Name: Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprenda a gravar aferências mecânicas em terminais nervosos de folículos pilosos de camundongo, combinando imagem celular e eletrofisiologia. Este método simplifica o estudo da mecanossensação.

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O trabalho foi parcialmente financiado pelo projeto do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido G0601253 para GSB e RWB.

Rato post mortem colheita de tecidos devem usar métodos aprovados éticos. No Reino Unido, deslocamento cervical é um método aprovado do governo para ratos adultos (a listado método de Programação 1 no Reino Unido Animals (Scientific Procedures) Act de 1986 e da Directiva Europeia 2010/63 / UE). Esta legislação é aplicada localmente na Universidade de Aberdeen pelo Bem-Estar Animal e Ethical Review Board, que analisou e aprovou todos os procedimentos utilizados no seguinte protocolo. Nota: Estes métodos foram usados ​​na pesquisa, publicada na Banks et al 7. 1. Orelhas preparando para Eletrofisiologia <ol><li> Antes de dissecção, preparar uma solução salina fisiológica padrão, tais como Liley (1956) e satura com 90% de O2 / 5% de CO 2. Solução salina de Liley (mM) é constituído por: NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) e glucose(11). </li><li> Humanamente sacrificá um rato adulto sem danificar o crânio perto das orelhas. Aqui usamos ratos C57 / Bl6J e MF1 mas qualquer cepa padrão rato de laboratório pode ser usado. O ideal é usar ratos que são &lt;25 g se a gravação elétrica deve ser combinada com a rotulagem estiril tintura, como a rotulagem em camundongos maiores é menos confiável, muitas vezes sendo encontrado apenas em áreas circunscritas restritas. </li><li> Retire a cabeça com grandes tesouras ou tesouras ósseas. </li><li> Coloque o lado da cabeça dorsal em gaseados Liley de em uma ampla de fundo prato dissecção (50 cm, é normalmente conveniente) no palco de um microscópio de dissecção estéreo. Regularmente (~ 10 min) eclusa ou submergir a cabeça com solução salina gaseados. </li><li> Cuidadosamente inciso e separar a pele na base da orelha externa (pavilhão auricular) com uma tesoura Springbow e # 3 fórceps, expor a cartilagem do conduto auditivo externo (CAE). Identificar os ramos do trigêmeo (divisão mandibular, MDV) e grandes nervos auriculares à medida que surgem from do crânio na fenda do mandibular projeto conjunto e através da base de cartilagem na inervação do aspectos da pele do pavilhão auricular côncava (anterior) e convexa (posterior), respectivamente. </li><li> Perto do crânio, identificar onde os dois nervos ramos saída no sulco entre a mandíbula eo processo mastóide. Maximizar o seu comprimento, puxando levemente o pavilhão auricular para longe do crânio e cortar os nervos tão próximas ao crânio possível. </li><li> Remover o pavilhão auricular a partir da cabeça com uma tesoura Springbow, tendo o cuidado de evitar os coto distal dos nervos divididas e minimizando a quantidade de pelagem densa na base da orelha que é removido. </li><li> Transferir o pavilhão auricular para uma borracha de silicone flexível (PDMS) prato -lined preenchido com líquido gaseificado de Liley. Abra o EAM, dividindo-o em seu ponto mais estreito (ântero-mais). Achatar a orelha, pele anterior (côncava) do lado para baixo e pino para o PDMS cuidadosamente as bordas com ~ 6-8 regularmente espaçados muito finas (~ 0,2 mm de diâmetro) de insetos dos pinos. </li><li> Remove a pele do aspecto posterior do pavilhão auricular completamente e remover parcialmente a cartilagem do pavilhão por dissecção romba com fórceps # 3, assegurando a pele anterior é deixada intacta. </li><li> Com a ponta de um alfinete inseto bem apreendido com # 3 fórceps, suavemente estender os ramos (geralmente 2) do MDV que surgem posteriormente entre a pele e cartilagens EAM. Pin-las para o PDMS com as melhores possíveis pinos de insetos, espetando o tecido conjuntivo adjacente suas extremidades cortadas e não os troncos nervosos próprios. </li><li> Remover a maior parte do tecido conjuntivo circundante em torno deles, evitando-se cuidadosamente o excesso de danos de puxar ou de corte. </li></ol> 2. eletrofisiológica Gravação Configurar <ol><li> Pin a pele do pavilhão auricular para a base de uma câmara de registo com finas pinos de insectos em torno das bordas PDMS-alinhado (~ 6-8 por orelha), colocando os nervos limpas na base da orelha perto de dois eléctrodos de sucção - uma para a gravação (a tomar o nervo) e do otela um eléctrodo indiferente (para fornecer o sinal de neutro a um amplificador diferencial, ver 7). </li><li> Para o eléctrodo de registo, corresponder cuidadosamente a abertura e o diâmetro interno da abertura para