Name: Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a integrar dados de transcriptoma, cistroma e metaboloma para estudar a regulação metabólica do receptor de estrogênio alfa em células MCF7 de câncer de mama.

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Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, concessão ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Departamento de Agricultura dos EUA.

1. Preparação de amostras de RNA-Seq <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Cultura das células MCF-7 em MEM melhorado (IMEM) mais meio de vermelho de fenol com calor a 10% de FBS inactivo, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C em humidificada com 5% de CO2. Nota: A mesma linha de células e condições de cultura de células é utilizado ao longo do estudo. </li><li> Semente de 100.000 células MCF7 por poço em placas de 6 poços. Tem triplicado para cada tratamento. No dia três, remover o meio e adicionar 2 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 a cada poço. Incubar as placas durante 24 h em 37 ° C em humidificada com 5% de CO2. </li><li> Para colher as células, adicionar 1 ml de reagente de isolamento de ARN (ácido tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio) para cada poço e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, recolher o reagente ligado celular por pipetagem e depósito em tubos de 1,5 ml </li></ol></li><li> Isolamento RNA <ol><li> Adicionar 200 ul chloroform para 1 ml de reagente de lisado celular (1.1.3) e agitar com vortex durante 10 seg. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo, sem perturbar as outras fases. </li><li> Adicionar 500 ul de isopropanol a 100% para um novo tubo com a fase aquosa transferida-, e misturar por inversão. Incubar a -20 ° C durante a noite. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar um sedimento no fundo do tubo. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 750 ul de ARNase isento de 70% de etanol por breve vórtice. </li><li> Centrifugar as amostras a 6000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante, e centrifuga-se a amostra a 16000 x g durante 1 min a 4 ° C para recolher todo o etanol remanescente. Remover o etanol remanescente por pipetagem com uma ponta de gel de carregamento e definir os tubos up-side para baixo para secarem naturalmente durante 10 min. Dissolver o sedimento em 20-50 DEPC água tratada ul depenDing do tamanho dos peletes. </li></ol></li><li> Purificar o RNA usando RNA kit de limpeza seguindo o protocolo 4. Medir a concentração de ARN utilizando um kit de ensaio de fluorometria com base na sequência do protocolo 9. NOTA: DO a 260 nm é feita para determinar a concentração de ARN e proporção de DO a 260 nm e 280 nm são utilizadas para determinar a pureza da amostra. Recomenda-se a verificação da qualidade RNA utilizando o ensaio Bio-analisador. </li><li> Tomar cerca de 0,5 a 1 ug de ARN purificados para sequenciação. NOTA: Centro de Biotecnologia prepara as bibliotecas de sequenciamento e executa emparelhado-end ler sequenciamento usando métodos detalhados anteriormente 2. </li></ol> 2. Preparação da amostra ChIP-Seq <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Semente 500.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. NOTA: Para cada puxar para baixo foram utilizados 16 placas. No dia 3, remover o meio e adicionar 5 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 a cadaprato. Tratar as células durante 45 min (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO 2). </li></ol></li><li> Crosslink e celular Colheita <ol><li> Adicionar 250 ul de formaldeído a 37% em 5 mL de meio para reticular cromatina, incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Pare de reticulação por lavar as células com 5 ml de gelo frio 1x MEM. </li><li> Colher as células em 250 ul de tampão de lise celular (EDTA 10 mM, Tri HCl a 50, 1% de SDS, N, óxido de 0,5% de N-dimethyldodecan-1-amina) por placa. </li></ol></li><li> A fragmentação da cromatina <ol><li> Sonicar as células durante 30 seg x 8 pelo amplificador de 30 a atingir tamanhos de cromatina necessários. Arrefecer cada amostra em gelo após uma sonicação de 30 segundos. </li><li> Centrifugar a 16, 000 xg durante 10 min a 4 ° C, e cuidadosamente pipeta o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo. </li><li> Tomar uma alíquota de 5 ul do sobrenadante e verificar o tamanho do DNA por electroforese através de 1,5% em gel de agarose como descrito anteriormente 10. O tamanho idealde ADN deverá estar entre 200-500 pb. </li></ol></li><li> imunoprecipitação da cromatina <ol><li> Economize 25 ul de lisado celular como entrada. Num tubo de 50 mL, misturar 4 ml de lisado celular com 20 ml de tampão IP (EDTA a 2 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl a 20, e 0,5% de Triton X), Anticorpo ERa (F10 500 ul e 500 ul HC- 20), e proteína e prota ProtG 500 ul revestimento de esferas magnéticas. Incubar a mistura por rotação a 4 ° C durante a noite para permitir a formação do complexo anticorpo chromatin-. </li></ol></li><li> Lavagens e Reverso-reticulação <ol><li> Usar um suporte magnético para recolher as esferas magnéticas no lado magnetizadas para remover o tampão