Name: Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a amplificar e sequenciar sites de integração retroviral em DNA genômico usando PCR e bioinformática. Este método permite mapear precisamente locais de integração em genomas de referência.

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Somos gratos aos nossos colegas Stephen Hughes e Henry Levin para o conselho que foi fundamental para estabelecer o protocolo de NGS para retroviral sequenciamento local de integração no laboratório Engelman. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede AI039394 e AI052014 (a ANE) e AI060354 (Centro Harvard University for AIDS Research).

Os autores não têm nada a divulgar.

Um protocolo para a análise de sítios de integração retroviral, a partir do passo inicial de infecção pelo vírus através do mapeamento dos padrões de distribuição genómicas, é descrito. Este protocolo é aplicável a qualquer retrovírus e qualquer tipo de célula infectáveis. Além disso, a tubagem de ensaio é muito sensível, com o potencial de recuperar um número de locais de integração satisfatória únicas a partir de diluições em série de ADN genómico equivalente ao de uma infecção iniciada com um MOI de 6,4 x 10 -5....

A integração de ADN virai (vDNA) no genoma da célula hospedeira é um passo essencial no ciclo de vida retroviral. A integração é conseguida pela integrase viral enzima (NOS), que realiza dois processos catalíticos distintos que levam à criação do provírus inserida estavelmente um. EM subunidades envolver as extremidades do vDNA linear que é gerada por meio de transcrição reversa, formando o intasome de ordem superior com vDNA extremidades unidas por um multímero 4/2 NO. EM cliva &#39;extremidades do vDNA jusante da invariantes 5&#39;-CA-3&#39; a 3 em sequências de um processo conhecido como 3&#39;-processamento, deixando um recesso 3 &#39;termina com grupos hidroxilo reactivos em cada terminal vDNA 5-8. O intasome subsequentemente é importado para o núcleo como parte de uma grande assembléia de acolhimento e proteínas virais conhecido como o complexo de pré-integração (PIC) 9-11. Depois de encontrar alvo celular DNA (DNAt), IN utiliza a vDNA 3&#39;-hidroxil groups para clivar o topo DNAt e fios de fundo de forma escalonada e, simultaneamente, se junta ao vDNA para grupos fosfato DNAt 5 &#39;através do processo de transferência de cadeia 12,13. preferências do site integração exposição retrovírus nas escalas local e global. Localmente, locais de integração de consenso consistem em sequências DNAt palindrï¿½icas fracamente conservados que vão desde cerca de 5-10 pb a montante ea jusante dos locais de inserção vDNA 14,15. Globalmente, os retrovírus alvo anotações de cromatina específicos 16. Há sete géneros retroviral diferente - alpha através de epsilon, lenti e SPUMA. Os lentivírus, que incluem HIV-1, favorecer a integração dentro dos corpos dos genes ativamente transcritas 17, enquanto os gammaretroviruses integrar preferencialmente em locais de transcrição de início (TSSS) e regiões potenciador ativos 18-20. Em nítido contraste, Spumavirus é fortemente inclinado para heterochromregiões ATIC, como domínios associados a lâmina de genes dos pobres 21. Preferências de base DNAt locais são em grande parte ditada pelas redes específicas de contatos nucleoproteína entre IN e DNAt 13,22,23. Para os lentivírus e gammaretroviruses, a integração em relação ao anotações genômicas é em grande parte regido por interações entre IN e fatores celulares cognatos 24-27. Alterando as especificidades da rede de interação IN-DNAt 13,22,23,28 e perturbando ou re-engenharia IN-hospedeiro interações fator 25-27,29-32 são estratégias comprovadas para redirecionar integração nos níveis locais e globais, respectivamente. O poder dos procedimentos de seqüenciamento de DNA usados ​​para catalogar locais de integração retrovirais aumentou imensamente nas últimas décadas. Locais de integração foram recuperados no trabalho pioneiro utilizando purificação trabalhoso e técnicas de clonagem manuais para produzir apenas um punhado de sites únicos por 33,34 estudo.A combinação de amplificação por LM-PCR de junções de ADN LTR-hospedeiro com a capacidade para mapear locais de integração individuais de genomas projectos de rato humanos e transformadas no domínio, com o número de sítios recuperados a partir de infecções de células de cultura de tecidos exógeno aumentando a várias centenas a milhares 17 , 18. A combinação mais recente LM-PCR com a metodologia NGS enviou disparada profundidade biblioteca. Especificamente, proporcionou pyrosequencing da ordem de dezenas de milhares de locais de integração única 30,35-38, enquanto bibliotecas sequenciado através da utilização do agrupamento de ADN pode produzir milhões de sequências únicas 19-21,39. Aqui nós descrevemos um protocolo LM-PCR otimizado para amplificar e sequenciar locais de integração retrovirais utilizando NGS DNA de agrupamento. O método incorpora necessária sequências adaptadoras para os iniciadores de PCR e, portanto, directamente