a espessura combinada dos dois nervos, de modo que eles se encaixam firmemente quanto possível e com tão grande quanto possível de um comprimento. </li><li> Desenhar os nervos para o eléctrodo por sucção suave a partir de uma seringa de 2 ml ligado à outra extremidade, com um tubo de borracha de silicone. Certifique-se os nervos são retas, não dobrado ou dobrou. </li><li> Desenvolver uma alta resistência eléctrica ajuste / impedância usando sucção mais forte para desenhar um tecido conjuntivo ou do tecido adiposo para formar um tampão que veda hermeticamente a abertura em torno do nervo. </li><li> Encha o outro eletrodo (indiferente) com solução salina por sucção, se necessário (que pode encher por acção capilar). </li><li> Coloque fios de gravação idênticas (prata ou platina) para dentro do furo interno dos eléctrodos de registo para entrar em contato com a solução salina e o nervo(Gravação) ou estreitada, final polido-fogo (indiferente) do eletrodo. Cada eletrodo é soldado individualmente para diferentes núcleos de dois-núcleo do cabo blindado. Coloque o eletrodo banho (terra) (Ag / AgCl pellet) para o banho, e, triturando-o para a tela do cabo de dois núcleos conectados aos eletrodos de registro. </li><li> Alimente a atividade elétrica dos dois eletrodos nos canais separados de um amplificador diferencial, filtro (passou-band 0,2-2 kHz), e vista em uma tela do osciloscópio. Verifique se o canal A (gravação) e do canal B (indiferente) níveis de ruído elétrico semelhante. Nesta fase, pode não ser possível ver os potenciais de acção espontânea normais num canal antes de os dois eléctrodos são equilibradas. </li><li> Corrigir quaisquer diferenças de ruído de fundo entre os eléctrodos através do aumento da impedância da gravação (canal A) ou eléctrodos indiferentes (canal B). Faça isso por sucção areolar tecido conjuntivo (adiposo) ainda mais em ambos os eletrodos, e /ou a aplicação de uma maior força de sucção sobre a seringa de 50 ml. <ol><li> Uma vez que &quot;equilibrada&quot;, desta forma, voltar ao diferencial de gravação (AB) e procurar potenciais espontâneos de ação (APs) no rastreamento ou quando acariciando os cabelos na margem do pavilhão auricular. Se nenhuma atividade (spiking) é visto, re-verificar o ajuste apertado do nervo no eletrodo de gravação e do tecido conjuntivo areolar no eletrodo indiferente - normalmente o mais apertado (maior resistência) o selo e mais igual a impedância nos dois eléctrodos, o melhor. Com a prática, isto irá conseguir uma boa qualidade (&gt; 2: 1) de sinal: ruído. </li></ol></li><li> Grave a electroneurogram através de um software de interface laboratório e eletrofisiologia executado em um computador. Uma saída de áudio de cravação é muito útil e pode ser conseguida alimentando a neurograma através de um amplificador de áudio e alto-falante de áudio associado. Ajustar o limiar ser um pouco acima do ruído de linha de base (identificado pela ausência de branco-Noise &#39;silvo&#39;). </li><li> Para aumentar a droga ou o acesso estiril corante fluorescente para as terminações lanceoladas, cuidadosamente descascar a camada adiposa sub-dérmica perto da margem do pavilhão auricular, abrindo uma janela de ~ 5 x 5 mm expor a derme e base dos folículos (Figura 1A, B ). </li><li> Pin para trás uma dobra de ~ de 1 mm da pele da orelha limpou-adiposo na margem principal (ao nível da janela apenas produzida, se for o caso), deixando um espaço cheio de solução salina clara entre as camadas da pele apostos. Suavemente derrame os pêlos salientes ao longo da borda dobrada com um pino ou uma pinça fina aterrados, sem tocar a pele, para localizar a área de saída AP máxima no osciloscópio eo distintivo &#39;cliques&#39; e &#39;pops&#39; na saída de áudio. </li></ol> 3. Potenciais de Ação de Gravação Estímulo-evocados <ol><li> Posicionar a sonda de estimulação mecânica - a 10 centímetros de vidro de borosilicato de microeletrodos fogo-polido ligado a um Ceramic piezo-elétrico atuador - por isso o movimento é paralelo com a dobra da pele. Coloque a ponta cerca de 0,5-1 mm de pele dobra, por isso toca os cabelos, mas não a pele. Verifique estimulação efetiva, movendo lentamente a ponta da sonda manualmente para desviar os cabelos e observar / ouvir a cravação. </li><li> Use o software para conduzir estimulação mecânica de 1-3 pêlos (por exemplo, 3 segundos a 5 sinusóides Hz, a cada 10 segundos. Sonda deslocamento 200-500 mm), e registrar as respostas evocadas por estimulação nos nervos. </li><li> Dê vários trens estimulação mecânica idênticas em intervalos de 10 segundos. Otimizar a posição da sonda para a repetibilidade, em seguida, reduzir a frequência de estimulação de acordo com o protocolo experimental (por exemplo, taxa