Name: Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos de sangue humano por centrifugação em gradiente de densidade para investigar seu papel na sensibilidade de células linfomatosas a agentes terapêuticos. Este método permite obter populações puras de células imunes sem alterar sua função.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer (INCa-DGOS-4664).

1. neutrófilos Isolamento e Co-cultura com células leucémicas primárias NOTA: Os procedimentos foram realizados sob a aprovação do comitê de Lyon Hospital Ética com todos os pacientes que assinaram o consentimento informado. <ol><li> Isolamento de células leucémicas primárias e neutrófilos <ol><li> Recolhe tubos de sangue periférico em EDTA (1,8 mg de EDTA por mililitro de sangue) a partir de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crónica (CLL). </li><li> Adicionar a cada 15 ml de sangue para um tubo estéril de 50 ml e dilui-se com 15 ml de RPMI (diluição 1: 1), em seguida, cuidadosamente e lentamente adicionar 15 ml de solução de gradiente de densidade para a parte inferior do tubo, sem misturar as fases. Certifique-se de que a solução do gradiente de densidade é à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 35 min à temperatura ambiente e sem travão. O sangue deve separar-se em quatro fases distintas, como mostrado na Figura 1A, de cima para baixo: plaquetas e plasma, as células mononucleares (Wanel hite), solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos. </li><li> Recolhe-se o anel branco que representa as células leucémicas primárias, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um novo tubo de 50 ml. <ol><li> Encher o tubo com PBS (contém cálcio e de magnésio) até 50 ml no total e centrifugar a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 ml de PBS, em seguida, adiciona-se PBS a 50 ml, no total, e centrifugar a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento com meio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina) para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular. </li></ol></li><li> Aspirar as fases superiores deixando a fase de granulócitos e eritrócitos e adicionar PBS até 25 ml, em seguida, adicione 3% dextrano em 0,9% NaClup a 50 ml no total. Misturar os tubos 10 vezes e mantê-los durante 30 min à temperatura ambiente sem misturar. </li><li> Recolher o RBC-pobres uma camada de neutrófilos superiord colocá-los em um tubo limpo estéril de 50 ml e centrifugar os tubos a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente. Ressuspender cada pellet com 5 ml de PBS, em seguida, adicionar tampão de lise dos glóbulos vermelhos até 50 ml no total. </li><li> Manter os tubos no escuro durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida, centrifugar a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente. Lavam-se as peletes com PBS (PBS adicionar-se até 50 ml no total), em seguida, centrifugar a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as peletes com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular. Manter 3 x 10 5 de cada tipo de célula em 50 ul de PBS-FBS (4%) em 5 ml de tubos de plástico para determinar a pureza do seu isolamento utilizando citometria de fluxo. </li></ol></li><li> Analisar as aparências morfológicas das Populações de células isoladas <ol><li> Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10 4 neutrófilos e 3 x 10 4 células mononucleares em 150 ul de meio RPMI completo. Montar as lâminas de vidro, cartões de filtros e câmaras de amostras na centrífuga Cytospin, garantindo que tele centrifugar é bem equilibrado. </li><li> Colocar cada tipo de célula para dentro da câmara da amostra e cito-centrifugadora a 750 xg durante 10 min à temperatura ambiente Remover as lâminas, placas de filtro, e as câmaras de amostra do centrifugador. Desmontar cuidadosamente, de modo a não danificar as células na lâmina. Descartar cartões de filtros e câmaras de amostras. </li><li> Corar as células utilizando o kit de coloração de Giemsa e manter as lâminas durante 1 hora para secar. Examinar as células ao microscópio com uma ampliação de 100X. </li></ol></li><li> Testar