Name: Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em E. coli Para raios-X Cristalografia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a produzir e purificar o domínio saliente do norovírus humano em E. coli para cristalografia de raios-X. Este protocolo rápido e robusto fornece proteína altamente pura para estudos estruturais e funcionais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O financiamento para este estudo foi fornecido pela fundação CHS. Reconhecemos a plataforma de cristalização de proteínas dentro do cluster de excelência CellNetworks da Universidade de Heidelberg para triagem de cristais e o European Synchrotron Radiation Facility para fornecimento de instalações de radiação síncrotron.

1. P Domínio Clonagem <ol><li> Determinar a região de domínio P codificação por alinhamento de sequências de cepas de norovírus (por exemplo, a estirpe GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Além do mais, remover a região flexível na extremidade C-terminal do domínio P (Figura 2A). Codon-optimizar o ADN para E. expressão de E. coli e incluem BamHI (C-terminal) os sítios de restrição (N-terminal) e Notl, a fim de sub-clone de P o domínio região codificadora no vector de expressão pMalc2x 6,7. Nota: A região de codificação do domínio P é optimizada e sintetizado por um serviço comercial. O domínio P região codificadora (insert) é de aproximadamente 1 kb de comprimento e entregue em um vector de transferência padrão. </li><li> Digerir 2 ug do vector de transferência com cada 1 ul BamHI (20000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) as enzimas de restrição durante 1 hora a 37 ° C com o fabricante fornecido tampões. </li><li> Separa-se a inserção digerido num gel de agarose a 1%durante 20 minutos a 135 V e purificar o ADN de inserção a partir do gel utilizando um kit comercial. </li><li> Prepara-se o vector de expressão pMalc2x por digestão de 2 ug deste vector com cada 1 ul BamHI (20000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) as enzimas de restrição durante 1 hora a 37 ° C. Purifica-se o vector a partir de um gel de agarose tal como descrito acima (1,3). Nota: Ambas as amostras (1,2 e 1,4) pode ser armazenado a -20 ° C. </li><li> Ligadura a inserção no vector purificado pMalc2x digerido nos locais de restrição BamHI e NotI com 1 ul de ligase de T4-ADN (400.000 U / mL) durante 15 min à temperatura ambiente (RT) (Figura 2B e 2C). Use pelo menos 20 ng do vector e pMalc2x um vector: inserto proporção de 1: 3 (peso molecular). A mistura de ligação é normalmente ~ 20 ul. </li><li> Transformar 2 ul da mistura de ligação em E. 50 ul quimicamente competente coli DH5a células bacterianas, utilizando um protocolo de transformação padrão (10 min em gelo, de choque térmico de 45 seg a 42 ° C) e crescer em 600meio SOC uL durante 1 hora a 37 ° C. Centrifugar as células transformadas durante 3 min a 1000 xg, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 30 ul de meio SOC. <ol><li> Placa da mistura de transformação em placas de LB-agar contendo 100 ug / ml de ampicilina para selecção, e crescer durante a noite a 37 ° C. Escolha pelo menos cinco colônias. </li></ol></li><li> Para cada uma das cinco colónias, inocular 2-3 mL de cultura de meio LB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina (LB-amp) e crescer por agitação durante a noite a 160 rpm a 37 ° C. </li><li> Extrair os plasmídeos a partir da cultura durante a noite utilizando um kit comercial. Verificar a presença da inserção por sequenciação do domínio de P com um iniciador directo pMalc2x (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) e o iniciador reverso (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> Expressão 2. P Domínio <ol><li> Transform 1 ul (150 ng / mL - 400 ng / ul) do vector que codifica para o pMalc2x-His-P domínio MBPproteína de fusão em 50 ul de E. competente coli BL21 células usando um protocolo de transformação padrão (10 min em gelo, de choque térmico de 45 seg a 42 ° C) e crescer em meio SOC 600 uL durante 1 hora a 37 ° C. Subcultura em 120 ml de LB-amp durante a noite a 160 rpm e 37 ° C. </li><li> Inocular nove litros (por exemplo, 6 x 5 L frascos com 1,5 L de meio de