de lavagem. </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão de lavagem I (2 mM de EDTA, 20 mM de Tris HCl, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 150 mM). Para lavar bem as esferas magnéticas, sem perturbar os complexos DNA-proteína, adicionar 25 ml de tampão de lavagem lentamente ao tubo ao longo do lado, em seguida, inverter os tubos até que todas as esferas magnéticas são bem misturado with o tampão de lavagem sem parecer como um pellet. Como uma alternativa, usar o rotador para inverter o tubo. Não vortex das amostras. Lavam-se as esferas magnéticas, utilizando o mesmo método nos passos seguintes. </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão II-lavagem (EDTA 2 mM, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 500 mM). </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão Wash-III (EDTA 1,6 mM, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate e 250 mM de LiCl). </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão 1x TE (EDTA 1 mM e Tris HCl 10 mM) duas vezes. </li><li> Elui-se o ADN em 500 ul de tampão de eluição (SDS a 1%, e NaHCO 3 10 mM) e depois atribuir a eluição de 500 ul de ADN em 4 tubos. Para o ADN a partir de entradas, eluir o DNA em 125 ul de tampão de eluição. </li><li> Incubar os tubos a 65 ° C durante a noite num bloco de aquecimento. Cubra os tubos no bloco de aquecimento com folha de alumínio para manter o calor mesmo em todos os tubos. Coloque um peso sobre os tubos para mantê-los de abertura. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Isolamento de DNA <ol><li> Arrefecer os tubos à TA durante 5 min. Isolar o DNA dos puxar para baixo amostras utilizando o kit de isolamento de DNA Chip. Siga as instruções do fabricante. <ol><li> Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação a cada tubo. Se os precipitado, adicionar outro tampão de ligação 250 ul até que a solução é clara. </li><li> Carregar a amostra na coluna e centrifugar a 16000 xg durante 30 seg. Lavar a amostra com 250 mL de tampão de lavagem. Lembre-se de adicionar etanol para o tampão de lavagem quando a primeira hora de usá-lo. Repetir a lavagem. </li><li> Elui-se o ADN em 15 ul de tampão de eluição. Combine o DNA da mesma puxar para baixo a partir de 4 tubos para atingir cerca de 55 ADN ul. </li></ol></li><li> Isolar o DNA de entrada usando um Kit de Purificação de DNA. <ol><li> Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação em cada tubo e incubar durante 10 min. Carregar a amostra na coluna de 2 ml em collectino tubo. </li><li> Lava-se a amostra com 750 ul de tampão de lavagem, centrifugar a 16000 xg durante 1 min. Repetir a centrifugação para remover qualquer tampão restante. Elui-se o ADN em 30 ul de EB. </li></ol></li><li> Medir a concentração de DNA Usando um comercial Fluorocromo Ensaio com Modificação 11. <ol><li> Diluir o tampão 20x em TE 1X TE como o tampão de ensaio para diluir as amostras de ADN e reagentes. Aqui 5 ul de DNA isolada e diluir com 50 ul em TE 1X. </li><li> A partir de solução de estoque / ml de DNA de 2 ug fazer um padrão de ADN que vão desde branco para 1, 10, 100, 1000 ug / ml. Numa placa de 96 poços, alocar 25 ul de cada padrão, bem como diluição em duplicado de DNA. (Triplicate para o padrão é recomendado.) </li><li> Prepara-se o reagente de trabalho, fazendo uma diluição de 200 vezes de reagente de dsDNA em tampão 1x TE em tubos de plástico. Cubra a solução reagente de trabalho com papel alumínio para evitar a luz. Adicionar 200 mL de reagente de trabalho em cada amostra. DentroCubate à temperatura ambiente durante 5 min. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a luz. </li><li> Medir a fluorescência das amostras utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação a 480 nm, emissão 520 nm). Gerar a curva padrão de ADN de fluorescência em função da concentração de ADN. Determinar as concentrações das amostras com base na curva padrão de ADN gerada. </li></ol></li></ol></li><li> Verificação da Experiência chip, utilizando qPCR <ol><li> Tome 2 ul isoladas DNA e diluído em 20 mL de água. Configurar a reação qPCR em triplicado pela mistura de 2,5 diluição ul DNA, 5 jul Green I PCR master mix, 1 ul primer, e 1,5 mL de água livre de nuclease. </li><li> Executar o qPCR com o sistema rápido PCR em tempo real utilizando o seguinte programa: Passo 1: 95 ° C durante 60 seg, Passo 2: 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 60 seg, repita a etapa 2 39 vezes. </li></ol></li><li> Enviar amostra de DNA de 10 ng do centro Biotech para a sequenciação. NOTA: A Biotech centro prepara o DNA ChIP em bibliotecas de acordo com a instrução, e realiza sequenciamento single-lidos usando métodos detalhados anteriormente 2. </li></ol> 3. Metabolomics Ensaio Preparação de Amostras <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Semente 400.