a pureza de células isoladas por FACS <ol><li> Marcar as células leucémicas primárias isoladas com anticorpo CD19 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 6 células). Rotular os neutrófilos purificados com uma mistura de anticorpos anti-humanos listados na Tabela 1 (5? L / 10 6 células). Incubar as células em escuro durante 30 minutos a 4 o C. </li><li> Lavam-se as células com 500 ul de PBS-FBS (4%) a centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à TA. </li><li>Ressuspender cada sedimento em 200 ul de PBS-FBS (4%). </li><li> Analisar num citómetro de fluxo com a seguinte configuração óptica: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (BP 695/40 ), PE (BP 575/26); 633 nm do laser: APC (660/20 BP), a APC-Cy7 (780/60 BP). Garantir a compensação de cor. </li></ol></li><li> Co-cultura de células leucêmicas preliminares com autólogo de neutrófilos <ol><li> Semente de 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primárias, sozinho ou com neutrófilos autólogos na proporção de 1:10 em meio RPMI completo. Para fazer isso, ajustar o número de células por diluição de suspensões de células e adicionar 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primárias para 2 X 10 6 células / ml neutrófilos. Misture com cuidado. </li><li> Adicionar 25 uM de inibidor de tirosina quinase de Bruton (Btk) (Ibrutinib) para as células. Incubar durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Celular de colheita e análise de FACS <ol><li> Collect as células em 5 ml de tubos de plástico para análise FACS e os tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. Lavam-se as peletes com 1 ml de PBS-FBS (4%), em seguida, centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender em peletes Anexina V e PI utilizando o kit comercial e incubar as células na obscuridade durante 10 min a RT. Analisar num citómetro de fluxo usando a estratégia de propagação da Figura 2A e a configuração óptica seguinte: laser de 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Garantir a compensação de cor. </li></ol></li></ol> 2. Diferenciação de Células HL60 ao longo do Granulocítica Caminho e Sua Coculture com células RL linfoma B em modelo 3D <ol><li> Diferenciação de promielocítica humana (HL60) Células em Células de neutrófilos semelhante <ol><li> Ajustar o número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml, em seguida adicionar 1 uM de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO para induzir a diferenciação. Semente cada 3 x 10 5 </saté&gt; células HL60 por poço em placas de 48 poços depois incubar durante 48 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Mais tarde, recolher as células e centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender as células com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular. </li><li> Depois dilui-se a suspensão de células em meio RPMI completo para ajustar o número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml e induzir novamente a sua diferenciação pela adição de 1 ^ M de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO. Sementes em cada 3 x 10 5 células HL60 por poço em placas de 48 poços e incuba-se durante mais 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Análise de diferenciação de HL60 (células HL60 diff) <ol><li> Recolher as células e centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular. </li><li> Para analisar as mudanças na expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Coloque cada 3 x 10 5 </sup&gt; células indiferenciadas HL60 (a partir de cultura de células) e 3 x 10 5 células HL60 diff em 5 mL de tubos de plástico para análise FACS e os tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender as pelotas em 50 ul de PBS-FBS (4%). Rotular as células com anti-CD11b humano conjugados com AF700 ou CD38 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 6 células). Incubar as células em escuro durante 30 minutos a 4 o C. </li><li> Lava-se com 500 ul de PBS-FBS (4%), em seguida, centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender as pelotas em 200 ul de PBS-FBS (4%). </li><li> Analise