genoma. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia dos nucleorreceptores e do câncer, como o papel de certos fatores de transcrição na regulação do metabolismo para contribuir para a agressividade celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma imagem global do gene e das nuances de regulação metabólica resultantes.

Demonstrando o procedimento estará Yiru Chen, um pós-doutorado do meu laboratório. Depois de cultivar células MCF7 de acordo com o protocolo de texto, colha as células adicionando um mililitro de reagente de isolamento de RNA a cada poço e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Use uma pipeta para coletar o lisado celular e transferi-lo para tubos de 1,5 mililitro.

Para isolar o RNA, adicione 200 microlitros de clorofórmio a um mililitro de lisado celular e vore por 10 segundos. Depois de incubar à temperatura ambiente durante cinco minutos, centrifugar as amostras a 16 000 x g e a quatro graus Celsius durante 15 minutos. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente a fase superior aquosa para um novo tubo.

Adicione 500 microlitros de isopropanol a 100% à fase aquosa e misture invertendo. Em seguida, incube a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Na manhã seguinte, centrifugue as amostras a 1600 x g e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Descarte o sobrenadante e adicione 750 microlitros de etanol a 70% sem RNase e faça um vórtice brevemente. Centrifugar as amostras a 6 000 x g e a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, retirar o sobrenadante e centrifugar as amostras a 16 000 x g e a quatro graus Celsius durante um minuto.

Com uma ponta de carregamento de gel, remova o etanol restante pipetando. E coloque os tubos de cabeça para baixo para secar ao ar por 10 minutos. Em seguida, adicione 20 a 50 microlitros de água DEPC para dissolver o pellet e purifique e quantifique o RNA de acordo com o protocolo de texto.

Uma vez que as células MCF7 tenham sido cultivadas de acordo com o protocolo de texto, adicione 250 microlitros de formaldeído a 16% em cinco mililitros de meio às células para reticular a cromatina e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, use cinco mililitros de 1X gelado para lavar as células e interromper a reação de reticulação. Colha as células em 250 microlitros de tampão de lise celular por placa.

Em seguida, para fragmentar a cromatina nos tamanhos necessários, sonicar as células oito vezes por 30 segundos cada a um ampere de 30. Resfrie cada amostra no gelo após cada sonicação de 30 segundos. Em seguida, depois de centrifugar as amostras a 16.000 x g e quatro graus Celsius por 10 minutos, pipetar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet no fundo.

Aplicar uma alíquota de cinco microlitros do sobrenadante a um gel de agarose a 1% e realizar eletroforese para determinar o tamanho do ADN. O comprimento ideal do fragmento deve estar entre 200 e 500 pares de bases. Para realizar a imunoprecipitação da cromatina, economize 25 microlitros do lisado celular como entrada.

Em seguida, em um tubo de 50 mililitros, misture quatro mililitros do lisado celular com 20 mililitros de tampão IP, anticorpo ER Alfa e esferas magnéticas codificadas por proteína A e proteína G. Incubar a mistura por rotação a quatro graus Celsius durante a noite, para permitir a formação de complexos cromatina-anticorpo. Depois de usar tampões de lavagem para lavar as contas, de acordo com o protocolo de texto, adicione 500 microlitros de tampão de eluição às esferas e elui o DNA em quatro tubos.

Para as amostras de entrada de DNA, eluir em 125 microlitros de tampão de eluição. Em seguida, coloque os tubos em um bloco de aquecimento e cubra-os com papel alumínio e coloque um peso por cima para evitar que se abram. Incube os tubos a 65 graus Celsius durante a noite.

Para isolar o DNA das amostras pulldown usando um kit de isolamento de DNA ChIP, resfrie os tubos em temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto isso, aqueça o tampão de eluição a 65 graus Celsius. Adicione 625 microlitros de tampão de ligação a cada tubo.

Se um precipitante se formar, adicione mais 250 microlitros de tampão de ligação até que a solução esteja límpida. Carregar a amostra na coluna e centrifugar a 16 000 x g durante 30 segundos. Em seguida, use 250 microlitros de tampão de lavagem para lavar a coluna duas vezes.

Com 15 microlitros de tampão de eluição, eluir o DNA. Combine o DNA dos quatro tubos do mesmo pulldown para chegar a 55 microlitros de DNA. Meça a concentração de DNA e realize o QPCR de acordo com o protocolo de texto.

Usando células MCF7 cultivadas de acordo com o protocolo de texto, adicione cinco mililitros de PBS 1X gelado à placa. Em seguida, incline a placa várias vezes antes de remover o PBS. Repita mais duas vezes, removendo o máximo de PBS possível após a última lavagem.

Adicione 750 microlitros de acetona pré-resfriada a cada placa e raspe as células. Em seguida, combine as células de duas placas em um tubo de dois mililitros no gelo. Para contar as células para normalização, para cada tratamento, use duas placas extras para quantificação celular.

Em seguida, para separar as células das placas, adicione dois mililitros de tampão HE e incube por cinco minutos. Misture bem as células pipetando no tampão HE. Em seguida, use 20 microlitros da solução celular em um hemocitômetro para contar o número de células ao microscópio.

Armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos antes de usar a análise de espectrometria de massa por cromatografia gasosa para identificar e quantificar os metabólitos. Realizar análise integrativa de acordo com o protocolo de texto. Esta figura mostra a integridade e a qualidade geral das amostras de RNA purificadas para um experimento de RNA-Seq.

A análise mostra que todas as amostras têm bandas nítidas e limpas de RRNAs 18S e 28S, indicando a integridade e pureza das amostras. Um número de integridade de RNA, ou RIN, de 10, indica RNA intacto. Seis representa RNA parcialmente degradado e um três indica uma amostra fortemente degradada.

Nesses experimentos, todas as amostras de RNA receberam valores de RIN entre 9,6 e 9,9. A realização de sequenciamento de taxa de transferência ultra-alta resultou em aproximadamente 18 milhões de leituras de sequenciamento de alta qualidade por amostra. Um relatório de controle de qualidade rápido representativo, que analisa a qualidade geral dos dados brutos, é mostrado aqui.

Para cada leitura, a pontuação de qualidade foi de 32 a 34 para os cinco primeiros pares de bases e de 36 a 38 de seis a 100 pares de bases. Entre 17.990.863 leituras geradas a partir dessa amostra, a maioria delas teve um índice de qualidade superior a 34. Esta figura mostra uma visão geral de cerca de 100 metabólitos representados por picos que mostram alterações nas células MCF7 devido ao tratamento com estradiol.

Os 10 principais metabólitos com alterações significativas do tratamento com E2 são apresentados nesta tabela. E esta tabela lista as vias que foram reguladas para cima e para baixo no tratamento com E2. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de prestar atenção à saúde das células e à qualidade das amostras que serão analisadas. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de exoma ou GRO-Seq, que dependem de dados de sequenciamento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identidade de MRNAs adicionais, MRNAs intensificadores ou RNAs longos não codificantes cuja transcrição é induzida por tratamentos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de receptores nucleares explorarem a regulação metabólica por receptores nucleares em sistemas de cultura de células ou em camundongos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar e integrar dados de várias abordagens ômicas. Não se esqueça de que trabalhar com Trizol, formaldeído e metanol pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual, como luvas e jalecos, devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.