de repetição de queda de 10 seg a 30 seg). </li><li> Usar o software para discriminar AP-actividade semelhante a, por exemplo usando um limiar simples ajustado para ~ 2x a amplitude do ruído de alta frequência e ~ 25% dos maiores APs. </li><li> Conte os APs que cruzam o limiar&#39;eventos&#39;, quantificando a frequência e as características dos APs produzidos. </li></ol> 4. acendimento captação dos estímulos evocadas combinado com N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridínio Dibrometo Etiquetagem <ol><li> Para examinar os efeitos de corantes de estirilo sobre queima aferentes evocadas por estímulo e rotulagem terminal, adicione a concentração adequada de um corante de estirilo de escolha, à solução de banho e continuar com a gravação elétrica. </li><li> Após o tempo de exposição necessário (geralmente, pelo menos, 30 min), preparar a preparação para visualização dos folículos. Abra a aba de pele, removendo os pinos de retenção, e expor a área dérmica liberado para revelar a rotulagem terminal. </li><li> Lavar corante externo com solução salina livre de corante, fazendo 3 mudanças completas de solução salina. </li><li> Incubar na mudança final de solução salina livre de corante gaseados por 10-15 min para permitir a contaminação do corante mais persistente a lixiviação a partir de membranas expostas / externos. </li><li> Remover o corante não-internalizado restante em membranas com um agente sequestrante (sulfobutylated beta-ciclodextrina, 1 mM, 5 min) numa solução salina. </li><li> Transferir a câmara de gravação para o palco de um microscópio de epifluorescência vertical e envolver a câmara com o mecanismo de movimento estágio / slide. </li><li> Iluminar a preparação com luz de excitação apropriado para o corante de estirilo. Usar uma objectiva 10X de microscópio de fluorescência ou 25X para observar a rotulagem folículo (Figura 1). </li></ol>

<ol><li>Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transient+receptor+potential+%28TRP%29+channel+agonists+and+antagonists+on+slowly+adapting+type+II+mechanoreceptors+in+the+rat+sinus+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).</li>
<li>Fagan, B. M., Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+glutamate+receptor+mediated+transmission+at+mechanoreceptors+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin.</a> Neuroreport. 12, 341-347 (2001).</li>
<li>Price, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+sodium+channel+BNC1+is+required+for+normal+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation.</a> Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo2+is+the+major+transducer+of+mechanical+forces+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice.</a> Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).</li>
<li>Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+innervation+of+mystacial+vibrissal+follicle-sinus+complexes+in+the+rat+and+cat%3A+a+confocal+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study.</a> J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).</li>
<li>Li, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+organization+of+lanceolate+mechanosensory+complexes+at+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles.</a> eLife. 3, 01901(2014).</li>
<li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li>
<li>Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+dynamics+in+rat+fast+and+slow+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).</li>
<li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+senses%3A+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li>
<li>Drew, L. J., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3 (1), 1(2007).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li>
<li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles%3A+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li>
<li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Phys.+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós desenvolvemos uma preparação relativamente simples que pode ser rapidamente dissecados, tem uma baixa densidade do folículo de cabelo e permite a estimulação mecânica relativamente selectiva de um pequeno número de folículos do cabelo. É facilmente acessível para a gravação eletrofisiológico e de imagem fluorescente de células vivas, incluindo as respostas para tingir aplicativo para visualizar os folículos pilosos estimulada mecanicamente, ou seja, os folículos de imagem com respostas eletrofisiológicas definidos. Embora não tenhamos feito isso, este sistema também parece prontamente passível de sub-divisão do nervo sensorial para a unidade única (single axônio sensorial) gravação e usando GFP-expressão direcionados para visualizar a morfologia