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. Para cada tratamento preparar três amostras. Use duas placas em cada amostra para receber células suficientes para a detecção. No dia três, remover o meio e adicionam-se 5 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 às células. Tratar as células durante 24 h (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO 2). </li></ol></li><li> Coleta de Amostras <ol><li> Adicionar 5 ml gelada 1x PBS para o prato, aspirar o PBS depois inclinando brevemente a placa várias vezes. Repita duas vezes, e remover tanto quanto possível PBS após a última lavagem. </li><li> Adicionar 750 ul de acetona pré-frio a cada placa e raspar as células. Combinam-se as células em acetona a partir de duas placas empara um tubo de 2 mL em gelo. </li><li> contagem de células para a normalização <ol><li> Para cada tratamento, usar duas placas extras para quantificação de células. Para de-anexar as células da placa, adicionar 2 ml de HE tampão (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% de NaHCO3, e EDTA 1 mM) em cada placa e incubar por 5 min. </li><li> Recolha e misturar bem as células por pipetagem de células no tampão de HE. Utilize total de solução de células ul 20 para contar o número de células usando um hemocitômetro. </li></ol></li></ol></li><li> Armazenar as amostras a -80 ° C antes de a enviar para o centro de Metabolómica para identificar e quantificar os metabolitos usando análise por espectrometria de massa por cromatograf ia gasosa (GC-MS). </li></ol> 4. Análise integrativa <ol><li> ARN-SEQ de Análise de Dados: <ol><li> Faça a verificação da qualidade dos arquivos FASTQ usando FastQC: Leia QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Selecione FastQC: Leia sob a ferramenta de NGS: QC e manipulação. Faça o upload do arquivo de dados brutos de histor atualy. NOTA: Recomenda-se para dar um título para o arquivo de saída para lembrá-lo que o trabalho foi para uma vez que pode haver várias saídas. </li></ol></li><li> Executar e o arquivo de saída aparecerá sob a História. Repita o mesmo procedimento para cada arquivo sequência. adaptadores guarnição usando clip sob NGS: FASTX Toolkit. </li><li> Alinhar lê para hg19 usando Tophat2 com anotação da referência RefSeq genoma 12 (valores padrão). <ol><li> Selecione Tophat2 sob ferramenta de NGS: análise de RNA. Indique a biblioteca emparelhado tipo (single-end vs emparelhado-end). </li><li> Faça o upload do arquivo de entrada FASTQ da história atual. Selecione o genoma de referência. Escolha configurações padrão. Ou utilize a lista de parâmetros completa para modificar. </li><li> Executar e ele vai produzir dois arquivos de saída: uma é UCSC trilha leito de entroncamentos; outro é uma lista de alinhamentos de leitura em formato BAM. </li></ol></li><li> Fazer upload de arquivos BAM ao seqüenciamento ferramenta de análise de dados. Calcular os valores de expressão utilizando QuantFerramenta ification. </li><li> Identificar genes diferencialmente up-regulamentados usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança&gt; 2 e valor de p &lt;0,05. Da mesma forma, identificar os genes diferencialmente regulada para baixo usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança &lt;0,5 e valor de p &lt;0,05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Análise de Dados: <ol><li> Alinhar FASTQ Lê até o hg19 usando Bowtie2 13 (valores padrão) no Galaxy. <ol><li> Selecione Bowtie2 sob a ferramenta de NSC: Mapping. Verifique se a biblioteca é emparelhado-mate (single-end vs emparelhado-end). O upload do arquivo FASTQ da história atual. </li><li> Selecione o genoma de referência. Use os parâmetros predefinidos. Executar e que irá produzir arquivo de saída com a sequência mapeada lê como arquivo BAM. Repita o procedimento para cada arquivo sequência. </li></ol></li><li> Identificar picos usando MACS 14 um p-valor de corte de 6.0E-7 e FDR de 0,01, conforme descrito anteriormente 2. </li></ol&gt; </li><li> Metabolómica Análise de Dados: <ol><li> Converter nomes químicos dos metabolitos para KEGG_IDs. </li><li> Identificar metabolitos regulados diferencialmente comparando os níveis detectados em Veículo vs. E2 amostras tratadas (um de 2 vezes de corte foi utilizada neste estudo). </li></ol></li><li> Análise integrativa: <ol><li> Identificar genes que têm sítios de ligação ERa utilizando a ferramenta de análise de dados de sequenciamento. Traduzir Regiões a função de genes utilizando 20 kb como a distância de corte. </li><li> Identificar genes diferencialmente cima e para baixo-regulado de análise de dados RNA-Seq usando mudança vezes&gt; 2 e dobre mudança &lt;0,5, respectivamente, com o valor de p &lt;0,05 como cortadas. Compare com a lista de ERa local de ligação contendo genes utilizando comparação diagrama de Venn. </li><li> Use esta lista para identificar E2 vias metabólicas modulados usando Metscape 15 módulo de Cytoscape. <ol><li> Ao selecionar módulo Metscape a partir de aplicativos, escolha Construir rede e depois via-basopção ed. </li><li> Selecione o organismo (humano). Selecione o arquivo de dados de E2 lista composto regulamentada (KEGG ID), bem E2 lista gene-regulada. </li><li> Escolha Composto -Reaction -Enzyme-Gene como o tipo de rede. Escolha compostos / genes como a consulta. </li><li> Construir uma rede. Repita usando o E2 composto e genes regulados negativamente. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Universidade de Illinois recebeu uma subvenção de Investigator iniciada a partir de Pfizer Inc. ZME e YCZ recebeu apoio salarial a partir desta concessão.