cada) de LB-amp com a subcultura (1: 100). Crescer as células com agitação a 160 rpm e 37 ° C, até a DO600 atinge 0,4-0,6. Subsequentemente, baixar a temperatura para 22 ° C durante ~ 1 h e em seguida, induzir a expressão da proteína com 0,66 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 8. Deixar crescer as células durante a noite a 22 ° C (~ 18 horas). Nota: A temperatura pode ser variada, mas recomendamos o uso de 22 ° C ou inferior. </li><li> Colher as células por centrifugação (10543 xg, 15 min, 4 ° C). Descartar o sobrenadante e congelar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C. </li></ol>1º Passo Purificação e Protease Cleavage <ol><li> Prepare tampões que são usados ​​durante os passos de purificação de proteínas a partir de soluções de estoque para garantir a reprodutibilidade e a estabilidade das experiências. Prepare quatro buffers diferentes para a cromatografia de afinidade de iões metálicos imobilizados (IMAC), cada uma contendo uma concentração diferente de imidazolo (10 mM, 20 mM, 50 mM e 250 mM). Para a SEC, preparar um tampão de filtração em gel (GFB) com uma concentração de sal mais elevado, mas sem imidazol. Use água desionizada e filtra-se todos os buffers antes da utilização com um tamanho de poro de 0,45 um. Nota: Para um detalhado esquema preparação buffer, consulte a Tabela 1. </li><li> Descongelar o sedimento de células a partir da cultura nove litros e dissolve-se em 150 ml de PBS a 4 ° C. Sonicar a suspensão de células três vezes durante 2 min (potência 130 W, 20% de amplitude, frequência de impulsos 50%) para romper as células. Manter a suspensão de células em gelo durante a sonicação. </li><li> CentrifuGE a suspensão de células sonicadas (43667 xg, 30 min, 4 ° C) para separar os resíduos celulares do sobrenadante contendo proteína expressa. Recolher o sobrenadante e descartar o pellet. </li><li> Lavagem e equilibrar 10 ml (volume da coluna = 1 [CV]) suspensão de níquel (Ni) -NTA agarose com tampão de imidazolo 10 mM em uma coluna de cromatografia. Adicionar os grânulos Ni equilibradas para o sobrenadante do passo 3.3 contendo proteína expressa de fusão do domínio MBP-His-P e incubar durante 30 min a 4 ° C com rotação lenta. </li><li> Após a incubação, aplicam-se toda a mistura de Ni-bead-proteína a uma coluna de cromatografia. Lava-se a coluna com lentamente cada 5 CV de 10 mM, 20 mM e imidazole 50 mM tampões, começando com 10 mM, em seguida, a 20 mM e passada 50 mM (Figura 3A). </li><li> Elui-se a proteína de fusão do domínio MBP-His-P usando tampão de imidazole 250 mM (Figura 3A). Durante a eluição, verificar a 280nm OD para verificar a eluição da proteína de fusão (o aumento do OD 280 nM). Continuar a eluição até 280nm OD cai para ~ 0,1. Lavam-se as esferas com quantidades excessivas de tampão de imidazole 250 mM (pelo menos 10 CV), seguido por, pelo menos, 10 CV de 10 mM de tampão de imidazol. Salve as contas para a segunda etapa de purificação (secção 4). </li><li> Verificar a presença da proteína de fusão do domínio MBP-His-P com SDS-PAGE usando um gel de 12% SDS-poliacrilamida (10 x 8 cm) 9 (Figura 3A). Efectuar a electroforese em gel a 45 A e 200 V durante 45 min. </li><li> Concentra-se (por exemplo, utilizando um concentrador comercial) da proteína de fusão do domínio MBP-His-P eluída a uma concentração final de ~ 3 mg / ml. Clivar o domínio de fusão MBP-His-P com HRV-protease 3C durante a diálise contra 2 L de 10 mM de tampão de imidazol (~ 1: 100) durante a noite a 4 ° C (Figura 3A). Dependendo do volume final de proteína concentrada, executar a diálise numa cassete de diálise ou tubo de diálise. Nota: A quantidade de HRV-3C protease para a proteínaclivagem é calculado de acordo com a actividade de protease específica (2 U / ml, 1 U é suficiente para clivar 100 ug de proteína) e a quantidade de proteína de fusão eluida, que varia de acordo com o nível de expressão e pode ser calculada a partir dos resultados de SDS-PAGE (3,7 ). </li></ol> 4. 