Name: In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda o ensaio cometa alcalino in vivo e modificado por enzima para medir danos ao DNA em fígado de rato. Este método sensível detecta quebras de fitas e dano oxidativo em nível de célula única.

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Este trabalho foi apoiado pela Food and Drug Administration dos EUA. Reconhecemos a publicação original do estudo CPA da Elsevier BV: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Análise dose-resposta específica por sexo da genotoxicidade em ratos F344 tratados com acetato de ciproterona. Pesquisa de Mutação 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Ética declaração: Procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da FDA Centro de US / Nacional para toxicológica Research. NOTA: O desenho do estudo aqui descrito é baseado no protocolo desenvolvido pelo Centro Japonês de Validação de Métodos Alternativos (JACVAM) para a sua validação do ensaio in vivo de roedores cometa alcalino 18, e ainda mais modificada com base em recomendações da OECD TG489 19 . 1. Preparação <ol><li> preparação da lâmina <ol><li> Dissolve-se agarose de fusão normal a 1% (w / v) em tampão de fosfato (Ca 2+, Mg 2+ livre e sem vermelho de fenol), por aquecimento num forno de microondas. </li><li> Coloque a solução de agarose a 1% fundida padrão em um banho de água a 55 ° C e equilibrar a temperatura com o banho. microscópio Dip lâminas de vidro para a solução de agarose, drenar qualquer excess agarose e limpe a parte de trás das lâminas limpas. Colocar as lâminas em posição vertical sobre uma superfície plana e permitem que as lâminas secar à RT; armazenar as lâminas em local seco. </li></ol></li><li> Preparação de soluções de teste do cometa <ol><li> Preparar a solução de agarose de baixo ponto de fusão de 0,5%. Dissolver baixo ponto de fusão de agarose em tampão de fosfato (Ca 2+, Mg 2+, e sem vermelho de fenol), por aquecimento num forno de microondas. Mantenha a solução a 37-45 ° C durante a preparação da lâmina cometa; descartar qualquer solução de agarose restante depois. </li><li> Preparar tampão de lise. Adicione uma solução 100 mM de dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA dissódico, Sr. 372,24 g / mol), cloreto de sódio 2,5 M (NaCl, Sr. 58,44 g / mol), e 10 mM de tris-hidroximetil-aminometano (Tris Base, Sr. 121,14 g / mol) em água purificada, e ajustar a pH 10 com 10 uma solução de hidróxido de sódio (NaOH, Mr 40 g / mol). No dia da utilização, adicionar Triton X-100 e sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sr. 78,13 g / mol) à solução para alcançar Concentrat definitivaiões de 1% e 10%, respectivamente, e agita-se a 4-10 ° C durante pelo menos 30 min antes da utilização. </li><li> Faça tampão enzimática fresca no dia de uso. Prepara-se uma solução contendo 40 mM de ácido 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etanossulfónico (HEPES, Sr. 238,3 g / mol), cloreto de potássio 100 mM (KCl, Sr. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA dissódico, e 0,2% de albumina de soro bovino (BSA, Mr 66463 g / mol) em água purificada. Ajustar o pH a 8,0 com solução 10 N de hidróxido de potássio (KOH, 56,1 g / mol). Agita-se à temperatura ambiente e verificar dissolução completa antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma solução tampão alcalina contendo NaOH 300 mM e 1 mM de EDTA dissódico em água purificada. Agita-se a 4-10 ° C durante pelo menos 30 min antes da utilização. Medir o pH da solução antes da utilização e certificar-se de que o pH é&gt; 13. </li><li> Prepara-se uma solução de 0,4 M de Tris base em água purificada, e ajustar para pH 7,5 com ácido clorídrico (HCl, Sr. 36,46). Guardar a solução a 4-10 ° C. Isto é neutralizantes tampão. </li><li> Faça fresh tampão picados no dia de uso. Prepara-se uma solução contendo 20 mM de EDTA dissódico e DMSO a 10% em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, e sem vermelho de fenol). Armazenar em gelo até à sua utilização. </li><li> Para preparar a solução de coloração, uma solução diluída de estoque mancha fluorescente ácido nucleico com Tris-borato-EDTA (tampão TBE) a 1: 10000 (v / v). Proteger a solução da luz usando papel alumínio. Armazenar de 2-8 ° C e usar com 24 hr. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de suspensões de células isoladas de fígado de rato <ol><li> Euthanize ratos com CO métodos seguintes 2 gás recomendadas nas Diretrizes American Medical veterinários para a eutanásia de animais: 2013 Edição 20. <ol><li> Definir a taxa de fluxo de CO 2 em 2.75. Coloque o rato na câmara de eutanásia (por exemplo, frasco secador, gaiola de ratos com tampa ventilada) e ligue o CO 2, abrindo a válvula do tanque. Espere por 1,5 a 2,5 min até orato torna-se inconsciente. Aumentar o fluxo de CO 2 para a sua configuração máxima. Após cessação de respiração, deixar o rato na câmara durante cerca de 1 min para assegurar a eutanásia. Verifique eutanásia por palpação para confirmar que o rato não tem batimentos cardíacos, e beliscando os dedos do pé para determinar que o rato não retirar a membro. </li></ol></li><li> Desinfectar o cabelo-pele com etanol 70%. Abrir a cavidade abdominal e remover o fígado intacto com tesouras cirúrgicas. Após a remoção do fígado, remover o lobo lateral esquerdo do fígado restante com tesouras cirúrgicas. Coloque o lobo lateral esquerdo em uma placa de corte, e