Neste trabalho, nós descrevemos geração e análise integrativa da RNA-Seq, Chip-Seq e os dados de metabolômica de células MCF-7 que são tratadas com E2. Desenvolvemos um conjunto de protocolos strategizing para utilizar os métodos mais eficientes e usuário soft wares amigáveis ​​que produzem descoberta biologicamente relevante. Para o nosso conhecimento, o nosso é o primeiro estudo para integrar -ómicas dados de três diferentes análises e identificadas novas vias metabólicas que ERa diretamente regulados em células de câ...

Os estrogênios são importantes reguladores de muitos processos fisiológicos em ambos os sexos, incluindo tecidos reprodutivos, tecidos metabólicos, cérebro e ossos 1. Em adição aos efeitos benéficos nestes tecidos, os estrogénios também conduzir cancros que surgem da mama e tecidos reprodutivos. Estrógenos trabalhar principalmente através ERs para induzir efeitos específicos do tipo de célula. sequenciamento profundo de transcritos regulados por ERa usando RNA-Seq e de todo o genoma DNA ERa análise de sítios de ligação usando o chip-Seq provou ser útil para entender como ERa trabalha em diferentes tecidos e tipos de câncer que surgem a partir deles. Nós e outros publicaram perfis da expressão de genes associados com receptores diferentes (ERa vs ERP) 2,3, diferentes ligantes 3-5 e diferentes coregulators 2,4,6,7. RNA-Seq é o principal método para analisar o transcriptoma, oferecendo maior precisão e eficiência em comparação com ba microarrayanálise de expressão gênica sed 8. ARN obtido a partir de linhas celulares de 2-4,7, tecidos ou amostras de tumor são sequenciados, mapeados para montagens genómico disponíveis e genes diferencialmente regulados são identificados. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é empregada para dissecar o fator de transcrição e coregulator ligação a locais de ligação reguladoras conhecidas cromatina. ChIP-Seq (CHIP seguido de alta sequenciamento rendimento) fornece detecção imparcial de sítios de ligação globais. Metabolômica é uma outra abordagem da biologia sistema cada vez mais usado, que mede quantitativamente, a resposta multiparamétrico dinâmica dos sistemas vivos a vários estímulos, incluindo produtos químicos e perturbações genéticas. Ao realizar perfil metabólico global, uma leitura funcional pode ser obtido a partir de células, tecidos e sangue. Além disso, as informações a partir de experimentos transcriptoma nem sempre refletem mudanças reais no nível de enzimas que contribuem para vias bioquímicas. Combinadoanálise de dados de transcriptoma e metaboloma nos permite identificar e correlacionar mudanças na expressão gênica com alterações de metabolitos reais. Aproveitando a informação de todos esses conjuntos de dados de grande escala fornecer os detalhes mecanicistas para compreender o papel de fatores de transcrição que regulam sistemas biológicos complexos, especialmente os que dizem respeito ao desenvolvimento humano e doenças como câncer e diabetes. A natureza complexa do genoma dos mamíferos torna difícil para integrar e totalmente interpretar os dados obtidos a partir do transcriptoma, cistrome e metaboloma experimentos. Identificar eventos de ligação funcionais que levariam a alterações na expressão de genes-alvo é importante porque os locais de ligação, uma vez funcionais são identificados; análise subsequente, incluindo transcrição de ligação (TF) análise motivo, pode ser realizado com maior precisão. Isto leva à identificação de cascatas TF biologicamente significativas e mecanismos. comparis também diretosem experimentos de RNA-Seq e chip-Seq nem sempre são possíveis desde que os dados de cada experimento têm diferentes escalas e ruídos e, em alguns casos, sinais significativos são obscurecidos pelo ruído população. Não temos conhecimento de qualquer estudo que integrou informações dessas três abordagens independentes, mas relacionados para entender a regulação metabólica direta por ERa no cancro da mama. Portanto, nosso objetivo geral neste trabalho é relacionar eventos de ligação produtivas para a expressão do gene e alterações de metabolitos. Para atingir este objetivo, integrada dados de RNA-Seq, Chip-seq e metabolômica experiências e identificou aqueles estrogênio induzida ERa eventos que levariam a mudanças de expressão de genes em vias metabólicas vinculativo. Pela primeira vez, nós fornecemos um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolômica perfis e executar a análise integrada dos dados para descobrir circuitos novo gene que regulam o metabolismo da mamalinhas celulares de cancro.