no citómetro de fluxo usando a estratégia de propagação da Figura 3A e a configuração óptica seguinte: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb); 633 nm do laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP). </li><li> Para testar as alterações morfológicas no diff HL60, imobilizar as células em lâminas de vidro para exame microscópico. <ol><li> Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10 <sup&gt; 4 células indiferenciadas HL60 (a partir de cultura de células) e 3 x 10 4 dif HL60 em 150 ul de meio completo RPMI. Montar as placas de vidro, placas de filtro, e as câmaras de amostra no centrifugador Cytospin, assegurando que a centrífuga é equilibrada. </li><li> Colocar cada tipo de célula para dentro da câmara da amostra e cito-centrífuga a 1500 rpm durante 10 min à temperatura ambiente. Remova os slides, cartões de filtros e câmaras de amostras da centrifugadora. Desmontar cuidadosamente, de modo a não danificar as células na lâmina. Descartar cartões de filtros e câmaras de amostras. </li><li> Corar as células utilizando o kit de coloração de Giemsa e manter as lâminas durante 1 hora para secar. Examinar as células ao microscópio com uma ampliação de 100X. </li></ol></li></ol></li><li> 3-dimensional Cultura (3D) NOTA: Certifique-se de que os materiais utilizados nesta experiência são frios e o experimento está ocorrendo no gelo. <ol><li> Ressuspender cada 5 x 10 4 células RL, quer sozinhos ou misturados com Diff HL60 </em&gt; Em relação RL: HL60 dif 1:10, com a matriz da membrana basal de 300 ul utilizando uma ponta de pipeta ml cortado com uma tesoura estéril, de modo a alargar a abertura de cerca de 2 a 3 mm. Evitar bolhas durante este passo. </li><li> Sementes em cada 300 ul de suspensão de células / poço em placas de 24 poços. Evitar bolhas durante este passo. Incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C com 5% de CO 2, em seguida, adicionar 1 ml de meio completo RPMI a cada poço e incubar durante 7 dias a 37 ° C com 5% de CO 2. Mudar o meio de dois em dois dias. Adicionar 10 nM vincristina no dia 5. </li></ol></li><li> Análise FACS <ol><li> Após 7 dias de cultura, Aspirar o meio e lava-se cada cavidade com 1 mL de PBS arrefecido em gelo, duas vezes. Adicionar 3 ml / poço de PBS gelado-EDTA (5 mM). Retire o gel a partir do fundo da cavidade por raspagem usando a parte inferior da ponta da pipeta de 200 uL. Agitar ligeiramente a placa em gelo durante 30 min. </li><li> Transferir suspensão de células em estéril tubo de 15 ml e agitar os tubos suavemente sobre ice durante mais 30 min. Verifique se o aparecimento de suspensão celular homogênea. (Se não for o caso, em seguida, agitar as células durante mais tempo ou adicionar mais PBS-EDTA). </li><li> Centrifugar os tubos a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Lavam-se as peletes com PBS, depois, centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender com PBS-FBS (4%) e rotular com anticorpo CD19 anti-humano conjugado com PE-Cy7 e anticorpo CD38 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 6 células). Incubar no escuro durante 30 minutos a 4 o C. </li><li> Lava-se com 500 ul de PBS-FBS (4%), em seguida, tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. Volte a suspender as células com anexina V e PI usando kit comercial. </li><li> Analisar em citômetro de fluxo usando a estratégia de selecção de Figura 4A e a seguinte configuração óptica: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm do laser: APC (660/20 BP). Garantir a compensação de cor. </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Descrito aqui, um protocolo eficaz, simples, rápido e barato para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano com elevada pureza utilizando a abordagem de centrifugação em gradiente de densidade e nas mesmas células mononucleares passo também são separados e recuperados. As populações de células isoladas são ≥90% puro. Vários métodos estão disponíveis para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano. Estes incluem métodos semelhantes utilizando gradientes descontínuos <...

