Name: Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a colher seletivamente leucócitos marginantes-pulmonares de ratos e camundongos usando perfusão forçada. Esta técnica isola células da endotelina capilar pulmonar para estudos imunológicos precisos.

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Os autores e este trabalho foram apoiados pelo NIH / NCI conceder # R01CA172138 (a SBE).

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv. 1. Protocolo Rat <ol><li> preparativos <ol><li> Organizar 2 borboleta 21 agulhas G. Opcionalmente, prepare 2 borboleta 21 g agulhas gumes contundentes mediante a apresentação da borda afiada da agulha. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos: 2 pares de tesouras, fórceps embotados-gumes, hemostática, fórceps dente-de tecidos esterilizadas por autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco). </li><li> Prepare heparinizado PBS (30 unidades / ml) por adição de 30 unidades de heparina por ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS 1x). Use a RT. 35 ml é o volume mínimo necessário por animal. </li><li> Transmitir heparinizado PBS para as linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para evitar bolhas de ar. </li></ol></li><li> Perfusão dos Pulmões e recolha de MP-leucócitos <ol><li> Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Confirmar eutanásia por cessação de monitorização de respiração. </li><li> Após interrupção da respiração, abra imediatamente as cavidades peritoneal e no peito, usando a tesoura estéreis e pinças dente de tecidos. Realizar uma incisão abdominal na linha média ao longo do abdómen até o processo xifóide. </li><li> Levante o esterno usando a pinça, cuidadosamente cortar a caixa torácica em ambos os lados, sem perfurar qualquer órgão interno ou grandes vasos sanguíneos. Fixe uma pinça hemostática sobre o esterno, e rostralmente dobrar a caixa torácica para expor o complexo cardiopulmonar. </li><li> Inserir uma agulha de borboleta dentro do ventrículo direito do coração, e no prazo de, aproximadamente, um minuto recolher o volume máximo de sangue para uma seringa (~ 6 ml a partir de 250 g de origem animal). </li><li> Prender a veia cava com uma pinça hemostática para evitar trás perfusão do fígado (ver discussão). </li><li> Segure a agulha borboleta dentro do ventrículo direito ao substituir a seringa contendo o sangue com o tubo de saída do pbomba eristaltic. </li><li> Inserir uma segunda agulha borboleta ligada a uma seringa de 5 mL de colheita para o ventrículo esquerdo, evitando a penetração do septo interventricular. </li><li> Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de cerca de 5 ml / min e recolhem suavemente para dentro da seringa os primeiros ml de perfusato que estão contaminados com sangue. Continue até que a cor perfusato muda de escuro para vermelho pálido. (Descartar o perfuste contaminados com sangue). </li><li> Sem abandono da bomba peristáltica, rapidamente substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolher 20 ml de perfusato pulmão empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 7 ml / min). monitorizar continuamente o fluxo de perfundido para a seringa de recolha, evitando ao mesmo tempo a formação de vácuo. </li><li> Cessar o fluxo da bomba peristáltica. </li></ol></li><li> leucócitos Extração <ol><li> Centrifuga-se o perfusado durante 10 min a 400 x g. </li><li> Aspirar o fluido. </li><li>Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido. Repita esta etapa duas vezes. O uso de PBS ou meio depende da consequente utilização da amostra. </li><li> Adicionar 20 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido. </li><li> Reconstituir as células na concentração desejada, com base na utilização da amostra (FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Rato Protocolo <ol><li> preparativos <ol><li> Organizar 2 borboleta 25 agulhas G. Opcionalmente, prepare 2 borboleta 25 g agulhas gumes contundentes mediante a apresentação da borda afiada da agulha. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos: 2 pares de tesouras, fórceps embotados-gumes, hemostática, fórceps dente-de tecidos esterilizadas por autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco). </li><li> Prepare heparinizado PBS (30 unidades / ml) por adição de 30 unidades de heparina por ml de solução de PBS 1x. Use a RT. 25 ml é o volume mínimo necessário por animal. </li><li> streestou heparinizado PBS para as linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para evitar bolhas de ar. </li></ol></li><li> Perfusão dos Pulmões e recolha de MP-leucócitos <ol><li> Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Confirmar eutanásia por cessação de monitorização de respiração. </li><li> Após interrupção da respiração, abra imediatamente as cavidades peritoneal e no peito, usando a tesoura estéreis e pinças dente de tecidos. Realizar uma incisão abdominal na linha média ao longo do abdómen até o processo xifóide. </li><li> Levante o esterno usando a pinça, cuidadosamente cortar a caixa torácica em ambos os lados, sem perfurar qualquer órgão interno ou grandes vasos sanguíneos. Fixe uma pinça hemostática sobre o esterno, e rostralmente dobrar a caixa torácica para expor o complexo cardiopulmonar. </li><li> Prender a veia cava com uma pinça hemostática para evitar trás perfusão do fígado (ver discussão). </li><li> Inserir uma agulha borboleta ligado ao tubo de saída da bomba peristáltica para a direita ventricle do coração, e uma segunda agulha borboleta ligada a uma seringa de 2 ml de colheita para o ventrículo esquerdo do coração, avoidingpenetration do septo interventricular. </li><li> Ligue a bomba a uma velocidade de aproximadamente 2 ml / min e recolher os primeiros ml de perfusato contaminados com sangue na seringa a colheita até que o perfusato muda de escuro para vermelho pálido (Descartar o perfuste contaminados com sangue). </li><li> Sem abandono da bomba peristáltica, rapidamente substituir a 2 ml de seringa de colheita com uma seringa de 10 ml de colheita e recolher 10 ml de perfusato pulmão empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorizar continuamente o fluxo de perfundido para a seringa de recolha, evitando ao mesmo tempo a formação de vácuo. </li><li> Cessar o fluxo da bomba peristáltica. </li></ol></li><li> leucócitos Extração <ol><li> Centrifuga-se o perfusado durante 10 min a 400 x g. </li><li> Aspirar o fluido. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400xg durante 10 min, e aspirar o fluido. Repita este passo três vezes. O uso de PBS ou meio depende da consequente utilização da amostra. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido. </li><li> Reconstituir as células na concentração desejada, com base na utilização da amostra (FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método aqui apresentado permite a colheita selectiva e estudo da população única de MP-leucócitos. Em comparação com circulante ou leucócitos esplénicas, a população MP é caracterizada por uma composição distinta de subpopulações de leucócitos, níveis de activação mais elevadas, maior libertação de várias citocinas, e mais elevados os níveis de mRNA de citocinas pró- e anti-inflamatórios 2,3. Especificamente, mostraram que as células NK-MP são mais citotóxicos do que as células circulatórias NK contra vária...