2º Passo de Purificação <ol><li> Equilibrar as Ni-grânulos do passo 3.6 em tampão de imidazol 10 mM. </li><li> Incubar a proteína dialisada a partir do passo 3.7 (contendo o domínio clivada P, proteína MBP, e HRV-protease) com as esferas de Ni-equilibradas (4.1) durante 30 min a 4 ° C com rotação lenta. </li><li> Aplicar a mistura de Ni com pérolas para uma coluna e recolher o fluxo de passagem (P domínio clivado) (Figura 3B). Medir a concentração de proteína, uma vez que vem a sair da coluna até que a OD 280 nm alcança ~ 0,1. Nota: O MBP-His deve permanecer ligado ao NI-grânulos (Figura 3B). </li><li> Verifique a presença de domínio clivada P usando SDS-PAGE com um 1Gel de 2% tal como descrito anteriormente (Figura 3B). Concentra-se o domínio de P ~ eluída a 3 mg / ml e diálise durante a noite a 4 ° C contra GFB para subsequente purificação SEC. </li></ol> 5. 3º Passo de Purificação <ol><li> Bombas de lavagem e tubos do sistema de purificação de HPLC e pré-equilibrar a SEC-coluna (ver Lista de Materiais) com GFB. </li><li> Injectar o domínio de P para a coluna a uma taxa de fluxo de 1 mL / min usando uma Superloop (até 12 ml) ou ciclo (até 3 ml), dependendo do volume da amostra concentrada. Após a injecção está terminada, aumentar a taxa de fluxo de 2,5 ml / min. </li><li> Como o OD aumenta e o domínio P sai da coluna, recolher fracções de 1,5 ml. Verificar fracções utilizando SDS-PAGE com um gel de 12% (Figura 4A e 4B). Piscina apenas o mais puro fracções e concentrar para ~ 3 mg / ml e ~ 8 mg / ml. Nota: Depois de ~ 110 ml (volume vazio) a maioria das impurezas são eluídos a partir de uma coluna SEC com um volume de 320 ml cama. odomínio P é normalmente eluida como um dímero. A eluição tempo / volume do dímero de domínio P é dependente do grau de preparação (pg) da coluna SEC. </li></ol> 6. A cristalização do P Domínio <ol><li> Usar o domínio P ~ em 3 mg / ml e 8 mg / ml para a triagem inicial de cristalização. Preparar pelo menos 100 l de domínio P per concentração para telas iniciais com 384 condições de triagem disponíveis comercialmente. Realizar a triagem a 18 ° C em um formato de placa de 96 poços, em que o reservatório contém 100 ul de solução mãe e uma gota é composta de solução mãe de 0,2 uL e 0,2 uL de proteína. </li><li> Repetir e otimizar as condições de cristalização de sucesso. Portanto, use placas de 15 poços que contêm 3 linhas. Configure a primeira linha com uma solução mãe de 100%, a segunda fila com uma solução de 90% mãe e 10% de água, e a terceira fila com uma solução mãe 80% e 20% de água. Use um tamanho de gota de 2 ul (1 ml solução mãe de proteína + 1 ml) e 50081; l de solução-mãe como um volume do reservatório. </li><li> Use condições de cristal otimizados para co-cristalização do domínio P com ligantes. Prepare placas conforme descrito em 6.2. Em vez de 2 ul de tamanho de gota, configurar gotas contendo 1 ul solução mãe, 1 ul de proteína, e 1 ul de ligando numa concentração de 1 mg / ml. </li><li> Recolher conjuntos de dados de um único cristal usando radiação síncrotron. Realizar a substituição molecular utilizando estruturas de domínio P publicados com uma similaridade de sequência alto quanto inicial 6,10-13 busca modelo. Nota: A presença de um ligando mostra-se como blob modelados-un de densidade de elétrons. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li>
<li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li>
<li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li>
<li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li>
<li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+RNA+and+codon+optimization%3A+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li>
<li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li>
<li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+noroviruses%27+fondness+for+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li>
<li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo para a expressão e purificação de domínios P ​​norovírus em alta qualidade e quantidade. Noroviruses não está bem estudada e os dados estruturais são continuamente necessário. Para o nosso conhecimento, a produção de domínio P usando outros protocolos (por exemplo, domínios P marcado com GST) tem sido problemática, até agora, e dados estruturais suficientes sobre a interação norovirus-host tem sido ausente. Com o método descrito aqui, que recentemente contribuiu significativamente...