Células imunitárias inatas constituem uma proporção essencial das células dentro do microambiente do tumor e têm sido associados com a malignidade de tumores em pacientes e de modelos animais de cancro 1. Recentemente, tornou-se mais amplamente apreciado que as respostas imunitárias crónicas desempenham papéis críticos na promoção da progressão do tumor, metástase e resistência às quimioterapias 2. Os macrófagos são células imunes inatos importantes que foram mostrados para regular directamente a resposta das células de tumor à quimioterapia 3,4. No entanto, o papel dos neutrófilos, os principais intervenientes no sistema imunitário inato, na regulação da resposta do tumor ao tratamento anti-cancro não é conhecido. Os objectivos destes protocolos são a utilização de um método rápido e credível para separar os neutrófilos a partir de amostras de sangue CLL do paciente e para diferenciar células HL60 ao longo da via granulocitica, a fim de estudar o seu papel na regulação da sensibilidade de células de linfoma de agentes anti-linfoma. 5 e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores 6. Os neutrófilos têm um papel essencial no aumento de respostas imunes inatas eficazes para além das funções efectoras variáveis ​​em várias condições patológicas 7. Por conseguinte, um método rápido e credível para isolar os neutrófilos a partir de outras células sanguíneas, tais como o método de separação por gradiente de densidade, é necessário para os estudos in vitro. Usando este método para isolamento de neutrófilos irá facilitar a investigação sobre as funções imunológicas mediadas por neutrófilos in vivo e ex vivo. A capacidade de obter populações puras de neutrófilos é um primeiro passo importante para a investigação de pacientes com doenças imunológicas 8. Densidade método de separação por gradiente é uma técnica ideal em que é obtido um elevado rendimento de células. o metod envolve a adição de uma solução de gradiente de densidade na parte inferior de um tubo contendo sangue humano diluído seguido por centrifugação a 300 g durante 35 min, sem ruptura. O anel de células mononucleares é exibida na interface e os neutrófilos residir por baixo da primeira. Este método tem vantagens significativas em relação a outros métodos disponíveis, tais como kits de isolamento de neutrófilos que são muito mais caros 9. Além disso, o isolamento de neutrófilos do sangue humano por kits comerciais utilizando anticorpos dirigidos para um marcador de superfície específico para os neutrófilos humanos, aumentam o risco de activação ou diferenciação celular. Densidade método de separação por gradiente permite o isolamento de neutrófilos dentro de um curto período de tempo. Dentro do mesmo passo, as células mononucleares são também separados e recuperados. É uma técnica fundamental em que um elevado rendimento de células puras obtém-se, a fim de alcançar a integridade funcional. A fim de imitar o tumor microenvironment, foram realizados experimentos em 3D. Dado a curta semi-vida dos neutrófilos in vitro, as experiências 3D com neutrófilos humanos frescos não são conclusivos. Por este motivo, as células promielocíticas (HL60) são induzidas a diferenciar-se em células de neutrófilos semelhante utilizando os indutores da diferenciação sulfóxido de dimetilo (DMSO) e ácido retinóico (RA). Usando células HL60 diferenciadas (HL60 diff) vai evitar ter diferentes respostas dos neutrófilos, devido ao isolamento de diferentes doadores. Em 3D vitro modelos de cultura representam um estágio intermediário entre modelos in vitro 2D e modelos in vivo. Na cultura 2D, as células se espalhar sobre a superfície de plástico formando anexos não naturais de células a proteínas desnaturadas que são depositados sobre essa superfície sintética. Por outro lado, as células de cultura na forma 3D anexos célula-célula naturais, uma vez que as células e a matriz extracelular que são sintetizar o material natural ao qual eles estão ligados.Por esta razão, os modelos de co- cultura 3D, especialmente entre as células cancerosas e outros tipos de células, têm sido muito útil para indicar a sua contribuição para o crescimento do tumor, angiogénese e metástases. Como resultado, as culturas 3D fazer a cultura de células de imitar as condições fisiológicas que existem in vivo 10.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS contém cálcio e magnésio)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-alanil-L-glutamina (L-Glutamina)</td><td>Life technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina (Pen Strep)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tirosina quinase (Btk) de Bruton (Ibrutinibe)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristina&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matriz de membrana de base&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Colocado a 4 oC durante a noite (O/N) antes do dia do experimento</td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Euromedex</td>Kit de coloração <td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Anexando V-FLOUS&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp; 988&nbsp; 549&nbsp; Kit 001</td><td></td></tr><tr><td>RAL 555 Kit de coloração Giemsa modificada</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>Citometria de fluxo LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscópio DMR-XA</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 Cell Contador de Viabilidade</td><td>Nexcelom&nbsp; Biociência</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Os neutrófilos são o tipo mais abundante (40% a 75%) de glóbulos brancos e estão entre as primeiras células inflamatórias a migrar para o local da inflamação. Eles são atores-chave no sistema imunológico inato e desempenham papéis importantes na biologia do câncer. Os neutrófilos têm sido propostos como mediadores chave da transformação maligna, progressão tumoral, angiogênese e na modulação da imunidade antitumoral; através da liberação de fatores solúveis ou de sua interação com células tumorais. Para caracterizar as funções específicas dos neutrófilos, um método rápido e confiável é cobiçado para o isolamento in vitro de neutrófilos do sangue humano. Aqui, um método de separação por gradiente de densidade é demonstrado para isolar neutrófilos e células mononucleares do sangue. O procedimento consiste em estratificação da solução de gradiente de densidade, como Ficoll, cuidadosamente acima do sangue diluído obtido de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crônica (LLC), seguida de centrifugação, isolamento da camada mononuclear, separação de neutrófilos de hemácias por dextrana e lise de eritrócitos residuais. Este método demonstrou isolar neutrófilos ≥ 90 % de pureza. Para imitar o microambiente tumoral, experimentos tridimensionais (3D) foram realizados usando matriz de membrana basal, como Matrigel. Dada a meia-vida curta dos neutrófilos in vitro, experimentos 3D com neutrófilos humanos frescos não podem ser realizados. Por esta razão, as células HL60 promielocíticas são diferenciadas ao longo da via granulocítica usando os indutores de diferenciação dimetilsulfóxido (DMSO) e ácido retinóico (RA). O objetivo de nossos experimentos é estudar o papel dos neutrófilos na sensibilidade das células do linfoma aos agentes antilinfoma. No entanto, esses métodos podem ser generalizados para estudar as interações de neutrófilos ou células semelhantes a neutrófilos com uma grande variedade de tipos de células em diferentes situações.