Os leucócitos aderentes para os capilares dos pulmões (isto é, marginating-pulmonar (MP) leucócitos) foram 1 mostrado exibir composição distinta de leucócitos e a actividade única em comparação com os leucócitos a partir de outros compartimentos do sistema imunológico (por exemplo, circulação, do baço, da medula óssea) 2- 4. Por exemplo, exposição de MP-leucócitos maior células assassinas naturais (NK) a citotoxicidade contra diversas células tumorais, em comparação com células circulantes e esplénicos NK, bem como os níveis de RNA mensageiro (mRNA) diferenciadas e aumento da secreção de citoquinas pró-inflamatórias e anti. A composição das células também é diferenciado a partir de leucócitos circulantes como MP-leucócitos têm uma proporção mais elevada de imunidade inata / adaptativa em comparação com os leucócitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de MP-leucócitos, a fim de estudar este compartimento imunológica importante e original (população de células), e a elucIdate o impacto das diversas manipulações (por exemplo, ativação imune) sobre essas células específicas. Para compreender o significado deste população original, é importante notar que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula através de funções in vivo de imunidade mediada por células (CMI). Esta capacidade é evidente, apesar da falha precedente do sistema imunitário para controlar o tumor primário, e suportado por um amplo evidências in vivo em doentes com cancro e em modelos animais 5. Mais importante, estes resultados são muitas vezes inconsistentes com estudos in vitro e ex vivo, que reportam que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade por leucócitos em amostras de sangue em circulação a partir de seres humanos e animais (medido por ensaios de citotoxicidade) 6,7. Esta discrepância pode ser atribuída à existência in vivo, de populações de leucócitos distintas, tais como o supramencionado população de leucócitos MP e, especificamente, a sua subpopulação de células NK activadas 3. Com efeito, as células singeneicas de tumor (MADB106), que se verificou ser resistente à circulante e leucócitos esplénicas, foram mostrados para serem lisadas por células NK-MP 3,8. Assim, as células &#39;&#39; resistentes a NK-alegadamente MADB106 que metastizam para os pulmões de ratos fischer344 (F344) são controlados por células NK-MP, mas não por células NK circulantes ou esplénicas, que são vulgarmente estudada, dada a sua facilidade de acesso. Purificada e activas MP-leucócitos são inacessíveis através dos métodos de colheita padrão de leucócitos a partir dos pulmões, os quais são baseados na moedura de tecido pulmonar ou degradação biológica 9. A nossa abordagem tem duas vantagens principais em comparação com abordagens de processamento de tecidos. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente MP-leucócitos, separando-os de outras células que se originam a partir do parênquima pulmonar, intersticial e compar bronco-alveolartimentos. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade e o meio fisiológico de MP-leucócitos, ao contrário da moagem e processamento biológico abordagens que danificam as células, alteram a sua morfologia, e induzem a produção e libertação de vários factores que modulam a actividade imunológica e especificamente suprimem NK citotoxicidade 10. Os pulmões são um dos principais alvos de metástase do câncer e para várias doenças infecciosas. Todas as células malignas circulantes e células infectadas passar através dos capilares pulmonares, onde eles precisam deformar e interagir com as células endoteliais capilares e leucócitos residentes. Sob estas condições, as células circulantes podem ser facilmente alvo de MP-leucócitos residentes. Parece, portanto, biologicamente vantajoso ter leucócitos activados neste compartimento imune, e é importante para estudar esta MP-população única em diferentes configurações biológicos, experimentais, e clínicos. É digno de nota que syactivação stemic imune por vários-resposta-modificadores biológicos (por exemplo, ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) ter mostrado activar MP-leucócitos mais de leucócitos circulantes 3, 8,11.