Noroviruses humanos são a principal causa de gastroenterite aguda em todo o mundo 1. Estes vírus pertencem à família dos Caliciviridae, dos quais existem, pelo menos, cinco géneros, incluindo Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, e Nebovirus. Apesar de seu alto impacto no sistema de saúde e de ampla distribuição, o estudo de norovírus humanos é dificultada pela falta de um sistema de cultura celular robusto. Até à data, não existem vacinas aprovadas ou estratégias antivirais disponíveis. A principal proteína da cãpside norovírus, denominado VP1, pode ser dividido em um domínio (s) e um invólucro (P) de domínio protuberante 2. O domínio P é ligado ao domínio S por uma região charneira flexível (H). O domínio S forma um andaime em torno do ARN viral, enquanto que o domínio P constitui a parte mais externa da cápside viral. O domínio P monta em dímeros biologicamente relevantes quando expressos em bactérias. A P dimer interage com estruturas de carboidratos, denominados antígenos do grupo histo-sangue (HBGAs) que estão presentes como antígenos solúveis na saliva e encontra em determinadas células hospedeiras 3. A interacção do domínio HBGA-P é pensado para ser importante para a infecção 4. De fato, um relatório recente revelou a importância de HBGAs sintéticos ou HBGA expressando bactérias para a infecção por norovírus humana in vitro 5. Estudos actuais sobre a fixação das células de acolhimento de noroviruses são realizados principalmente com partículas semelhantes a vírus (VLPs) que podem ser expressas em células de insecto ou com domínios P recombinantes expressos em Escherichia coli (E. coli). Para entender as interações domínio de HBGA P em resolução atômica, estruturas complexas P domínio de HBGA pode ser resolvido usando cristalografia de raios-X. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a expressão e purificação do domínio P que permite a produção de P no domínio em elevada quantidade e qualidade para ser utilizado para raios X Crystallography. Além disso, este método pode ser aplicado para outros domínios calicivírus P e proteínas não-estruturais. O domínio P tem codões optimizados para E. expressão em E. coli e clonados num vector de transferência do padrão. O domínio P é então re-clonado num vector de expressão que codifica uma poli-histidina (His) tag e uma proteína de ligação a manose (MBP), que são seguidos por um local de clivagem de protease. A P-His-MBP da proteína de fusão do domínio é expressa em E. coli, seguida de três passos de purificação. A proteína de fusão do domínio MBP-His-P é purificado utilizando cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado (IMAC). Em seguida, a proteína de fusão é clivada com rinovírus humano (HRV) -3c protease e o domínio P é separada a partir do MBP-His por um passo adicional de purificação IMAC. Finalmente, o domínio P é purificado utilizando cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). O domínio P purificado pode então ser utilizado para a cristalografia de raios-X. Rastreio de condições de cristalização proteína é performada com kits de rastreio comercialmente disponíveis, utilizando concentrações de proteína de domínio P diferentes. crescimento de cristais é observado e as condições mais promissores são otimizados. Com os métodos aqui descritos, é possível passar do gene para proteína a estrutura dentro de menos de quatro semanas. Portanto, o nosso método de expressão P domínio, purificação e cristalização é adequado para estudar a interação norovirus-host no nível molecular e fornecer dados importantes para auxiliar no up-to-date vacina concepção e drogas rastreio.