para as moléculas de ADN amplificados, impedindo assim a necessidade de um passo adicional do adaptador de ligação antes da sequenciamento 40. O gasoduto análise bioinformática, a partir da análise de dados de sequenciamento brutos para junções de ADN LTR-host para o mapeamento dos locais de integração únicas para pertinentes características genômicas, também é geralmente descrita. De acordo com a precedência estabelecida a partir de protocolos metodológicos anteriores neste campo 36,38,41-43, scripts personalizados podem ser desenvolvidos para auxiliar a conclusão de etapas específicas no pipeline de bioinformática. A utilidade e a sensibilidade do protocolo é ilustrado com dados representativos amplificando, sequenciação e mapeamento de HIV-1 os locais de integração a partir de células de cultura de tecidos infectadas na multiplicidade de infecção aproximada (MOI) de 1,0, bem como uma série de titulação de este DNA diluiu-se através do DNA celular infectada em 5 vezes etapas para uma diluição máxima de 1: 15.625 para se obter o equivalente MOI aproximada de 6,4 x 10 -5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084 Meio de</td><td>cultura celular padrão, compatível com células HEK293T</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Diferentes lotes de soro podem precisar ser pré-selecionados para produção viral ideal</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibióticos a serem adicionados ao DMEM</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Usado para lavar células</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Usado para separar células aderentes de placas de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>reagente de transfecção de DNA</td></tr><tr><td>0,45 &micro; m Filtros</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Usado para filtrar meios de cultura de células contendo partículas de vírus</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Usado para degradar o DNA do plasmídeo de transferência de estoques de vírus</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Ensaio de captura de antígeno</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Usado para quantificar o rendimento da produção de vírus</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de Tecidos</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Usado para purificar o DNA genômico das células</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Com este modelo de sonicador, execute duas rodadas de ciclo de trabalho, 5%; intensidade, 3; ciclos por explosão, 200; tempo, 80 seg</td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Água disponível comercialmente é recomendada para reduzir a possibilidade de contaminação cruzada da amostra</td></tr><tr><td>Purificação de PCR QIAQuick Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Usado para purificar DNA durante a construção da biblioteca</td></tr><tr><td>Kit de Reparo Final de DNA</td><td>Epicentro</td><td>ER81050</td><td>Usado para reparar extremidades de DNA de amostras de DNA sonicado</td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td> <td>M0212S</td><td>Usado com dATP para fragmentos de DNA reparados com cauda A</td></tr><tr><td>dATP Thermo</td><td>Scientific</td><td>R0141</td><td>Trifosfato de desoxiadenosina</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Endonuclease de restrição para clivagem de DNA genômico</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Endonuclease de restrição para suprimir a amplificação da sequência T4 DNA ligase U5 do HIV-1 a montante</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzima para união covalente de extremidades de DNA compatíveis</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>de DNA Tecnologias integradas</td><td>de DNA personalizadas</td><td>Faça com que a empresa purifique os oligos. A purificação por HPLC é suficiente para os ADN < 30 nucleotídeos; PAGE purifica DNAs mais longos&nbsp;</td></tr><tr><td>Vantagem 2 Mistura de Polimerase</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Mistura comercial contendo DNA polimerase para PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (soluções de 100 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Dilua os quatro produtos químicos no gelo com água estéril para atingir as concentrações intermediárias de 2,5 mM cada dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Espectrofotômetro para determinação da concentração</td></tr> <tr><td>de DNAQubit Fluorímetro</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&reg; 3.0</td><td>Fluorômetro usado para confirmar a concentração de DNA da biblioteca do site de integração</td></tr><tr><td>2200 Sistema Agilent</td><td></td><td>G2964AA</td><td>Ensaio baseado em fita para confirmar a distribuição do tamanho do DNA da biblioteca do site de integração</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Usado para NGS</td></tr></tbody></table>

amplificação, sequenciamento de próxima geração, e genomic dna mapeamento das retrovirais integração sites