cortar dois 3-4 mm cortes transversais de espessura adjacentes usando uma lâmina descartável só fio de navalha. </li><li> Coloque uma secção transversal em papel de filtro (para evitar o enrolamento da secção), e colocar a secção em formalina a 10% tamponada neutra (NBF). Assegure-se que a proporção de NBF a 10% para o tecido é de 10: 1 ou superior. Depois de um tempo de fixação de pelo menos 72 h, Process o fígado para exame histopatológico (consulte a secção 7, abaixo). </li><li> Coloque a segunda secção transversal do fígado em 5 ml de tampão gelado picagem (secção 1.2.6) numa placa de 6 centímetros de Petri e lavar 3 vezes para remover o sangue residual. </li><li> Transferir a secção de fígado para um tubo de centrífuga de 2 ml novo contendo 1 ml de tampão de picagem gelada. Picar a secção de fígado bem enxaguada com um par de tesouras finas para libertar as células. Coe a suspensão de células através de um filtro de células 40 mm para remover todas as protuberâncias do tecido. </li><li> Colocar a suspensão de células individuais em gelo e usar-se para fazer lâminas dentro de 1 hora. Verificar a concentração de células por contagem (por exemplo, com um hemocitómetro ou contador de células electrónico) para garantir que a sua concentração é de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml. </li></ol> 3. Preparação de Comet Slides <ol><li> Misturar um volume da suspensão de célula única com 10 volumes de fusão, 37 ° C, solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% (secção 1.2.1).pipeta imediatamente 100 ul numa lâmina revestida com agarose ponto de fusão normal (seção 1.1). Imediatamente coloque uma lamela sobre a mistura de células-agarose. Fazer pelo menos 8 desliza para cada amostra. NOTA: Todas as lâminas devem ser identificados por um número ou código semelhante e sua identidade registrada, de modo que as lâminas podem ser marcados de forma cega (veja 6.2.2, abaixo). </li><li> Coloque os slides plana e fria a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Depois que o gel tem solidificado, remover suavemente as lamelas e mergulhe as lâminas em tampão de lise pré-refrigerados (ponto 1.2.2). Proteger as lâminas de luz e manter as lâminas em tampão de lise a 4 ° C a partir de 1 h (mínimo) de O / N (máximo). </li></ol> 4. Enzyme Tratamento de Comet Slides <ol><li> Remover 6 dos 8 diapositivos preparados a partir de cada amostra de tecido a partir do tampão de lise e lavá-los 3x durante 5 min cada, com tampão de enzima (secção 1.2.3) à TA. Use os restantes dois slides para o ensaio cometa alcalino without enzima-tratamento (ver 5.1, abaixo). Após a lavagem, retire o excesso de líquido por drenagem e secar as lâminas com os tecidos. </li><li> Dilui-se stocks de enzima Endo hOGG1 e III com tampão de enzima a 1: 1000 (v / v). Colocar em gelo até à sua utilização. </li><li> Aplicar 200 ul das soluções a seguir para os slides preparados a partir de cada grupo de tratamento: 200 ul de tampão de enzima sozinhos (2 slides utilizados como lâminas de referência), 200 solução ul hOGG1 (2 slides) ou 200 ul de Endo solução III (2 slides). </li><li> Coloque os slides em placas de Petri forradas com papel toalha umedecido, cobrir as lâminas com Parafilm e incubar a 37 ° C durante 45 minutos para Endo III-tratada e lâminas de referência e 30 min para slides tratados hOGG1. </li><li> Após a incubação, as lâminas enxaguar com água destilada e continuar o processamento como descrito em 5.2, abaixo. </li></ol> 5. desenrola e Eletroforese <ol><li> Para slides não tratado com enzimas, remova os slides do tampão de lise, Drenar as lâminas e lavar uma vez com tampão de neutralização frio (secção 1.2.5) durante 5 minutos para remover o detergente e os sais residuais. </li><li> Colocar as lâminas de Passos 4.5 e 5.1 aleatoriamente em um tanque de eletroforese em gel horizontal, evitando quaisquer espaços. Encha o tanque com pH&gt; 13 tampão de electroforese feita recentemente (secção 1.2.4) até que o nível do líquido cobre apenas os slides (evitar bolhas sobre a agarose e certifique-se o tanque está nivelado). Grave o pH e a temperatura no início do desenrolamento do ADN. </li><li> Deixe as lâminas permanecem no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-susceptível. </li><li> Durante o desenrolamento, o programa de fornecimento de energia para a produção de 0,7 V / cm no tanque de electroforese (V / cm = Volts dividida pela distância em centímetros entre os eléctrodos positivos e negativos). </li><li> Depois de desenrolar, pressione o botão Executar da fonte de alimentação. Se necessário, ajustar a corrente de 300 mA, aumentando ou diminuindo o nível do tampão. Mantenha thnível tampão e apenas acima da superfície das lâminas. Efectuar a electroforese a 4 ° C durante 20 min. Grave a colocação slide, a temperatura do buffer e as correntes (AMPS) no início e no final de eletroforese. NOTA: O excesso de tampão irá resultar em tensões mais baixas que podem interferir com a migração de ADN. </li><li> Após a eletroforese, neutralizar o excesso alcalino, levantando suavemente as lâminas do tanque e imersão em tampão de neutralização (ponto 1.2.5) durante 5 min. Escorra os slides e repetir mais duas vezes. </li><li> Fixar as lâminas por imersão em etanol frio a 100% durante 5 min. Permitir que as lâminas para o ar seco e coloque em uma área seca para armazenamento. </li></ol> 6. DNA Coloração, Comet visualização e