<table><tbody><tr>Bomba <td></td><td></td><td></td><td>peristáltica Autoclud</td></tr><tr><td>Agulha borboleta</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Agulha borboleta</td><td>OMG</td><td></td><td>21G * 3/4 "</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td> de <td>seringa</td> Pic <td>1 ml</td></tr> Solução de <tr><td>seringa</td><td>Pic</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Solução de seringa</td><td>Pic 5</td><td></td><td>ml</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Solução Pic</td><td>10 ml</td>Seringa Solução Pic 25 ml Pinça de borda romba Tesoura hemostático Pinça de tecido Heparina sódica mucosa suína (sem conservativos)Sigma Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

colheita seletiva de marginating-pulmonar leucócitos

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Os leucócitos pulmonares marginados (MP) são leucócitos que aderem ao endotélio interno dos capilares pulmonares. Os leucócitos MP demonstraram exibir composição e características únicas em comparação com os leucócitos de outros compartimentos imunológicos. As evidências sugerem maior citotoxicidade das células natural killer e um perfil pró e anti-inflamatório distinto da população de leucócitos MP em comparação com os imunócitos circulantes ou esplênicos. O método aqui apresentado permite a colheita seletiva de leucócitos MP por perfusão forçada dos pulmões em camundongos ou ratos. Em contraste com outros métodos usados para extrair leucócitos pulmonares, como trituração de tecidos e degradação biológica, esse método produz exclusivamente leucócitos dos capilares pulmonares, não contaminados com células parenquimatosas, intersticiais e bronco-alveolares. Além disso, a técnica de perfusão preserva melhor a integridade e o meio fisiológico dos leucócitos MP, sem induzir respostas fisiológicas devido ao processamento tecidual. Esta população única de leucócitos MP está estrategicamente localizada para identificar e reagir a células circulantes anormais, pois todas as células malignas circulantes e células infectadas são detidas ao passar pelos capilares pulmonares, interagindo fisicamente com células endoteliais e leucócitos residentes. Assim, a colheita seletiva de leucócitos MP e seu estudo sob várias condições podem avançar nossa compreensão de seu significado biológico e clínico, especificamente no que diz respeito ao controle de células aberrantes circulantes e doenças relacionadas ao pulmão.

A exposição MP-compartimento uma composição de leucócitos subconjunto diferente em comparação com leucócitos circulantes. Usando a análise de citometria de fluxo, as subpopulações de leucócitos foram identificados e quantificados para caracterizar a composição de ambas as circulante e leucócitos MP. Granulócitos e linfócitos foram identificados com base na frente eo lado espalha. Dentro dos linfócitos, NKRP-1 células vivas foram identificadas como células NK, CD3 + ...