<table><tbody><tr><td>Domínio P DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gene Synthesis</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; vector</td><td>A pedido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit</td> <td>de Extração de GelQiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Coluna Coluna de Cromatografia</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2.5 x 10 cm, possível de usar outro tamanho</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>various</td><td>de 10 kDa, 30 kDa e 50 kDa utilizou</td></tr><tr><td>a Eficiência de Subclonagem DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Quimicamente Competente E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Protease</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC coluna</td></tr><tr><td>JCSG Core suites</td><td>Qiagen</td><td>vários</td><td>4 telas com cada 96 poços</td></tr><tr><td>Carboidratos</td><td>Dextra Laboratories, Reino Unido</td><td>vários</td><td>produtos do grupo sanguíneo</td></tr></tbody></table>

produção de domínios salientes norovirus humanos em<em&gt; e. coli</em&gt; para raios-x cristalografia

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

A cápside norovírus é composto de uma única proteína estrutural principal, denominado VP1. VP1 é subdividida em um domínio (s) casca e um domínio saliente (P). O domínio S forma um andaime contíguo em torno do ARN virai, ao passo que as formas de domínio P picos virais no domínio S e contém determinantes de antigenicidade e interacções célula-hospedeiro. O domínio P se liga a estruturas de hidratos de carbono, isto é., Antigénios do grupo histo-sangue, que se pensa ser importante para infecções norovírus. Neste protocolo, nós descrevemos um método para a produção de domínios de alta qualidade norovírus P com rendimentos elevados. Estas proteínas podem então ser utilizados para a cristalografia de raios-X e de ELISA, a fim de estudar a antigenicidade e interacções da célula hospedeira. O domínio P é em primeiro lugar clonado num vector de expressão e, em seguida, expresso em bactérias. A proteína é purificada por meio de três passos que envolvem a cromatografia de afinidade com metal imobilizado de iões e cromatografia de exclusão de tamanho. Dentroprincípio, é possível clonar, expressar, purificar e cristalizar proteínas em menos de quatro semanas, o que torna este protocolo um sistema rápido para analisar linhagens de norovírus emergentes.

O esquema do protocolo descrito está representado na Figura 1. O protocolo de cobre 6 partes principais que incluem a clonagem do gene alvo, a expressão, purificação de três passos, e cristalização. A Figura 2 ilustra o desenho da construção de expressão (CE) e características do vector de expressão pMalc2x. A sequência do local de clonagem múltipla (MCS) do vector pMalc2x mostra locais de clivagem de restrição e da protease. A Figura 3 ...

Aqui, descrevemos um método para expressar e purificar norovirus alta qualidade salientes domínios (P) em E. coli para uso em estudos de cristalografia de raios-X. Este método pode ser aplicado a outros domínios calicivírus P, bem como proteínas não estruturais, isto é., A proteína virai ligada ao genoma (VPg), protease, e polimerase de ARN dependente de ARN (RdRp).

Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em<em&gt; E. coli</em&gt; Para raios-X Cristalografia