análise <ol><li> coloração DNA <ol><li> Colocar as lâminas em uma bandeja de papelão ou metal e adicione 200 ml de solução de mancha de trabalho nucleico fluorescente ácido (secção 1.2.7) para cada slide e cobrir com uma lamela de vidro. Proteger os slidesluz para permitir que as lâminas se mantenham em contacto com a solução de coloração, durante pelo menos 30 minutos antes da contagem. Corar as lâminas em lotes de 20 de cada vez. </li><li> Antes de ler cada slide, suavemente apagar afastado solução de coloração excesso, tomando cuidado para não perturbar a tampa de vidro. </li></ol></li><li> Visualization cometa e Scoring <ol><li> Use uma câmera de vídeo acoplada a um microscópio de fluorescência para visualizar imagens ao vivo da lâmina cometa no monitor do computador. </li><li> Aleatoriamente escolher um campo do microscópio contendo células. Usando um mouse, selecione uma célula. Clique no centro do &quot;cabeça do cometa&quot; com o botão esquerdo do mouse. NOTA: O software de computador calcula os parâmetros de medida para a célula e adiciona os dados para um ficheiro de dados. </li><li> Marcar todas as células no campo atual (veja o passo 6.2.4), e, em seguida, usar os controles do estágio do microscópio e o vídeo na tela para encontrar um outro conjunto de células. Pontuação essas células, como descrito em 6.2.2. </li><li> Marcar o slide from direita para a esquerda e para baixo para cima. Escolha cerca de 10 campos aleatoriamente. Durante este processo, qualquer célula cometa adequado que aparece no campo de visão deve ser marcado sem viés. NOTA: Não marcar um cometa se qualquer uma das seguintes situações: 1) ele está localizado em qualquer uma das extremidades da corrediça; 2) dois ou mais cometas se sobrepõem; 3) há detritos na cauda; 4) o software não é possível diferenciar entre a cabeça e a cauda; ou 5) a coloração do núcleo e / ou cauda difere grandemente de outras cometas sobre a corrediça. NOTA: cometas com quase toda a sua fluorescência do ADN na cauda são muitas vezes referidos como cometas &quot;ouriço&quot;. cometas hedgehog não deve ser marcado, mas o número de ouriços detectados durante o placar de slides devem ser registrados e relatados como percentagem de cometas totais. </li><li> Analisar pelo menos 75 cometas por slide, leitura dois slides por órgão / tecido para obter pelo menos 150 células / cometa amostra total. Depois do número requerido de células a partir de uma corrediça tem seren marcou, o resultado é salvo como um arquivo de planilha para análise de dados mais tarde. </li></ol></li></ol> 7. Análise Histopatologia <ol><li> Depois de um mínimo de 72 horas de fixação em NBF a 10%, seguido de tecido de corte 21, rotineiramente processar e incorporar o lobo lateral esquerdo do fígado das amostras em uma parafina-cera com base em forma 22. Secção as amostras em cerca de 5 micra e recolher em lâminas de vidro. </li><li> Corar as secções com hematoxilina e eosina (H &amp; E): <ol><li> Aquece-se as lâminas com as secções de tecido de parafina numa estufa a 60 ° C durante 2 horas antes do procedimento de coloração. </li><li> Use xileno para Desparafinar os lados. Reidratar as lâminas com etanol graduado (EtOH) a uma lavagem com água da torneira em execução. </li><li> Colocar as lâminas em 450 ml de hematoxilina em 2 min e 40 seg. Lavar as lâminas com ácido (ácido acético glacial 2 ml a 450 ml de água deionizada) para 4 seg seguido de 5 min correndo lavagem com água da torneira. </li><li> Coloque o deslizouES em EtOH 450% 70 mL contendo 1 mL de hidróxido de amónio durante 2 min, seguido por água corrente da torneira de lavagem durante 2 min e 30 seg, e 70% de EtOH de lavagem para 1 min. </li><li> Incubar as lâminas com 450 ml de solução de eosina Y contendo ácido acético glacial, 4 ml, durante 3 minutos. </li><li> Desidratar as lâminas com EtOH classificados. Limpar as lâminas com xileno (três vezes 1 min cada), e mantenha slides em xileno até lamínulas são colocados sobre os slides. </li></ol></li><li> Examine os slides por microscopia de luz, os resultados recordes, e as lesões de grau não neoplásicas para a gravidade como 1 (mínima), 2 (moderada), 3 (moderada), ou 4 (marcado). NOTA: O grau de gravidade aplicada para uma lesão específica baseia-se no peso relativo do fígado, com a lesão (= mínimas &lt;1-15%; 16-35% = ligeira, moderada = 36-60%; e marcado = 61- 100%). </li></ol> 8. Análise de Dados <ol><li> O animal é considerado a unidade experimental para avaliações estatísticas. dano do ADN é expressa como% DNUm na cauda. </li><li> dano oxidativo ao DNA é calculado da seguinte forma: os slides de referência (sem tratamento enzimático) fornecer uma estimativa das rupturas dos filamentos de ADN de fundo (SB). NOTA: Os slides tratado com enzimas fornecer uma medida de rupturas dos filamentos e bases oxidadas (SB + Ox). Assumindo que uma resposta a dose linear de DNA% em cauda como uma função de danos no ADN, a partir da subtracção do SB SB + OX dá uma estimativa de quebras da cadeia de ADN a partir de purinas / pirimidinas oxidados alterados 23. </li><li> Analise% em ADN da cauda, ​​como uma função da dose por ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Dunnett para comparações de pares de respostas nos animais tratados com o controlo do veículo. NOTA: Todos os testes são uma cauda e um valor de p inferior a 0,05 é definido como o critério para a significância estatística. </li></ol>