do terminal terminando sensorial. Temos usado a preparação da pele da orelha para investigar as características da internalização e libertação dos corantes pridinium estirilo membrana fluorescente 7, uma técnica originalmente desenvolvida para estudar vesic localizadareciclagem membrana le nos terminais sinápticos 8. Em sinapses, imaging também é facilmente combinado com a gravação eletrofisiológico simultânea de respostas em terminais identificados 8,9. Foi nesses estudos iniciais que, primeiro, anotou os corantes também foram internalizados pelas terminações mecanosensorial 10. Para neurônios sensoriais na cultura e nas células ciliadas da cóclea, grande parte da rotulagem por corantes de estirilo piridï¿½nio parece envolver corantes que passam através dos canais mecanosensorial, que eles bloqueiam 11,12. Os corantes, em seguida, rotular membranas intracelulares, e essa rotulagem é irreversível. No entanto, nas células ciliadas que não são mecanicamente estimulados 13,14 e nos terminais completamente diferenciadas primárias sensoriais nervosas in situ, tais como terminações Ia em fusos musculares 15, e nas terminações lanceoladas aqui 7, rotulagem estiril corante parece refletir a endocitose de membrana, uma vez que a rotulagem é reversível e não bloquear os res mecanosensorialponses 7,15,16. Enquanto alguns internalização corante por permeação canal nessas terminações não pode ser completamente descartado, é evidente a partir da queima continuou durante a incubação corante e a reversibilidade da rotulagem que a grande maioria da rotulagem em terminais diferenciadas in situ é de internalização com vesícula reciclagem membrana. Assim, esta técnica simples é facilmente utilizado para a monitorização eléctrica e óptica combinada de uma variedade de funções do terminal mecanosensorial em tecidos ex vivo. Tal como acontece com a maioria das técnicas práticas, reprodutibilidade vai exigir a repetição e prática. serão agora descritos alguns dos pontos-chave especial atenção vale a pena. Durante toda a sessão de gravação e dissecção, maximizar a viabilidade do tecido e da sobrevivência, assegurando a preparação é constantemente perfundidos com solução salina totalmente saturado com 95% O2 / 5% de CO 2. Assegurar o cabelo folículos não são deslocados durante este processo, which irá estimular a queima final sensorial. Ou utilizar, num sistema contínuo de fluxo laminar de perfusão, ou cuidadosamente bolha de gás através de um banho de órgãos com tubos finos, a uma distância a partir da preparação, ou actualizar cuidadosamente soluções cada 20-30 min, mantendo a preparação abaixo da superfície da solução salina em todos os momentos. eletrodos de registro de sucção são feitos modificando pipetas de borosilicato eletrodo afiadas normalmente utilizados para a gravação intracelular. Em primeiro lugar, cuidadosamente quebrar as pontas afiadas com # 3 fórceps para dar o diâmetro interno adequado para o ajustar os nervos e fogo-polonês por muito breve (&lt;1 seg) a exposição a chama do queimador de Bunsen (ver 2.4 e 2.5). Para obter uma boa relação sinal-para-ruído durante a gravação, é essencial que a impedância eléctrica (resistência) nestes dois eléctrodos é maximizada e ambos igual. Para fazer isso, prestando atenção para o seguinte nos dois eletrodos. Para o eléctrodo de registo, assegurar o diâmetro interno é um ajuste confortável para o nervo, e o comprimento máximo de NErve é atraído para o eléctrodo de registo. Tente usar o tecido conjuntivo ao redor do nervo para selar eficazmente a ponta do eletrodo. Em alternativa, ou além disso, tirar a parte mais estreita de um pedaço de tamanho adequado, afunilada de tecido adiposo em ao lado do nervo. Em seguida, ligar a extremidade do eléctrodo por aplicação de sucção forte para ~ 1 min com uma seringa de 50 ml ligado à tubagem. Para uma dica bem fechados, aplicação de sucção forte simplesmente reforçar a eficácia da ficha e não vai chamar em mais líquido ou do nervo. Para evitar danos nos nervos, no entanto, garantir que o tecido conjuntivo é amortecer o nervo de compressão sobre o material circundante e da cartilagem EAM. O eletrodo indiferente deve imitar a resistência / impedância do eletrodo de registro, tanto quanto possível. Este é ajudado por cuidadosamente fogo-de polimento a ponta para tão pequeno uma abertura possível sem realmente selando-o. Se ainda mais a resistência é necessário, em seguida, ligue a extremidade do eléctrodo indiferente com AdipoSE tecido conjuntivo, tal como descrito acima para o eléctrodo de registo. O eletrocerâmicos dá o controle requintado ao longo deslocamento mecânico, tanto espacialmente e temporalmente. No entanto, tome cuidado para fazer as conexões elétricas - altas