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

O objetivo geral do protocolo é a produção e purificação do domínio protuberante do norovírus humano em E.coli, a fim de obter proteína extremamente pura para cristalografia por raios X. Nosso protocolo para expressão, purificação e cristalização de proteínas é rápido, robusto e pode ser utilizado para proteínas estruturais e não estruturais. A vantagem deste protocolo é que nossas proteínas são muito puras e podem formar cristais capazes de difratar até alta resolução.De acordo com nossa experiência, o protocolo pode precisar de ajustes para proteínas menos solúveis. Por exemplo, o meio de cultura ou a temperatura de crescimento durante a expressão proteica podem ser alterados. Para começar, transforme um microlitro do vetor pMalc2x, que codifica a proteína de fusão MBP-His-P, em 15 microlitros de células competentes de E.coli BL21 utilizando um protocolo padrão de transformação.Adicione 600 microlitros de meio SOC às células. Incube por uma hora a 37 graus Celsius. Subcultive as células transformadas em 120 mililitros de LB-ampicilina durante a noite a 160 rpm e 37 graus Celsius.Inocule nove litros de LB-ampicilina com o subcultivo. Incube as células a 37 graus Celsius com agitação a 160 rpm até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja entre 0,4 e 0,6. Posteriormente, reduza a temperatura para 22 graus Celsius por aproximadamente uma hora.É importante aguardar até que a temperatura atinja 22 graus Celsius antes de induzir com uma pequena quantidade de IPTG para permitir a expressão de proteína solúvel. Induza a expressão proteica com 0,66 milimolar de IPTG. Após a indução, cultive as células durante a noite a 22 graus Celsius.Recolha as células por centrifugação. Descarte o sobrenadante e congele o pellet celular a 20 graus Celsius. Prepare os tampões utilizados nas etapas de purificação de proteínas a partir de soluções estoque conforme detalhado no protocolo textual.Descongele o pellet celular do cultivo de nove litros e dissolva em 150 mililitros de solução salina tamponada com fosfato a quatro graus Celsius. Sonique a suspensão celular três vezes durante dois minutos para romper as células. Centrifugue a suspensão celular sonificada para separar os detritos celulares do sobrenadante contendo a proteína de fusão MBP-His-P expressa.Colete o sobrenadante e descarte o pellet. Lave e equilibre uma pasta de 10 mililitros de perlas de agarose com níquel-NTA com tampão contendo 10 milimolares de imidazol em uma coluna de cromatografia. Adicione as perlas de níquel equilibradas ao sobrenadante contendo a proteína de fusão MBP-His-P expressa e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação lenta.Após a incubação, aplique toda a mistura de proteína com microesferas de níquel em uma coluna de cromatografia. Lave lentamente a coluna com cinco VCs de tampões contendo 10 milimolares, 20 milimolares e 50 milimolares de imidazol, respectivamente, a quatro graus Celsius. Elua a proteína de fusão MBP-His-P usando tampão com 250 milimolares de imidazol a quatro graus Celsius.Durante a eluição, verifique a densidade óptica a 280 nanômetros para confirmar a eluição da proteína de fusão. Continue a eluição até que a densidade óptica a 280 nanômetros diminua para aproximadamente 0,1. Trabalhando a quatro graus Celsius, lave as perolas com uma quantidade em excesso de tampão contendo 250 milimolar de imidazol, seguido por tampão contendo 10 milimolar de imidazol.Guarde as perlas para o segundo passo de purificação. Verifique a presença da proteína de fusão MBP-His-P por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio, ou SDS-PAGE, utilizando um gel de poliacrilamida SDS a 12%. Em seguida, concentre a proteína de fusão MBP-His-P eluída até uma concentração final de aproximadamente três miligramas por mililitro.A quantidade de protease necessária para clivar efetivamente o domínio MBP-His-P precisa ser cuidadosamente calculada. Ela depende da quantidade total da proteína de fusão eluída e do resultado da eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Cleave o domínio de fusão MBP-His-P com a protease HRV 3C durante a diálise contra dois litros de tampão contendo 10 milimolares de imidazol, durante a noite a quatro graus Celsius.Dependendo do volume final da proteína concentrada, realize a diálise em uma cassete de diálise ou em tubo de diálise. Equilibre as esferas de níquel que foram reservadas em tampão de imidazol 10 milimolar. Incube a proteína dialisada contendo o domínio P clivado, a proteína MBP e a protease HRV com as esferas de níquel equilibradas por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação lenta.Aplicar a mistura de microesferas de níquel a uma coluna e coletar o fluxo inicial a quatro graus Celsius. Este é o domínio P clivado. Medir a concentração da proteína conforme ela elui da coluna até que a densidade óptica em 280 nanômetros atinja aproximadamente 0,1.O MBP-His deve permanecer ligado às esferas de níquel e o domínio P clivado é eluído no fluxo passante. Verifique a presença do domínio P clivado utilizando SDS-PAGE com gel a 12%, como anteriormente. Após concentrar o domínio P eluído para aproximadamente três miligramas por mililitro, realize diálise durante a noite a quatro graus Celsius contra tampão de filtração em gel para posterior purificação por cromatografia de exclusão por tamanho.Lave as bombas e tubos do sistema de purificação por cromatografia líquida de alta eficiência e pré-equilibre a coluna de cromatografia de exclusão por tamanho com tampão de filtração em gel. Injete o domínio P na coluna a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto, utilizando um superloop ou loop, dependendo do volume da amostra concentrada. Após a conclusão da injeção, aumente a taxa de fluxo para 2,5 mililitros por minuto.À medida que a densidade óptica aumenta e o domínio P sai da coluna, colete frações de 1,5 mililitros. O domínio P geralmente é eluído na forma de um dímero. Após verificar as frações por meio de SDS-PAGE com gel a 12%, reúna apenas as frações mais puras e concentre até aproximadamente três miligramas por mililitro e aproximadamente oito miligramas por mililitro.Utilize o domínio P em aproximadamente três miligramas por mililitro e oito miligramas por mililitro para a triagem inicial de cristalização. Prepare pelo menos 100 microlitros do domínio P por concentração para as triagens iniciais com 384 condições de triagem comercialmente disponíveis. Realize a triagem a 18 graus Celsius em formato de placa de 96 poços, onde o reservatório contém 100 microlitros da solução mãe e uma gota é composta por 0,2 microlitros da solução mãe e 0,2 microlitros da proteína.Optimize as condições bem-sucedidas de cristalização utilizando placas de 15 poços que contêm três linhas. Use 500 microlitros de solução-mãe como volume do reservatório. Prepare a primeira linha com 100% de solução-mãe.A segunda linha com 90% da solução-mãe e 10% de água. E a terceira linha com 80% da solução-mãe e 20% de água. Prepare a gota suspensa com um volume de duas microlitros, misturando volumes iguais de proteína e solução-mãe.Utilize as condições otimizadas de cristalização para realizar a co-cristalização do domínio P com ligantes. Prepare as placas como anteriormente, mas em vez de gotas de dois microlitros, monte gotas contendo um microlitro de solução mãe, um microlitro de proteína e um microlitro de ligante numa concentração de um miligrama por mililitro. É mostrado aqui um resultado representativo de eletroforese SDS-PAGE, demonstrando a quantidade de proteína de fusão MBP-His-P eluída após a primeira etapa de purificação, na qual a proteína de fusão MBP-His-P é purificada utilizando esferas de agarose com níquel-NTA.Após a separação do MBP-His do domínio P clivado, a quantidade do domínio P clivado eluído também é analisada por SDS-PAGE. Após a etapa final de purificação por cromatografia de exclusão por tamanho, a triagem para cristalização resultou em condições otimizadas de cristais. Aqui, é mostrado o padrão de difração de um domínio saliente.Em princípio, é possível clonar, expressar, purificar e cristalizar proteínas em menos de quatro semanas, o que torna este protocolo um sistema rápido para analisar novas cepas de norovírus. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade é mais importante do que a quantidade. Devido à alta qualidade dos domínios P purificados, estudos adicionais são adequados, incluindo imunização para produção de anticorpos, experimentos de RMN e estudos baseados em ELISA.Além disso, o domínio P purificado pode ser utilizado para a formação de complexos com fragmentos de anticorpos e nanocorpos. Após assistir a este protocolo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar e purificar domínios P de norovírus de alta qualidade.