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<li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li>
<li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases%3A+characteristics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem interesses conflitantes ou conflitantes. As informações contidas nesses materiais não são uma disseminação formal de informações pela FDA e não representam a posição ou política da agência.

Este protocolo descreve a medição simultânea tanto dos danos de ADN directa e oxidativo no fígado de rato ao nível da célula individual. O protocolo geral é aplicável a qualquer tecido a partir do qual as células individuais ou núcleos podem ser isolados com o mínimo de danos de DNA induzidos por transformação (isto é, danos no ADN induzida não pelo agente de teste, mas pelo manuseamento e processamento dos tecidos animais). Em nossa pesquisa, realizamos ensaios cometa alcalino em células da medula óssea 7...

O ensaio cometa alcalino mede rupturas dos filamentos de DNA no nível de uma única célula. As suspensões de células únicas são incorporados em agarose sobre uma lâmina de microscópio e as células lisadas para formar nucleoids, que contêm circuitos de super-enrolados ADN. Eletroforese em pH&gt; 13 resulta na perda de supercoiling em loops de DNA contendo quebras de fita, com os fios libertados de DNA migram para o ânodo, a criação de estruturas semelhantes a cometas que podem ser observados por microscopia de fluorescência. ADN fragmentado migra a partir da &quot;cabeça&quot; do cometa na &quot;cauda&quot; com base no tamanho do fragmento, e a fluorescência relativa da cauda do cometa em comparação com a intensidade total (cabeça e cauda) pode ser utilizado para quantificar a quebra do ADN 1 , 2. O ensaio é simples, sensível, versátil, rápido, e relativamente barato 1. A detecção de ADN fragmentado causada por agentes que danificam o DNA é usado um ensaio para quantificar os danos no DNA em células ou isolado a partir de núcleos inditecidos duplos de animais tratados com o material potencialmente genotóxico (s). Devido às suas vantagens, o ensaio cometa in vivo é recomendada como um segundo ensaio in vivo genotoxicidade (emparelhado com o ensaio de micronúcleos in vivo) para a realização de avaliações de segurança de produtos no actual Conferência Internacional de Harmonização (ICH) 3 e Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA ) 4 diretrizes regulamentares. Em nosso laboratório, nós empregamos o ensaio para avaliar danos DNA vivo induzida por ingredientes alimentares, produtos farmacêuticos e nanomateriais 5-10. fígado de rato vai ser utilizado como exemplo neste protocolo, mas o ensaio de cometa pode ser realizado com outros tecidos / órgãos de animais experimentais, desde que as células individuais podem ser isoladas intactas a partir do tecido. Certos tipos de danos no DNA são difíceis de detectar, como rupturas dos filamentos de DNA sem modificar o ensaio cometa alcalino básico. No caso de dano oxidativo ao DNA, costa breaks podem ser criados em lesões oxidativas em ADN por digestão com enzimas de reparação, tais como humano 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilase 1 (hOGG1, que cria intervalos de 8-oxoguanina (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. além disso, endonuclease III (Endo III) cria intervalos principalmente em pirimidinas oxidados 1. Assim, a adição de um passo de digestão enzimática torna o ensaio de um método específico e sensível para medir lesões oxidativas do ADN in vivo 12. Utilizando estes ensaios, que demonstraram lesões oxidativas do ADN induzida por agente tóxico no fígado de ratos e ratinhos de 6-8 e no coração de ratos 10. O ensaio cometa alcalino tem muitas aplicações em toxicologia genética e biomonitorização humana: 1) como um follow-up ensaio in vivo para genotoxinas identificadas pela sensível in vitro testa 3,13, 2) para avaliar mecanismos de dano ao DNA induzido xenobióticos em vários tecidos 14, 3) para investigar se acancerígena funciona utilizando um modo não-genotóxica de ação (MOA) 7 genotóxicos ou, 4) para avaliar DNA reparação de danos 15, 5) para investigar doenças humanas e exposições ocupacionais 16, e 6) como um potencial ensaio de rastreio de alto rendimento para -órgão específico genotoxicidade 17.

<table><tbody><tr><td>Lamínulas (Nº 1, 24 x 50 mm)&nbsp;</td>Lâminas de Microscópio <td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr> Dimetilsulfóxido (DMSO) <tr><td></td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Dissódico</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Hanks Solução salina balanceada (HBSS) (Ca2+, Mg2+ livre)</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão Agarose ( LMP)</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG Agarose</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)&nbsp;</td><td>Tiras</td> de papel de teste de pH Fisher <td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>(pH 7.5-14)</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>etiquetas deslizantes (0.94 x 0.5 in.)</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade; Ouro&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td>Base <td>Trizma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>da Fisher</td>Tubos de microcentrífuga <td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml</td> Filtro de células <td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>(40 &micro; m)</td> <td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Endonuclease III (Nth)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0241S</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr></tbody></table>

in vivo alkaline ensaio cometa e enzyme-modificado alkaline comet ensaio para medição breaks dna strand e dano oxidativo ao dna em rat liver