<table><tbody><tr><td>Mistura de Triglicerídeos</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Ácido Oleico-Pó Solúvel em Água&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias de vida útil do reagente TRIzol</td><td></td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&nbsp;</td>Kit de Purificação PCR <td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick QIAGEN</td><td></td><td>28106</td><td>Isolamento de DNA da amostra de entrada&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de isolamento ZYMO ChIP-DNA&nbsp;</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Limpo & Concentrador</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf; PicoGreen&uml; Kit de Ensaio dsDNA</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de DNase livre de RNase</td> de quantificação de DNA <td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Purificação de RNA</td></tr><tr><td>DEPC Água tratada&nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Modelo Livre</td></tr><tr><td>120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB120110</td><td>Com sonda de 1/8</td></tr><tr><td>&nbsp; Gabinete de Som Fisher</td><td>Scientific Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>Para redução de som</td></tr><tr><td>&nbsp; Eppendorf Tubos 5.0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubos (2 sacos de 100 unidades)</td></tr><tr><td>Mistura de Primer Aleatório&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Transcriptase reversa</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP160100</td><td>gel de agarose a 1,5%;</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio Qubit RNA HS</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>Q32852</td><td>Quantificação de RNA (100 ensaios)&nbsp;</td></tr><tr>Comprimidos inibidores de protease <td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td> <td>de formaldeído</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Cada comprimido é suficiente para 10 ml de tampão de lise</td></tr><tr><td>PhosSTOP PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Cada comprimido é suficiente para um tampão de lise de 10 ml</td></tr><tr><td>Kits de Ensaio Qubit Life</td><td>technologies&nbsp;</td><td>Q32850</td><td>Para 100 ensaios</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tubo Rotator&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Leitor de placas múltiplas&nbsp;</td><td>Microcentrífuga PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Suporte Magnético</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR rápido em tempo real</td><td>Ciência Aplicada&nbsp;</td><td></td><td></td>4351405</tr></tbody></table>

biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Com o advento das -ómicas se aproxima de nossa compreensão das doenças crônicas como câncer e síndrome metabólica melhorou. No entanto, a mineração eficaz da informação nas bases de dados de grande escala que são obtidas a partir de microarrays de expressão genética, experimentos de seqüenciamento profundas ou perfil metabólico é essencial para descobrir e, em seguida, efetivamente alvo os reguladores críticos de fenótipos celulares doentes. Receptor de estrogênio α (ERa) é um dos fatores mestre de transcrição que regulam os programas de genes que são importantes para estrogênio cancros da mama responsivos. A fim de compreender o papel de ERa sinalização no metabolismo do cancro da mama que utilizaram dados transcriptomic, cistromic e metabolômica de células MCF-7 tratadas com estradiol. Neste relatório nós descrevemos a geração de amostras para RNA-Seq, Chip-Seq e experiências metabolômica e análise computacional integrativa dos dados obtidos. Essa abordagem é útil em delinear nova toupeiramecanismos cular e circuitos gene regulador que são regulados por um fator de transcrição especial que impacta metabolismo das células normais ou doentes.

transcriptomics Para analisar genes diferencialmente expressos por tratamento E2, optamos por realizar um experimento RNA-Seq. Para além de fornecer informação sobre os níveis de mRNA, os dados de RNA-Seq também pode ser utilizado para monitorizar alterações na (RNAs longos não-codificantes, microRNAs) RNA não codificante e eventos de splicing alternativo. Nós não fornecem informações sobre a análise de genes não-codificantes ou RNAs transcritos alternativamente, desde âmbito do n...

A integração de dados de experimentos de sequenciamento de todo o genoma e experimentos metabolômicos é um desafio. Neste artigo, relatamos, pela primeira vez, a geração, análise e integração de dados de transcriptoma, cistrome e metaboloma de células de câncer de mama tratadas com estradiol.