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descreve-se um método para localizar proteínas marcadas por fluorescência em micrografias electrónicas. A fluorescência é inicialmente localizado utilizando foto-activado microscopia localização em cortes ultrafinos. Estas imagens são então alinhadas com micrografias electrónicas da mesma secção.

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

Fonte: Leuthold, M. M., et al. Produção de Domínios Salientes de Norovírus Humano em E. coli para Cristalografia de Raios-X. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra a purificação do domínio P do norovírus humano recombinante usando cromatografia de exclusão de tamanho, destacando a separação da proteína-alvo de impurezas de maior e menor peso molecular com base na acessibilidade diferencial dos poros. O processo é monitorado por absorbância UV e confirmado por meio da análise SDS-PAGE de...

Purificação de proteínas de domínio P recombinante derivadas de bactérias de norovírus humano

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar a ligação de partículas semelhantes a vírus de norovírus humano (VLPs) a bactérias intestinais humanas. As suspensões bacterianas são misturadas com as VLPs e incubadas para permitir a formação de complexos VLP-bactérias. Os complexos são então marcados com anticorpos específicos de VLP marcados com fluoróforo, seguidos de visualização e quantificação baseadas em citometria de fluxo para identificar a porcentagem de bactérias ligadas à VLP.

Um ensaio para quantificar a ligação de VLPs de norovírus humano a bactérias intestinais

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.

Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Aprenda a produzir e purificar o domínio saliente do norovírus humano em E. coli para cristalografia de raios-X. Este protocolo rápido e robusto fornece proteína altamente pura para estudos estruturais e funcionais.

Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em

Explorar mais vídeos