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Danos ao DNA não reparados podem levar à instabilidade genética, o que, por sua vez, pode aumentar o desenvolvimento do câncer. Portanto, identificar potenciais agentes prejudiciais ao DNA é importante para proteger a saúde pública. O ensaio de cometa alcalino in vivo, que detecta danos ao DNA à medida que quebras de fita, é especialmente relevante para avaliar os riscos genotóxicos dos xenobióticos, pois suas respostas refletem a absorção in vivo, distribuição tecidual, metabolismo e excreção (ADME) de produtos químicos, bem como o processo de reparo do DNA. Comparado a outros ensaios de danos ao DNA in vivo, o ensaio é rápido, sensível, visual e barato e, ao converter o dano oxidativo ao DNA em quebras de fita usando enzimas de reparo específicas, o ensaio pode medir o dano oxidativo ao DNA de maneira eficiente e relativamente livre de artefatos. A medição de danos ao DNA com o ensaio cometa pode ser realizada usando projetos de estudo toxicológico agudo e subcrônico e, ao integrar o ensaio cometa com outras avaliações toxicológicas, o ensaio atende aos requisitos de bem-estar animal, fazendo o máximo uso dos recursos animais. Outra grande vantagem dos ensaios é que eles requerem apenas uma pequena quantidade de células, e as células não precisam ser derivadas de populações de células em proliferação. Os ensaios também podem ser realizados com uma variedade de amostras humanas obtidas de indivíduos expostos clínica ou ocupacionalmente.

O ensaio cometa alcalina in vivo foi realizada em conjunto com o ensaio cometa modificado por enzima para medir tanto o dano oxidativo directa de ADN e no fígado dos ratos tratados com o acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA é um fármaco hormonal sintética que induz tumores de fígado de rato de uma forma dependente do sexo, com cinco vezes doses mais elevadas necessárias para induzir tumores do fígado em ratos machos em comparação com as fêmeas 24. Nós descob...

O ensaio de cometa alcalino mede quebras de fita de DNA em células eucarióticas. Ao adicionar uma etapa de digestão de endonuclease III ou 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilase humana, o ensaio pode detectar com eficiência danos oxidativos ao DNA. Descrevemos métodos para usar esses ensaios para detectar danos ao DNA no fígado de ratos.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

