Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

O objetivo geral deste procedimento é amplificar os locais de integração retroviral do DNA genômico em massa e sequenciar a biblioteca de DNA resultante, de modo que locais de integração precisos possam ser mapeados para um genoma de referência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em retrovirologia básica e clínica, analisando a distribuição de locais de integração em todo o genoma de um hospedeiro. A principal vantagem dessa técnica é a profundidade do sequenciamento de DNA e o fato de que muitas amostras podem ser multiplexadas em uma execução de sequenciamento.

Um dia antes da transfecção, coloque 3,3 vezes 10 elevado ao sexto HEK293T células em 10 mililitros de meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado em cada um dos cinco pratos de 100 milímetros. No dia seguinte, use reagentes de transfecção disponíveis comercialmente ou fosfato de cálcio para transfectar as células com 10 microgramas de plasmídeo carregando clones moleculares retrovirais de comprimento total ou nove microgramas de vetores redondos únicos elididos envelopados mais um micrograma de uma construção de expressão VSV-G. Adicione a mistura à mídia celular gota a gota.

Após a transfecção, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após aproximadamente 48 horas, colher o meio celular contendo vírus usando uma pipeta volumétrica e passá-lo por um filtro de 0,45 mícron por fluxo de gravidade. Em seguida, concentrar o vírus por ultracentrifugação a 200.000 Gs por uma hora a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante até que restem aproximadamente 500 microlitros de DMEM FPS e ressuspenda o pellet do vírus. Adicione 20 unidades de DNase e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Determine a concentração de p24 usando um kit de captura de antígeno p24 do HIV-1 de acordo com as instruções do fabricante.

No dia anterior à infecção, coloque 3,0 vezes 10 elevado ao quinto HEK293T células em 2,5 mililitros de DMEM FPS por poço em uma placa de seis poços e incube durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos. Infectar as células com uma concentração viral final de p24 de 500 nanogramas por mililitro em 500 microlitros de DMEM FPS fresco. Incubar por duas horas em uma incubadora de cultura de tecidos.

Após duas horas, adicione dois mililitros de DMEM FPS pré-aquecido a 37 graus Celsius a cada poço e retorne a placa à incubadora. 48 horas após a infecção, remova o meio e lave as células com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Colha as células adicionando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA pré-aquecidos a 37 graus Celsius e, após alguns segundos, inspecione visualmente os poços quanto ao deslocamento das células.

Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM FPS pré-aquecido e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta volumétrica. Transfira a solução para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados contendo 18 mililitros de DMEM FPS pré-aquecido e retorne à incubadora de cultura de tecidos. Um mínimo de cinco dias após a infecção, colha as células como antes e ressuspenda em cinco mililitros de DMEM FPS pré-aquecido por pipetagem.

Centrifugar a solução durante cinco minutos à temperatura ambiente a 2 500 Gs, aspirar e rejeitar o sobrenadante. Por fim, extraia o DNA genômico do pellet celular usando um kit disponível comercialmente. Eluir o DNA da coluna de troca iônica fornecida com 200 microlitros de Tris-HCL milimolar a pH 8,5.

Após a sonicação do DNA genômico, purifique o DNA sonicado usando um kit de purificação por PCR. Em seguida, repare o DNA usando um kit de reparo final. Após a purificação do DNA como antes, A cauda o DNA usando a enzima Klenow Exo-Minus.

Alternativamente, para fragmentação por digestão de endonuclease de restrição, corte o DNA genômico com um coquetel de enzimas que geram saliências de 5'TA, bem como uma enzima incompatível, como BglII, que cliva a jusante do LTR viral a montante. Corte 10 microgramas de DNA genômico em um volume final de 100 microlitros. Incube durante a noite a 37 graus Celsius.

Certifique-se de que o DNA final seja limpo usando o kit de purificação de PCR. O ligante a ser usado com DNA sonicado deve conter uma saliência T 3', enquanto o ligante para DNA digerido MseI deve conter uma saliência 5'TA compatível. Comece recozendo 10 micromolares dos fios de ligação curtos e longos em 35 microlitros de tampão Tris-HCL EDTA aquecendo a 90 graus Celsius e resfriando lentamente até a temperatura ambiente em etapas de um grau Celsius por minuto.

Em seguida, prepare pelo menos quatro reações de ligação paralela por amostra de DNA genômico contendo 1,5 ligante micromolar, um micrograma de DNA fragmentado e 800 unidades de T4 DNA ligase em um volume final de 50 microlitros. Ligue durante a noite a 12 graus Celsius. Para amostras preparadas por sonicação, digerir a reação de ligação purificada com uma enzima de restrição que cliva a jusante do LTR a montante.

Use 100 unidades da enzima apropriada nas condições recomendadas pelo fabricante durante a noite. Certifique-se de que os produtos finais sejam purificados usando um kit de purificação PCR. Prepare as PCRs da primeira rodada usando os reagentes mostrados aqui.

Execute a primeira rodada de PCR usando os seguintes parâmetros: 94 graus Celsius por dois minutos, seguido por 30 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos, 55 graus Celsius por 30 segundos, 68 graus Celsius por 45 segundos. Termine com 68 graus Celsius por 10 minutos. Agrupe as reações da primeira rodada e purifique o DNA como antes.

Em seguida, prepare a segunda rodada de PCRs contendo os reagentes mostrados aqui. Use os mesmos parâmetros de ciclagem da primeira rodada de PCR. Depois de reunir e purificar o DNA da reação da segunda rodada, execute o controle de qualidade e o sequenciamento de próxima geração e analise os locais de integração usando as instruções detalhadas na parte escrita do protocolo.

Os locais de integração de bibliotecas preparadas por digestão com enzimas de restrição, conforme mostrado à esquerda, ou sonicação, conforme mostrado à direita, foram alinhados usando o software de logotipo da web. Cada diluição na série de titulação é representada, desde o DNA puro na parte superior da figura, até a diluição máxima de um a 15.625 na parte inferior. O grau de certeza diminui com o aumento da diluição do DNA da célula infectada.

Esta imagem mostra o logotipo da sequência para o controle aleatório correspondente de 50.000 locais genômicos exclusivos. Observe que os locais aleatórios alinhados a partir do conjunto de dados do MRC, por outro lado, não conseguiram gerar níveis apreciáveis de preferências básicas. Uma vez dominadas, as bibliotecas do site de integração podem ser preparadas a partir do DNA genômico em três dias.

O mapeamento do local de integração, desde a infecção inicial até a bioinformática concluída, pode, portanto, ser concluído em cerca de duas semanas. Seguindo esse procedimento, milhares ou até milhões de locais de integração retroviral exclusivos podem ser catalogados e diversas análises podem ser conduzidas para quantificar associações entre locais de inserção e anotações genômicas.