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

O objetivo geral deste experimento é compreender a regulação metabólica direta do ER Alpha no câncer de mama, utilizando dados transcriptômicos, sistromáticos e metabolômicos em todo o genoma. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia de receptores nucleares e câncer, como o papel de certos fatores de transcrição na regulação do metabolismo para contribuir com a agressividade celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma visão global das sutilezas da regulação gênica e metabólica resultante.Quem demonstrará o procedimento será Yiru Chen, pesquisadora pós-doutoranda do meu laboratório. Após cultivar as células MCF7 de acordo com o protocolo descrito, colete as células adicionando um mililitro de reagente de isolamento de RNA em cada poço e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Utilize uma pipeta para coletar o lisado celular e transfira-o para tubos de 1,5 mililitro.Para isolar o RNA, adicione 200 microlitros de clorofórmio a um mililitro de lisado celular e vortexie por 10 segundos. Após incubação à temperatura ambiente por cinco minutos, centrifugue as amostras a 16.000 × g e quatro graus Celsius por 15 minutos. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo.Adicione 500 microlitros de isopropanol a 100% à fase aquosa e misture invertendo o tubo. Em seguida, incube a menos 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, centrifugue as amostras a 1600 × g e 4 graus Celsius por 10 minutos.Descarte o sobrenadante e adicione 750 microlitros de etanol a 70% livre de RNase, e vortex brevemente. Centrifugue as amostras a 6.000 × g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e centrifugue as amostras a 16.000 × g e quatro graus Celsius por um minuto.Com uma ponteira para carregamento de géis, remova o etanol remanescente por pipetagem. Em seguida, coloque os tubos de cabeça para baixo e deixe secar ao ar por 10 minutos. Então, adicione de 20 a 50 microlitros de água DEPC para dissolver o precipitado e purifique e quantifique o RNA de acordo com o protocolo descrito no texto.Uma vez que as células MCF7 tenham sido cultivadas de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione 250 microlitros de formaldeído 16% em cinco mililitros de meio às células para promover a reticulação da cromatina e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, utilize cinco mililitros de tampão 1X gelado para lavar as células e interromper a reação de reticulação. Recolha as células em 250 microlitros de tampão de lise celular por placa.Em seguida, para fragmentar a cromatina aos tamanhos necessários, sonique as células oito vezes, por 30 segundos cada, com amplitude de 30. Resfrie cada amostra em gelo após cada sonicação de 30 segundos. Depois, após centrifugar as amostras a 16.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos, pipete cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet no fundo.Aplicar uma alíquota de cinco microlitros do sobrenadante em um gel de agarose a 1%, e realizar eletroforese para determinar o tamanho do DNA. O comprimento ideal do fragmento deve estar entre 200 e 500 pares de bases. Para realizar a imunoprecipitação da cromatina, reservar 25 microlitros do lisado celular como entrada.Em seguida, em um tubo de 50 mililitros, misture quatro mililitros do lisado celular com 20 mililitros de tampão IP, anticorpo ER Alpha e esferas magnéticas revestidas com proteína A e proteína G. Incube a mistura sob rotação a quatro graus Celsius durante a noite, para permitir a formação de complexos de cromatina com o anticorpo. Após lavar as esferas com tampões de lavagem, de acordo com o protocolo descrito, adicione 500 microlitros de tampão de eluição às esferas e elua o DNA em quatro tubos.Para as amostras de entrada de DNA, eluir em 125 microlitros de tampão de eluição. Em seguida, coloque os tubos em um bloco de aquecimento e cubra-os com papel alumínio, colocando um peso em cima para evitar que abram. Incube os tubos a 65 graus Celsius durante a noite.Para isolar o DNA das amostras de pulldown usando um kit de isolamento de DNA para ChIP, resfrie os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto isso, aqueça o tampão de eluição a 65 graus Celsius. Adicione 625 microlitros de tampão de ligação a cada tubo.Se um precipitado se formar, adicione mais 250 microlitros de tampão de ligação até que a solução fique clara. Carregue a amostra na coluna e centrifugue a 16.000 × g por 30 segundos. Em seguida, use 250 microlitros de tampão de lavagem para lavar a coluna duas vezes.Elua o DNA com 15 microlitros de tampão de eluição. Combine o DNA dos quatro tubos da mesma precipitação para obter 55 microlitros de DNA. Meça a concentração de DNA e realize a PCR quantitativa conforme o protocolo descrito no texto.Usando células MCF7 cultivadas de acordo com o protocolo descrito, adicione cinco mililitros de PBS 1X gelado à placa. Em seguida, incline a placa várias vezes antes de remover o PBS. Repita mais duas vezes, removendo o máximo possível de PBS após a última lavagem.Adicione 750 microlitros de acetona previamente resfriada a cada placa e raspe as células. Em seguida, combine as células de duas placas em um tubo de dois mililitros sobre gelo. Para contar as células para normalização, utilize duas placas extras por tratamento para a quantificação celular.Em seguida, para destacar as células das placas, adicione dois mililitros de tampão HE e incube por cinco minutos. Misture bem as células por pipetagem no tampão HE. Depois, utilize 20 microlitros da solução celular em um hemocitômetro para contar o número de células sob microscópio.Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius antes de utilizar a análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas para identificar e quantificar os metabólitos. Realize a análise integrativa de acordo com o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra a integridade e a qualidade geral das amostras de RNA purificadas para um experimento de RNA-Seq.A análise mostra que todas as amostras possuem bandas nítidas e definidas de RRNAs 18S e 28S, indicando a integridade e pureza das amostras. Um Número de Integridade de RNA, ou RIN, igual a 10 indica RNA intacto. O valor seis representa RNA parcialmente degradado, e o valor três indica uma amostra fortemente degradada.Nestes experimentos, todas as amostras de RNA receberam valores de RIN entre 9,6 e 9,9. A realização de sequenciamento de ultra alto rendimento resultou em aproximadamente 18 milhões de leituras de sequenciamento de alta qualidade por amostra. Um relatório representativo de controle rápido de qualidade (fast QC), que analisa a qualidade geral dos dados brutos, é mostrado aqui.Para cada leitura, a pontuação de qualidade foi de 32 a 34 para os primeiros cinco pares de bases, e de 36 a 38 do sexto ao centésimo par de bases. Dentre 17.990.863 leituras geradas a partir desta amostra, a maioria delas apresentou pontuação de qualidade superior a 34. Esta figura mostra uma visão geral de cerca de 100 metabólitos representados por picos que exibem alterações em células MCF7 devido ao tratamento com estradiol.Os 10 principais metabólitos com alterações significativas após o tratamento com E2 são apresentados nesta tabela. E esta tabela lista as vias que foram reguladas para cima e para baixo após o tratamento com E2. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma semana, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de prestar atenção à saúde das células e à qualidade das amostras que serão analisadas. Após este procedimento, outros métodos como sequenciamento de exoma ou GRO-Seq, que dependem de dados de sequenciamento, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identidade de outros RNAm, RNAm de enhancer ou RNAs não codificantes longos cuja transcrição é induzida por tratamentos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de receptores nucleares explorarem a regulação metabólica mediada por receptores nucleares em sistemas de cultura celular ou em camundongos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter um bom entendimento de como analisar e integrar dados provenientes de múltiplas abordagens ômicas. Não se esqueça de que o trabalho com Trizol, formaldeído e metanol pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, tais como luvas e jalecos de laboratório, devem sempre ser adotadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve uma técnica de preparação de amostras de células de câncer de mama para perfil de metabólitos. As células do câncer de mama são tratadas com estradiol, que se liga ao receptor de estrogênio alfa e causa alteração na composição do metabólito.