O objetivo geral do ensaio cometa alcalino in vivo e do ensaio cometa alcalino modificado por enzima é medir simultaneamente danos diretos e oxidativos ao DNA no nível de célula única. Este método foi inicialmente proposto como uma ferramenta regulatória para análise de segurança de produtos regulados pela FDA. Ele pode ajudar a responder questões fundamentais em áreas que vão desde a avaliação regulatória de segurança até a epidemiologia molecular e a pesquisa básica sobre câncer.Esta técnica é sensível e versátil, além de ser relativamente econômica. É capaz de detectar danos no DNA em praticamente qualquer tecido animal. Geralmente, sabe-se que este método enfrenta dificuldades para preparar rapidamente suspensões de células isoladas a partir de diversos tecidos, o que pode ser um desafio.A demonstração visual deste método é essencial porque exige uma certa dose de arte, além de ciência. Após a eutanásia dos ratos com gás dióxido de carbono, de acordo com o protocolo descrito, palpe para confirmar que o rato não possui batimento cardíaco e pinça os dedos dos pés para verificar se o animal não retrai a pata. Use etanol para desinfetar a pele, em seguida utilize tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal, antes de remover o fígado intacto.Com uma tesoura, separe o lobo lateral esquerdo do restante do órgão e coloque-o sobre uma tábua de corte. Em seguida, utilizando uma lâmina de barbear descartável de bordo único, corte duas seções transversais adjacentes com espessura de 3 a 4 milímetros. Coloque uma seção transversal sobre papel filtro e, depois, em formalina tamponada neutra a 10%, ou FBN.Coloque a segunda seção do fígado em cinco mililitros de tampão de picagem gelado em uma placa de Petri de seis centímetros e lave três vezes para remover o sangue residual. Em seguida, transfira a seção do fígado para um novo tubo cônico de dois mililitros, contendo um mililitro de tampão de picagem gelado. Com tesoura fina, pique a seção para liberar as células e, em seguida, filtre a suspensão celular por uma peneira celular de 40 micrômetros para remover eventuais coágulos de tecido.Coloque a suspensão de células isoladas no gelo e, com um hemocitômetro, verifique se a concentração é aproximadamente duas vezes 10 à sexta células por mililitro. Para preparar lâminas de cometa, misture um volume da suspensão de células isoladas com 10 volumes de solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% a 37 graus Celsius. Pipete imediatamente 100 microlitros sobre uma lâmina previamente revestida com agarose e use uma lamínula para cobrir a mistura de células em agarose.Coloque as lâminas em posição horizontal e resfrie a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a gelificação, remova cuidadosamente as lamínulas e mergulhe as lâminas em tampão de lise pré-resfriado. Incube no escuro a quatro graus Celsius por uma hora até a noite seguinte.Após a incubação, remova seis das oito lâminas preparadas para cada amostra de tecido do tampão de lise e use o tampão enzimático em temperatura ambiente para lavá-las três vezes, durante cinco minutos cada. Em seguida, use tecidos para absorver a solução em excesso. Depois, use o tampão enzimático para diluir os estoques das enzimas hOGG1 e Endo III em uma proporção de um para mil e coloque-os no gelo.Coloque as lâminas em placas de Petri forradas com toalhas de papel umedecidas e, em seguida, aplique 200 microlitros das seguintes soluções sobre as lâminas em cada grupo de tratamento. Adicione apenas o tampão enzimático em duas lâminas, solução de hOGG1 em duas lâminas e solução de Endo III em duas lâminas, e cubra as lâminas com Parafilm. Em seguida, coloque as lâminas a 37 graus Celsius, incubando as lâminas tratadas com Endo III e as lâminas de referência por 45 minutos, e as lâminas tratadas com hOGG1 por 30 minutos.Após a incubação, drenar as lâminas e, para as lâminas de referência, utilizar tampão de neutralização frio para remover o detergente e os sais residuais. Em seguida, lavar as lâminas tratadas com enzima com água destilada. Colocar aleatoriamente as lâminas em um tanque de eletroforese horizontal em gel, evitando espaços vazios.Em seguida, adicione tampão fresco de eletroforese ao tanque, evitando bolhas, até que cubra levemente as lâminas. Ajuste a fonte de alimentação para 0,7 volts por centímetro e incube as lâminas no tampão alcalino por 20 minutos, para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcali-lábeis. Registre a posição das lâminas, a temperatura do tampão e a