Densidade método de separação por gradiente descrito aqui fornece as células leucémicas primárias e neutrófilos não estimulados isolados a partir do sangue de pacientes com LLC Figura 1A representa as diferentes camadas de sangue obtidas após centrifugação em gradiente de densidade (de cima para baixo:. Plaquetas e plasma, anel branco representam as células mononucleares, solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos). Figura 1B e 1C most...

Os neutrófilos são o tipo mais abundante de glóbulos brancos. O isolamento de neutrófilos do sangue humano pelo método de separação por gradiente de densidade e a diferenciação de células promielocíticas humanas (HL60) ao longo da via granulocítica são descritos aqui; testar seu papel na sensibilidade das células do linfoma aos agentes antilinfoma.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

O objetivo geral desses procedimentos é isolar rapidamente neutrófilos altamente purificados de amostras de sangue humano por meio de centrifugação em gradiente de densidade, a fim de investigar seu papel na sensibilidade das células linfomatosas à terapia contra o câncer, utilizando modelos de cultivo celular em duas D e três D. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as interações entre o sistema imunológico inato e o câncer, como, por exemplo, qual é o papel das respostas mediadas por neutrófilos nas células tumorais durante a terapia contra o câncer. A principal vantagem da separação em gradiente de densidade é a capacidade de isolar populações puras de células imunes em um curto espaço de tempo, sem expor as células a estímulos que alterem sua função.Para isolar as células leucêmicas primárias e os neutrófilos, comece adicionando 15 mililitros de sangue tratado com EDTA proveniente de amostras de pacientes com leucemia linfocítica crônica em tubos estéreis individuais de 50 mililitros. Dilua o sangue com 15 mililitros de RPMI. Em seguida, adicione cuidadosa e lentamente 15 mililitros de solução de gradiente de densidade à temperatura ambiente sob o

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de neutrófilos citotóxicos de alta densidade e neutrófilos de baixa densidade do sangue de um camundongo portador de tumor por centrifugação descontínua com gradiente de sacarose.

Isolamento de neutrófilos citotóxicos de sangue de camundongo portador de tumor

Este vídeo demonstra um ensaio que investiga o papel das células semelhantes a neutrófilos na proteção das células do linfoma contra a citotoxicidade de agentes quimioterápicos. Uma co-cultura 3D, consistindo de linfoma e células semelhantes a neutrófilos, é estabelecida e exposta à vincristina - uma droga quimioterápica. O contato direto com as células semelhantes aos neutrófilos induz uma regulação positiva de proteínas antiapoptóticas nas células do linfoma, promovendo assim sua...

Determinando o papel das células semelhantes a neutrófilos na sensibilidade das células do linfoma a um medicamento de teste

Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.

A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

Este protocolo descreve a dissociação rápida não enzimática de fragmentos de tecido humano fresco para avaliação qualitativa e quantitativa de células CD45+ (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Além disso, o sobrenadante obtido do homogeneizado de tecido primário pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

O protocolo descrito aqui representa um método fácil e reprodutível que emprega cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo de purinas em células de leucemia linfocítica crônica (LLC) cultivadas em diferentes condições.

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Este protocolo detalha um método para o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro, casacos de buffy ou membranas de leucemia, alcançando bom rendimento, alta pureza e ativação celular mínima. Utilizamos purificação de gradiente, sedimentação de glóbulos vermelhos (RBC) e lise RBC para obter uma preparação de neutrófilo de alta qualidade/pureza.

Isolamento de neutrófilos humanos de whole blood e buffy coats

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Aqui, fornecemos uma abordagem confiável para isolar neutrófilos de baixa e normal densidade de sangue total usando isolamento magnético (seleção negativa) e meio de gradiente de densidade descontínuo. Ele garante o isolamento intocado de células de alta pureza (≥93%), facilitando a análise precisa a jusante das subpopulações de neutrófilos, cruciais para entender seus papéis na saúde e na doença.

O Isolamento e Caracterização de Neutrófilos de Baixa e Densidade Normal do Sangue Total

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Aprenda a isolar neutrófilos de sangue humano por centrifugação em gradiente de densidade para investigar seu papel na sensibilidade de células linfomatosas a agentes terapêuticos. Este método permite obter populações puras de células imunes sem alterar sua função.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

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