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

preferências de integração assinatura retrovírus exposição em ambos as escalas local e global. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para (1) geração de diversas bibliotecas de sites de integração retrovirais utilizando PCR amplificação mediada por ligação (LM-PCR) e sequenciamento de próxima geração (NGS), (2) o mapeamento da localização genômico de cada a vírus acolher junção usando BEDTools, e (3) para analisar os dados de relevância estatística. O ADN genómico extraído a partir de células infectadas está fragmentado por digestão com enzimas de restrição ou por sonicação. Depois de DNA final de reparação adequado, os ligantes de cadeia dupla são ligadas para as extremidades do DNA, e PCR com iniciadores semi-internos é conduzida usando iniciadores complementares para tanto a extremidade mais longa repetição terminal (LTR) do vírus e o ADN ligante ligado. Os iniciadores de PCR transportar sequências necessárias para o agrupamento de ADN durante NGS, eliminando a exigência de ligação adaptador separado. Controlo de Qualidade (QC) é conduzido para avaliar a distribuição de tamanho de fragmento de ADN e adaptarer incorporação de ADN antes de NGS. arquivos de saída de seqüência são filtrados para LTR contendo lê, e as sequências que definem o LTR e o ligante são cortadas de distância. sequências celulares hospedeiras aparadas são mapeados para um genoma de referência usando BLAT e são filtrados para 97% de identidade minimamente para um ponto único no genoma de referência. locais de integração únicas são examinados para nucleotídeo adjacente (nt) sequência e distribuição relativa a várias características genômicas. Usando este protocolo, as bibliotecas local de integração de alta complexidade pode ser construído a partir de ADN genómico em três dias. Todo o protocolo que engloba infecção virai exógeno de células de cultura de tecidos sensíveis à análise do local de integração pode, portanto, ser realizada em cerca de uma a duas semanas. Recentes aplicações desta tecnologia referem-se a análise longitudinal de locais de integração a partir de pacientes infectados com HIV.

A Tabela 4 lista os resultados de uma experiência representativa para ilustrar a sensibilidade de NGS para a recuperação de locais de integração a partir de uma cultura de células infectadas. DNA celular não infectados foi utilizado para diluir em série de ADN genómico a partir de uma infecção em que todas as células, em média, continha uma integração 40. As diluições foram preparadas em passos de cinco a uma diluição máxima de 1: 15.625. O ADN genómico da sér...