corrente elétrica.Após a incubação para desenrolamento, coloque o tanque de eletroforese a quatro graus Celsius. Em seguida, pressione o botão Executar na fonte de alimentação e, se necessário, ajuste a corrente para 300 miliampères elevando ou reduzindo o nível do tampão, mantendo-o logo acima das lâminas. Execute as amostras por 20 minutos, antes de novamente registrar a posição das lâminas, a temperatura do tampão e a corrente.Após a eletroforese, levante cuidadosamente as lâminas do tanque e mergulhe-as em um tampão de neutralização para neutralizar o excesso de álcali. Em seguida, escorra as lâminas e repita a neutralização mais duas vezes. Fixe as lâminas com etanol a 100% frio durante cinco minutos.Deixe as lâminas secarem ao ar e armazene em um ambiente seco. Para corar o DNA, coloque as lâminas sobre uma bandeja de papelão ou metal e adicione 200 microlitros da solução de trabalho do corante fluorescente de ácidos nucleicos em cada lâmina, antes de cobrir com uma lamínula. Proteja as lâminas da luz e incube por pelo menos 30 minutos.Em seguida, para ler as lâminas, remova suavemente com absorção o excesso de solução corante, tomando cuidado para não perturbar o lamínula. Depois, coloque a lâmina de cometa na platina de um microscópio de fluorescência equipado com câmera de vídeo e escolha aleatoriamente um campo contendo células. Após abrir o software de ensaio de cometa, use o mouse para selecionar uma célula e, em seguida, clique com o botão esquerdo no centro da cabeça do cometa da célula.O software calculará os parâmetros para a célula e os adicionará a um arquivo de dados. Depois que todas as células tiverem sido pontuadas no campo atual, passe para outro campo e repita a pontuação de qualquer célula cometa adequada que apareça, sem viés. Analise 10 campos aleatórios e pelo menos 75 cometas por lâmina.Por fim, salve os dados em uma planilha para análise posterior. Conforme relatado anteriormente, a CPA é uma droga hormonal sintética que induz tumores hepáticos em ratos de maneira específica ao sexo, exigindo doses cinco vezes maiores para induzir tumores hepáticos em ratos machos, em comparação com fêmeas. Como mostrado aqui, o ensaio cometa alcalino in vivo e o ensaio cometa modificado com enzima demonstraram que uma dose cinco vezes maior de CPA foi necessária para induzir um aumento significativo nos danos ao DNA em fígados de machos, em comparação com fêmeas.A hidroxiesteroide sulfotransferase, ou HST, é expressa em níveis 15 vezes mais altos em ratas adultas, comparado aos machos adultos. O metabolismo da HST é uma etapa limitante na ativação do CPA em metabólitos que se ligam ao DNA. Como visto aqui, o dano oxidativo ao DNA induzido pelo CPA foi geralmente maior no fígado de ratos machos em comparação com fêmeas, e, portanto, é menos provável que seja limitante na formação de tumores em ratos machos.Conforme relatado nestas tabelas, a avaliação histopatológica de fígados de ratos tratados com CPA não mostrou evidência de apoptose ou necrose induzida pelo agente, confirmando conclusões anteriores de que os resultados positivos no ensaio cometa não foram um efeito secundário da citotoxicidade. Durante a realização deste procedimento, é importante coletar uma suspensão de células únicas e preparar as lâminas para o ensaio cometa o mais rapidamente possível. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de toxicologia genética explorarem quantitativamente danos ao DNA e seu reparo em praticamente qualquer tecido animal e também em amostras humanas.Após assistir a este vídeo, esperamos que você possa ter uma melhor compreensão de como utilizar o ensaio cometa alcalino in vivo juntamente com o ensaio cometa modificado por enzima, para medir simultaneamente quebras na fita de DNA e danos oxidativos ao DNA, no nível de célula única em tecidos de animais. Lembre-se de que o trabalho com reagentes que causam danos ao DNA pode ser extremamente perigoso. Use sempre os equipamentos de proteção individual ao realizar estes procedimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de eletroforese alcalina de célula única para quantificar quebras de DNA de fita simples e dupla em células tratadas com doxorrubicina. As condições alcalinas interrompem as ligações de hidrogênio entre os pares de bases do DNA, resultando no desenrolamento completo e na separação das fitas de DNA. Isso permite a migração diferencial de fragmentos de DNA não danificados e danificados em gel de agarose após eletroforese, revelando uma estrutura em forma de...

