Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

O objetivo geral desses procedimentos é isolar rapidamente neutrófilos altamente purificados de amostras de sangue humano por centrifugação por gradiente de densidade para investigar seu papel na sensibilidade das células do linfoma à terapia do câncer usando dois modelos de cultura de células D e três D. Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre as interações entre o sistema imunológico inato e o câncer, como o papel das respostas de células tumorais mediadas por neutrófilos na terapia do câncer. A principal vantagem da separação do gradiente de densidade é a capacidade de isolar populações de células imunes puras em um curto período de tempo sem expor as células a estímulos que alteram a função.

Para isolar as células leucêmicas primárias e os neutrófilos, comece adicionando 15 mililitros de sangue tratado com EDTA de amostras de pacientes com leucemia linfocítica crônica em tubos individuais estéreis de 50 mililitros. Dilua o sangue com 15 mililitros de RPMI. Em seguida, adicione cuidadosa e lentamente 15 mililitros de solução de gradiente de densidade à temperatura ambiente sob o sangue, tomando cuidado para não misturar as camadas.

Após a separação das células por centrifugação, quatro fases distintas serão visíveis. As plaquetas e o plasma na parte superior, um anel branco de células mononucleares, a solução de gradiente de densidade e os granulócitos e eritrócitos na parte inferior. Usando uma pipeta de pastagem de plástico, primeiro transfira o anel branco das células leucêmicas primárias em um novo tubo de 50 mililitros.

Lave as células com até 50 mililitros de PBS com cálcio e magnésio. E ressuspenda o paladar em cinco mililitros de PBS fresco. Em seguida, adicione mais 45 mililitros de PBS às células e gire as células novamente.

Após a segunda lavagem, ressuspenda o palato em meio RPMI completo. E conte o número de células leucêmicas primárias viáveis. Em seguida, remova as camadas de plasma plaquetário e gradiente de densidade e adicione 25 mililitros de PBS e 25 mililitros de Dextrina em cloreto de sódio à fase eritrocitária do granulócito.

Misture os tubos dez vezes por inversão. Em seguida, deixe as células repousarem por 30 minutos em temperatura ambiente. No final do equilíbrio, transfira a camada superior de neutrófilos pobres dos glóbulos vermelhos para um tubo estéril de 50 mililitros e gire as células.

Ressuspenda o palato em cinco mililitros de PBS e lise os glóbulos vermelhos com 45 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Após 15 minutos no escuro à temperatura ambiente, gire as células novamente e lave o palato em 50 mililitros de PBS. No final da lavagem, ressuspenda as células no meio RPMI completo e conte o número de neutrófilos viáveis.

Diluir ambos os grupos de células para uma concentração de 300.000 células por 50 microlitros de RPMI e dividir as amostras entre o número apropriado de tubos de fax de cinco mililitros. Após a centrifugação, ressuspender os pellets em 50 microlitros de PBS suplementados com FBS. Para determinar a pureza dos subconjuntos de células isoladas, rotule o aliquant das células leucêmicas primárias com anticorpo anti-CD19 humano conjugado ao APC e o aliquant dos neutrófilos purificados com uma mistura de anticorpos anti-humanos, conforme listado na tabela, por 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius.

No final da incubação, lave as células em 500 microlitros de PBS suplementado com FBS e ressuspenda o palato em 200 microlitros de PBS FBS fresco. Em seguida, analise a pureza das populações de células por citometria de fluxo, tendo o cuidado de compensar a cor das amostras. Para co-cultivar as células leucêmicas primárias com os neutrófilos autologistas, consulte 200.000 células por mililitro de células leucêmicas sozinhas ou com neutrófilos autologistas em uma placa de 24 poços em meio RPMI completo.

Misture as células com cuidado. Em seguida, trate as células com o inibidor de tirosina quinase de Brutton por 24 horas a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. No dia seguinte, colete um aliquant das células em um tubo de fax de plástico de cinco mililitros.

Em seguida, gire as células e lave os pellets em um mililitro de FBS PBS. Após a segunda centrifugação, rotular as células com aninoxina cinco e iodeto de propídio de acordo com as instruções do fabricante durante dez minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, analise os neutrófilos e as células leucêmicas primárias por citometria de fluxo usando a estratégia de gating ilustrada.

Para configurar uma co-cultura de três D, adicione 50.000 células b de linfoma RL sozinhas ou misture com células diferenciadas HL60 em tubos estéreis de 15 mililitros. Gire as amostras e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de matriz de membrana basal, usando uma ponta de pipeta de um milímetro com a abertura cortada em dois a três milímetros. Em seguida, incube 300 microlitros de células em cada poço de uma placa de 24 poços por 30 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2.

No final da incubação, adicione um mililitro de meio RPMI completo a cada poço e retorne as culturas threeD à incubadora por mais sete dias com trocas de meio a cada dois dias. No quinto dia, adicione dez nanomolares de incristina às culturas. Após uma semana de cultivo, aspire o meio e lave cada poço duas vezes com um mililitro de PBS gelado.

Em seguida, adicione três mililitros de PBS gelado com EDTA em cada poço e raspe o fundo dos poços com uma ponta de pipeta de 200 microlitros para destacar os géis. Agite o prato suavemente no gelo por 30 minutos. Em seguida, transfira as suspensões celulares para tubos individuais estéreis de 15 mililitros para agitar suavemente no gelo por mais 30 minutos.

Confirme a aparência de uma suspensão celular homogênea. Em seguida, gire as células seguidas por uma lavagem de PBS e ressuspenda os pellets em PBS fresco com FBS. Finalmente, rotule as células com os anticorpos apropriados e corantes de viabilidade conforme demonstrado e analise as células diferenciadas RL e HL60 por citometria de fluxo usando a estratégia de gating ilustrada.

A análise de todos os eventos das populações de células isoladas por citometria de fluxo demonstra que este método de separação resulta em uma população de células leucêmicas primárias de pico único altamente puro que expressa CD19. E uma população de neutrófilos mais de 90% puros positiva para os antígenos comuns de leucócitos CD45 e os antígenos CD15 e CD16 expressos por neutrófilos maduros. A marcha nas células leucêmicas primárias de coculturas de neutrófilos demonstra que os neutrófilos exercem um efeito protetor na sobrevivência celular contra o inibidor de tirosina ibrutinibe com um número significativamente maior de células leucêmicas primárias viáveis em comparação com a cultura de células leucêmicas primárias isoladamente.

As células HL60 diferenciadas são mais estáveis em três culturas D do que os neutrófilos. Após a indução de seu desenvolvimento granulocítico, essas células são menores que as células HL60 indiferenciadas e expressam níveis mais altos de CD11B e CD38. As células HL60 diferenciadas também exibem núcleos multilobados.

Essas células exibem um efeito protetor nas células RL com um número significativamente maior de células RL viáveis em três culturas D co após o tratamento com vincrostina em comparação com células de linfoma tratadas com vincrostina cultivadas isoladamente. Uma vez dominado, o método de centrifugação com gradiente de densidade pode ser concluído em 90 minutos. Após seu desenvolvimento, essas técnicas abriram caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer explorarem o impacto de vários glóbulos brancos na malignidade do tumor em modelos pré-clínicos e amostras de pacientes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar de forma rápida e confiável as células mononucleares e os neutrófilos, analisar o efeito dos neutrófilos na mediação das respostas das células tumorais aos agentes anticancerígenos e configurar uma cocultura de três D.