Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

O objetivo geral deste procedimento é amplificar por PCR os sítios de integração retroviral a partir de DNA genômico total e sequenciar a biblioteca de DNA resultante, de modo que as localizações exatas de integração possam ser mapeadas em um genoma de referência. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na retrovirologia básica e clínica ao analisar a distribuição dos sítios de integração ao longo de um genoma hospedeiro. A principal vantagem desta técnica é a profundidade de sequenciamento de DNA e o fato de que muitas amostras podem ser multiplexadas em um único experimento de sequenciamento.

No dia anterior à transfeção, plaque 3,3 vezes 10 à sexta potência de células HEK293T em 10 mililitros de meio Dulbecco Modificado de Eagle suplementado em cada um dos cinco pratos de 100 milímetros. No dia seguinte, utilize reagentes de transfeção comercialmente disponíveis ou fosfato de cálcio para transfectar as células com 10 microgramas de plasmídeo contendo clones moleculares retrovirais de sequência completa ou nove microgramas de vetores de única rodada com envelope elidido mais um micrograma de um construto de expressão de VSV-G. Adicione a mistura ao meio celular gota a gota.

Após a transfeção, incubar as células a 37 graus Celsius em um incubador de cultura celular umidificado com 5% de dióxido de carbono. Após aproximadamente 48 horas, coletar o meio celular contendo o vírus utilizando uma pipeta volumétrica e filtrá-lo por fluxo gravitacional através de um filtro de 0,45 mícron. Em seguida, concentrar o vírus por ultracentrifugação a 200.000 ×g durante uma hora a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante até que permaneça aproximadamente 500 microlitros de DMEM FPS e re-suspenda o pellet do vírus. Adicione 20 unidades de DNAse e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Determine a concentração de p24 utilizando um kit de captura de antígeno p24 do HIV-1 de acordo com as instruções do fabricante.

No dia anterior à infecção, plaque 3,0 × 10⁵ células HEK293T em 2,5 mL de DMEM FPS por poço em uma placa de seis poços e incube durante a noite em uma estufa de cultura de tecidos. Infecte as células com uma concentração final de p24 viral de 500 ng/mL em 500 µL de DMEM FPS fresco. Incube por duas horas em uma estufa de cultura de tecidos.

Após duas horas, adicione dois mililitros de DMEM FPS pré-aquecido a 37 graus Celsius em cada poço e retorne a placa ao incubador. 48 horas após a infecção, remova o meio e lave as células com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Recolha as células adicionando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA pré-aquecida a 37 graus Celsius e, após alguns segundos, inspecione visualmente os poços quanto ao desprendimento celular.

Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM FPS pré-aquecido e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta volumétrica. Transfira a solução para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados contendo 18 mililitros de DMEM FPS pré-aquecido e retorne ao incubador de cultura de tecidos. No mínimo cinco dias após a infecção, colete as células como anteriormente e ressuspenda em cinco mililitros de DMEM FPS pré-aquecido por meio de pipetagem.

Centrifugue a solução por cinco minutos à temperatura ambiente a 2.500 Gs, depois aspire e descarte o sobrenadante. Por fim, extraia o DNA genômico do pellet celular utilizando um kit comercialmente disponível. Elua o DNA da coluna de troca iônica fornecida com 200 microlitros de Tris-HCl milimolar com pH 8,5.

Após a sonicação do DNA genômico, purifique o DNA sonicado utilizando um kit de purificação de PCR. Em seguida, realize a reparação do DNA usando um kit de reparo de extremidades. Após a purificação do DNA como anteriormente, adicione uma cauda A ao DNA utilizando a enzima Klenow Exo-Minus.

Alternativamente, para fragmentação por digestão com endonuclease de restrição, corte o DNA genômico com um coquetel de enzimas que geram extremidades salientes 5'TA, bem como uma enzima incompatível, como a BglII, que cliva a jusante do LTR viral upstream. Corte 10 microgramas de DNA genômico em um volume final de 100 microlitros. Incube durante a noite a 37 graus Celsius.

Certifique-se de que o DNA final seja purificado utilizando o kit de purificação de PCR. O ligante a ser usado com DNA sonicado deve conter uma saliência 3'T compatível, enquanto o ligante para DNA digerido com MseI deve conter uma saliência 5'TA compatível. Comece hibridizando 10 micromolares das fitas curtas e longas do ligante em 35 microlitros de tampão Tris-HCl-EDTA, aquecendo a 90 graus Celsius e resfriando lentamente até a temperatura ambiente em etapas de um grau Celsius por minuto.

Em seguida, prepare pelo menos quatro reações de ligação paralelas por amostra de DNA genômico, contendo 1,5 micromolar de ligante ligado, um micrograma de DNA fragmentado e 800 unidades de ligase de DNA T4 em um volume final de 50 microlitros. Realize a ligação durante a noite a 12 graus Celsius. Para amostras preparadas por sonicação, digira a reação de ligação purificada com uma enzima de restrição que clive a jusante do LTR upstream.

Utilize 100 unidades da enzima apropriada sob as condições recomendadas pelo fabricante durante a noite. Certifique-se de que os produtos finais sejam purificados usando um kit de purificação de PCR. Prepare as reações de PCR da primeira rodada utilizando os reagentes mostrados aqui.

Realize a PCR da primeira rodada usando os seguintes parâmetros: 94 graus Celsius por dois minutos, seguido por 30 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos, 55 graus Celsius por 30 segundos, 68 graus Celsius por 45 segundos. Finalize com 68 graus Celsius por 10 minutos. Reúna as reações da primeira rodada e purifique o DNA como anteriormente.

Em seguida, prepare as PCR da segunda rodada contendo os reagentes mostrados aqui. Utilize os mesmos parâmetros de ciclagem da PCR da primeira rodada. Após o agrupamento e purificação do DNA da reação da segunda rodada, realize o controle de qualidade e o sequenciamento de nova geração, e analise os sítios de integração seguindo as instruções detalhadas na parte escrita do protocolo.

Os sítios de integração de bibliotecas preparadas por digestão com enzimas de restrição, conforme mostrado à esquerda, ou por sonicação, conforme mostrado à direita, foram alinhados utilizando software de logo de sequência. Cada diluição na série de titulação é representada, desde o DNA puro na parte superior da figura até a diluição máxima de um para 15.625 na parte inferior. O grau de certeza diminui com o aumento da diluição do DNA de células infectadas.

Esta imagem mostra o logotipo de sequência para o controle aleatório emparelhado de 50.000 sítios genômicos únicos. Observe que os sítios aleatórios alinhados do conjunto de dados MRC, por outro lado, não geraram níveis apreciáveis de preferências de bases. Uma vez dominada a técnica, bibliotecas de sítios de integração podem ser preparadas a partir de DNA genômico em três dias.

O mapeamento de sítios de integração, desde a infecção inicial até a conclusão da bioinformática, pode ser concluído em cerca de duas semanas. Após este procedimento, milhares ou até milhões de sítios únicos de integração retroviral podem ser catalogados, e diversas análises podem ser realizadas para quantificar associações entre sítios de inserção e anotações genômicas.