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

O objetivo geral deste procedimento é amplificar por PCR os sítios de integração retroviral a partir de DNA genômico total e sequenciar a biblioteca de DNA resultante, de modo que as localizações exatas de integração possam ser mapeadas em um genoma de referência. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na retrovirologia básica e clínica ao analisar a distribuição dos sítios de integração ao longo de um genoma hospedeiro. A principal vantagem desta técnica é a profundidade de sequenciamento de DNA e o fato de que muitas amostras podem ser multiplexadas em um único experimento de sequenciamento.No dia anterior à transfeção, plaque 3,3 vezes 10 à sexta potência de células HEK293T em 10 mililitros de meio Dulbecco Modificado de Eagle suplementado em cada um dos cinco pratos de 100 milímetros. No dia seguinte, utilize reagentes de transfeção comercialmente disponíveis ou fosfato de cálcio para transfectar as células com 10 microgramas de plasmídeo contendo clones moleculares retrovirais de sequência completa ou nove microgramas de vetores de única rodada com envelope elidido mais um micrograma de um construto de expressão de VSV-G. Adicione a mistura ao meio celular gota a gota.Após a transfeção, incubar as células a 37 graus Celsius em um incubador de cultura celular umidificado com 5% de dióxido de carbono. Após aproximadamente 48 horas, coletar o meio celular contendo o vírus utilizando uma pipeta volumétrica e filtrá-lo por fluxo gravitacional através de um filtro de 0,45 mícron. Em seguida, concentrar o vírus por ultracentrifugação a 200.000 ×g durante uma hora a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, remova o sobrenadante até que permaneça aproximadamente 500 microlitros de DMEM FPS e re-suspenda o pellet do vírus. Adicione 20 unidades de DNAse e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Determine a concentração de p24 utilizando um kit de captura de antígeno p24 do HIV-1 de acordo com as instruções do fabricante.No dia anterior à infecção, plaque 3,0 × 10⁵ células HEK293T em 2,5 mL de DMEM FPS por poço em uma placa de seis poços e incube durante a noite em uma estufa de cultura de tecidos. Infecte as células com uma concentração final de p24 viral de 500 ng/mL em 500 µL de DMEM FPS fresco. Incube por duas horas em uma estufa de cultura de tecidos.Após duas horas, adicione dois mililitros de DMEM FPS pré-aquecido a 37 graus Celsius em cada poço e retorne a placa ao incubador. 48 horas após a infecção, remova o meio e lave as células com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Recolha as células adicionando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA pré-aquecida a 37 graus Celsius e, após alguns segundos, inspecione visualmente os poços quanto ao desprendimento celular.Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM FPS pré-aquecido e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta volumétrica. Transfira a solução para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados contendo 18 mililitros de DMEM FPS pré-aquecido e retorne ao incubador de cultura de tecidos. No mínimo cinco dias após a infecção, colete as células como anteriormente e ressuspenda em cinco mililitros de DMEM FPS pré-aquecido por meio de pipetagem.Centrifugue a solução por cinco minutos à temperatura ambiente a 2.500 Gs, depois aspire e descarte o sobrenadante. Por fim, extraia o DNA genômico do pellet celular utilizando um kit comercialmente disponível. Elua o DNA da coluna de troca iônica fornecida com 200 microlitros de Tris-HCl milimolar com pH 8,5.Após a sonicação do DNA genômico, purifique o DNA sonicado utilizando um kit de purificação de PCR. Em seguida, realize a reparação do DNA usando um kit de reparo de extremidades. Após a purificação do DNA como anteriormente, adicione uma cauda A ao DNA utilizando a enzima Klenow Exo-Minus.Alternativamente, para fragmentação por digestão com endonuclease de restrição, corte o DNA genômico com um coquetel de enzimas que geram extremidades salientes 5'TA, bem como uma enzima incompatível, como a BglII, que cliva a jusante do LTR viral upstream. Corte 10 microgramas de DNA genômico em um volume final de 100 microlitros. Incube durante a noite a 37 graus Celsius.Certifique-se de que o DNA final seja purificado utilizando o kit de purificação de PCR. O ligante a ser usado com DNA sonicado deve conter uma saliência 3'T compatível, enquanto o ligante para DNA digerido com MseI deve conter uma saliência 5'TA compatível. Comece hibridizando 10 micromolares das fitas curtas e longas do ligante em 35 microlitros de tampão Tris-HCl-EDTA, aquecendo a 90 graus Celsius e resfriando lentamente até a temperatura ambiente em etapas de um grau Celsius por minuto.Em seguida, prepare pelo menos quatro reações de ligação paralelas por amostra de DNA genômico, contendo 1,5 micromolar de ligante ligado, um micrograma de DNA fragmentado e 800 unidades de ligase de DNA T4 em um volume final de 50 microlitros. Realize a ligação durante a noite a 12 graus Celsius. Para amostras preparadas por sonicação, digira a reação de ligação purificada com uma enzima de restrição que clive a jusante do LTR upstream.Utilize 100 unidades da enzima apropriada sob as condições recomendadas pelo fabricante durante a noite. Certifique-se de que os produtos finais sejam purificados usando um kit de purificação de PCR. Prepare as reações de PCR da primeira rodada utilizando os reagentes mostrados aqui.Realize a PCR da primeira rodada usando os seguintes parâmetros: 94 graus Celsius por dois minutos, seguido por 30 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos, 55 graus Celsius por 30 segundos, 68 graus Celsius por 45 segundos. Finalize com 68 graus Celsius por 10 minutos. Reúna as reações da primeira rodada e purifique o DNA como anteriormente.Em seguida, prepare as PCR da segunda rodada contendo os reagentes mostrados aqui. Utilize os mesmos parâmetros de ciclagem da PCR da primeira rodada. Após o agrupamento e purificação do DNA da reação da segunda rodada, realize o controle de qualidade e o sequenciamento de nova geração, e analise os sítios de integração seguindo as instruções detalhadas na parte escrita do protocolo.Os sítios de integração de bibliotecas preparadas por digestão com enzimas de restrição, conforme mostrado à esquerda, ou por sonicação, conforme mostrado à direita, foram alinhados utilizando software de logo de sequência. Cada diluição na série de titulação é representada, desde o DNA puro na parte superior da figura até a diluição máxima de um para 15.625 na parte inferior. O grau de certeza diminui com o aumento da diluição do DNA de células infectadas.Esta imagem mostra o logotipo de sequência para o controle aleatório emparelhado de 50.000 sítios genômicos únicos. Observe que os sítios aleatórios alinhados do conjunto de dados MRC, por outro lado, não geraram níveis apreciáveis de preferências de bases. Uma vez dominada a técnica, bibliotecas de sítios de integração podem ser preparadas a partir de DNA genômico em três dias.O mapeamento de sítios de integração, desde a infecção inicial até a conclusão da bioinformática, pode ser concluído em cerca de duas semanas. Após este procedimento, milhares ou até milhões de sítios únicos de integração retroviral podem ser catalogados, e diversas análises podem ser realizadas para quantificar associações entre sítios de inserção e anotações genômicas.

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Biology

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