Os leucócitos pulmonares marginantes exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos a coleta seletiva dessa subpopulação de leucócitos pulmonares, por perfusão forçada dos pulmões em ratos e camundongos. Os leucócitos pulmonares marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças transmitidas pelo sangue e relacionadas ao pulmão.

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a perfusão forçada de pulmões de camundongo ou rato para a coleta seletiva de leucócitos pulmonares marginais, que aderem ao endotélio interno dos capilares pulmonares. Este método permite o estudo dessa população específica de leucócitos, que exibe características únicas e funções hematológicas distintas. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece leucócitos exclusivamente provenientes dos capilares pulmonares, excluindo células dos compartimentos parenquimatosos, intersticiais e broncoalveolares.Demonstrando este procedimento, estarão Liat Sorski e Lee Shaashua, duas estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, faça passar PBS heparinizado pelas tubulações da bomba peristáltica e pelas agulhas tipo borboleta para remover quaisquer bolhas de ar. Em seguida, imediatamente após a cessação da respiração, utilize tesouras estéreis e pinças de tecido dentadas para abrir as cavidades peritoneal e torácica da rata eutanasiada, realizando uma incisão abdominal mediana até o processo xifoide.Em seguida, use a pinça para levantar o esterno e corte cuidadosamente a caixa torácica em ambos os lados. Prenda um hemostático no esterno e dobre a caixa torácica em direção rostral para expor o complexo cardiopulmonar. Em seguida, insira uma agulha tipo borboleta no ventrículo direito do coração e colete a quantidade máxima de sangue possível.Quando todo o sangue tiver sido coletado, prenda a veia cava com uma pinça hemostática para evitar a perfusão reversa do fígado. Em seguida, segurando a agulha tipo borboleta dentro do ventrículo direito, substitua a seringa de sangue pela tubulação de saída da bomba peristáltica e insira uma segunda agulha tipo borboleta, conectada a uma seringa de coleta de cinco mililitros, no ventrículo esquerdo. Agora, ligue a bomba peristáltica em uma velocidade de aproximadamente cinco mililitros por minuto e colete suavemente os primeiros mililitros do perfusato contaminado com sangue na seringa de coleta até que o perfusato mude de cor escura para vermelho pálido.Em seguida, sem interromper a bomba, substitua rapidamente a seringa de colheita de cinco mililitros por uma seringa de colheita de 20 mililitros e colete 20 mililitros do perfusato pulmonar para obter os leucócitos marginais pulmonares do rato a uma taxa de sete mililitros por minuto. Observe a descoloração gradual dos pulmões, de vermelho pálido a branco transparente, indicando uma perfusão bem-sucedida. Quando todo o volume de perfusato tiver sido coletado, interrompa o fluxo da bomba peristáltica e transfira o perfusato coletado para um tubo.Em seguida, centrifugue o perfusato e aspire o sobrenadante. Passe PBS heparinizado pelas tubulações da bomba peristáltica e pelas agulhas tipo borboleta para remover quaisquer bolhas de ar. Para coletar leucócitos pulmonares marginais de camundongo, imediatamente após a cessação da respiração, use tesoura estéril e pinça de tecido dentada para abrir as cavidades peritoneal e torácica realizando uma incisão mediana abdominal até o processo xifoide.Em seguida, utilize pin&ccedil;as para levantar o esterno e corte a caixa tor&aacute;cica em ambos os lados. Prenda o esterno com uma pin&ccedil;a hemost&aacute;tica e dobre a caixa tor&aacute;cica em dire&ccedil;&atilde;o rostral para expor o complexo cardiopulmonar. Clamp a veia cava com uma pin&ccedil;a hemost&aacute;tica para evitar a perfus&atilde;o retr&oacute;grada do f&iacute;gado e insira a agulha de borboleta no ventr&iacute;culo direito do cora&ccedil;&atilde;o.Em seguida, segurando a agulha tipo borboleta dentro do ventrículo direito, conecte a agulha tipo borboleta ao tubo de saída da bomba peristáltica e insira uma segunda agulha tipo borboleta, ligada a uma seringa de coleta de dois mililitros, no ventrículo esquerdo. Ligue a bomba em uma velocidade de aproximadamente dois mililitros por minuto. Colete suavemente o primeiro mililitro do perfusato contaminado com o sangue na seringa de coleta até que o perfusato mude de vermelho escuro para vermelho pálido.Em seguida, sem interromper a bomba peristáltica, substitua rapidamente a seringa de colheita de dois mililitros por uma seringa de colheita de 10 mililitros e colete 10 mililitros do perfusato pulmonar a uma taxa de perfusão de quatro mililitros por minuto. Observe a descoloração gradual dos pulmões, de vermelho pálido a branco transparente, indicando uma perfusão bem-sucedida. Quando todo o perfusato pulmonar tiver sido coletado, interrompa o fluxo da bomba peristáltica e transfira o perfusato coletado para um tubo.Em seguida, centrifugue o perfusato e aspire o sobrenadante. O compartimento pulmonar margina apresenta uma composição distinta de subpopulações de leucócitos em comparação com a observada para leucócitos circulantes. De fato, imunócitos inatos, incluindo granulócitos, monócitos e células matadoras naturais, constituem mais de 50% da população de leucócitos pulmonares marginais.Em comparação com menos de 30% do compartimento de células circulantes. Em contraste, as populações de células T e células dendríticas são encontradas em porcentagens menores no compartimento pulmonar marginais em comparação com as células circulantes. Um percentual três vezes maior de grandes células matadoras naturais está presente no compartimento pulmonar marginais do que no compartimento de células circulantes, embora o número total de células matadoras naturais seja geralmente semelhante.Além disso, a capacidade dos linfócitos natural killer do compartimento pulmonar marginais de lisar células tumorais é maior do que a dos linfócitos natural killer circulantes, conforme medido por um ensaio padrão de liberação de cromo contra pelo menos duas linhagens celulares tumorais diferentes. Além disso, a estimulação imune por meio da administração in vivo de Poly I:C produz um impacto mais acentuado na citotoxicidade dos linfócitos natural killer pulmonares marginais do que nos linfócitos natural killer circulantes quando são utilizadas células-alvo MADB106. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em poucos minutos, se for executada corretamente.Essas técnicas permitem a colheita seletiva de leucócitos MP. O estudo desses leucócitos irá aprimorar nossa compreensão sobre a significância biológica e clínica, especificamente em relação ao controle de células aberrantes circulantes e doenças relacionadas aos pulmões. Após este procedimento, as células podem ser caracterizadas e analisadas por citometria de fluxo, PCR ou qualquer outro ensaio de interesse.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como coletar leucócitos pulmonares marginais.