Preparação de amostras para metabolômica: um método para preparar amostras de células para perfil de metabólitos

Este vídeo descreve um ensaio repórter baseado em células para determinar a atividade estrogênica de compostos derivados de plantas. Um composto com atividade semelhante ao estrogênio imita sua ligação aos receptores de estrogênio e impulsiona a transcrição do gene da enzima repórter a jusante. A enzima repórter gera bioluminescência em uma reação, indicando a atividade estrogênica do composto.

Ensaio de atividade do receptor-repórter de estrogênio para rastrear a atividade estrogênica do fitoestrogênio

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

Clinicamente, a deficiência de estrogênio em mulheres menopáusicas pode agravar a incidência de ruptura lipídica e aterosclerose. Nós estabelecemos um modelo in vivo da deficiência do estrogen pelo ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em APOE-/- ratos. O modelo do rato é aplicável para a triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Otimizamos um receptor de estrogênio comercialmente disponível β ensaio para triagem de alimentos primatas humanos e não humanos para atividade estrogênica. Validamos este ensaio mostrando que a conhecida soja humana estrogênica registra alta, enquanto outros alimentos não mostram atividade.

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Este protocolo descreve a construção de um sistema microfisiológico in vitro para o estudo do câncer de mama usando tecido mamário humano primário com materiais fora da prateleira.

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

O presente protocolo descreve uma estratégia abrangente para avaliar a ação farmacológica e o mecanismo do salidrosídeo na inibição da proliferação e migração de células MCF-7.

Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7

Na patogénese da metástase óssea, a angiogénese é um processo crucial e, portanto, representa um alvo para imagiologia e terapia. Aqui, apresentamos um modelo do rato de site-specific metástases ósseas de câncer de mama e descrever as estratégias para não-invasiva angiogênese...

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Aprenda a integrar dados de transcriptoma, cistroma e metaboloma para estudar a regulação metabólica do receptor de estrogênio alfa em células MCF7 de câncer de mama.

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

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