Eletroforese alcalina em gel de célula única: uma técnica sensível para estimativa quantitativa de danos ao DNA em células cancerígenas individuais após quimioterapia

O vídeo demonstra o ensaio cometa para detectar danos ao DNA após a exposição a agentes nocivos. Sob condições alcalinas, o DNA se desenrola e desnatura e, após a eletroforese, o DNA não danificado e danificado migra de maneira diferente no gel de agarose, formando uma estrutura em forma de cometa. O DNA não danificado de migração lenta forma a cabeça circular do cometa, enquanto os fragmentos de DNA danificados de migração rápida formam a cauda alongada do cometa.

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Um protocolo para avaliar alterações nos níveis de dano ao DNA e na capacidade de reparo do DNA que podem ser induzidas por irradiação crônica in vivo de baixa dose em linfócitos do baço de camundongo, medindo a histona fosforilada H2AX, um marcador de quebras de fita dupla de DNA, usando citometria de fluxo é apresentado.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

Aqui descrevemos duas modificações do ensaio de fibra de DNA para investigar lacunas de DNA de uma única vez na replicação do DNA após indução da lesão. O ensaio de fibra S1 permite a detecção de lacunas pós-replicativas usando a endonuclease S1 específica do SSDNA, enquanto o ensaio de preenchimento de lacunas permite visualização e quantificação do reparo de lacunas.

Detecção de acumulação e reparo de lacunas pós-replicativas em células humanas usando o ensaio de fibra de DNA

O ensaio de cometa é um meio popular de detectar danos ao DNA. Este estudo descreve uma abordagem para a execução de lâminas em variantes representativas do ensaio do cometa. Essa abordagem aumentou significativamente o número de amostras, diminuindo o tempo de execução do ensaio, o número de manipulações de lâminas e o risco de danos aos géis.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Aprenda o ensaio cometa alcalino in vivo e modificado por enzima para medir danos ao DNA em fígado de rato. Este método sensível detecta quebras de fitas e dano oxidativo em nível de célula única.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver (Vídeo) | JoVE Journal

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

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