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de leucócitos hepáticos marginais do fígado de camundongo por perfusão forçada.

Isolamento de leucócitos hepáticos marginais de fígado de camundongo

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Os leucócitos hepáticos marginais exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos um método para colheita seletiva dessa população específica de células hepáticas, por meio de perfusão forçada do fígado de ratos ou camundongos. Os leucócitos hepáticos marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças e metástases relacionadas à hepatia.

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Este protocolo descreve a remoção e purificação de células endoteliais artéria pulmonar (PAECs) que aderem as dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz, enquanto eles estão encravados na artéria pulmonar durante o cateterismo cardíaco direito e permanecer aderente para o balão vazio após a remoção do corpo do paciente.

Colheita de células endoteliais das dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz após cateterismo cardíaco direito

Nós descrevemos um método para processar o líquido broncoalveolar do lavagem e o sangue periférico combinado dos indivíduos cronicamente HIV-contaminados na terapia antiretroviral para avaliar reservatórios pulmonars do HIV. Estes métodos resultam na aquisição de células T CD4 altamente puras e macrófagos alveolares que posteriormente podem ser utilizados para a imunofenotipagem e quantificações de DNA/RNA do HIV por reação em cadeia da polimerase ultrassensora.

Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs), um tipo de célula intracraniana recentemente identificado, têm funções pouco compreendidas. Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para a colheita de LLECs de camundongos e estabelecimento de culturas primárias in vitro . Este protocolo é projetado para permitir que os pesquisadores se aprofundem nas funções celulares e potenciais implicações clínicas de LLECs.

Colheita e Cultura Primária de Células Endoteliais Linfáticas Leptomeníngeas

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

Aprenda a colher seletivamente leucócitos marginantes-pulmonares de ratos e camundongos usando perfusão forçada. Esta técnica isola células da endotelina capilar pulmonar para estudos imunológicos precisos.

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

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