temperaturas destruí-los, portanto, não use solda quente. Use cola epóxi carregada com metal, ou utilizar uma tomada de encaixe especialista recomendado pelo fornecedor. Isso quer segurá-lo com firmeza e estabelecer a conectividade elétrica. Fixe a sonda estimulante de vidro para o eletrocerâmicos com resina epóxi padrão. Fire-polonês o fim de um padrão cm x 10 tubos capilares de vidro de borosilicato 1,5 milímetros de diâmetro utilizadas para fazer patch ou eléctrodos afiadas para o registo electrofisiológico para minimizar o risco de danos nos tecidos. Se a estimulação folículo piloso única é necessária, fogo-polonês a ponta para caber um único fio de cabelo, e posicionar a sonda com um único fio de cabelo dentro da grande abertura. Isto dá o controle requintado ao longo de um único fio de cabelo. Para dy estirile rotulagem, ele é geralmente mais uniforme em tecidos de animais mais jovens. Não está totalmente claro por que, mas isso provavelmente reflete menos trauma mecânico e remoção mais eficaz do tecido profundo dos tecidos mais jovens. Ser completo na remoção da camada de espuma de poliestireno expandido lembrando que recobre as bases do folículo piloso. No entanto, evitar ser demasiado vigorosa, já que esta corre o risco de remover a camada plexo nervoso e terminais lanceoladas associados. Se houver pouca ou nenhuma resposta eléctrica ao movimento do folículo capilar, e a aplicação estiril corante leva a rotulagem predominante das glândulas sebáceas (amarelo / branco), com autofluorescência distinta da base da haste do cabelo, em vez de terminações lanceoladas (amarelo alaranjado /), apuramento excesso de entusiasmo tem prejudicado os tecidos subjacentes. Finalmente, usando um agente corante quelante antes de imagem melhora consideravelmente o contraste da imagem e qualidade das imagens finais. Esta técnica pode ser útil numa variedade de estudos suplementares. estes could incluem, por exemplo, o rastreio para o canal (s) mecanosensorial responsável por respostas evocadas por estiramento, por incubação da preparação com ligandos farmacológicos selectivos para os canais de candidatos ou de rastreio de linhas de ratinhos com tais canais geneticamente suprimido. Este último poderia ser combinada com a avaliação de fluorescência de quaisquer alterações na morfologia do terminal devido à manipulação genética em linhas de rato, por exemplo, com expressão GFP Npy2r-linked 17. Um último exemplo pode ser investigar o papel das vesículas sinápticas-like (SLVs) 7 nesses terminais lanceoladas, examinando o efeito de moduladores de volume de negócios SLV (Ca, Mg, latrotoxin, ligantes de receptores de glutamato) sobre as respostas evocadas por estiramento e captação estiril corante /lançamento. Assim, esta nova técnica abre um leque de possibilidades potencialmente interessantes de pesquisa em neurociência mechansensory.

Os terminais lanceoladas de axônios sensitivos que inervam folículos pilosos em mamíferos formam paliçadas em todo o epitélio de cabelo eixo. Sua finalidade é detectar deslocamento mecânico dos pêlos que cercam. Eles são uma mistura de rápida e lenta adaptação terminações que produzem predominantemente rajadas curtas de atividade em resposta ao movimento do cabelo. Actividade deixa muito rapidamente quando o movimento pára, mesmo na presença de deslocamento continuado. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento deste modelo de orelha de murino para estudos correlativos da estrutura e função em terminais lanceoladas. O pavilhão tem muitas características vantajosas para estudar essas terminações. Em primeiro lugar, o pavilhão auricular é essencialmente duas camadas de pele transformada num back-to-back, com pouca outro tecido entre a interferir com o acesso para os folículos e terminais. A pele é muito fina e facilmente dissecados devido a quantidades mínimas de tecido conjuntivo resistente. A inervação é facilmente acessível e identificável. Enquanto follicl cabeloes estão presentes, eles são relativamente pouco distribuída, facilitando a estimulação dos indivíduos ou pequenos grupos de folículos mecanicamente. A camada dérmica subjacente fina dá boa acessibilidade aos terminais nervosos com drogas farmacológicas e corantes. Isso os torna particularmente ideal para estudos de imagem por microscopia de fluorescência. A imagem pode ser tanto em terminais vivos, ou após a fixação e posterior processamento histológico. As respostas de neurónios que enervam mecanosensorial folículos de cabelo têm sido tradicionalmente estudado em roedor vibrissas 1,2 e, em menor grau, em preparações isoladas de pele 3,4. Estes têm ensinou-nos muito sobre os princípios gerais da fisiologia mecanosensorial nas terminações nervosas em torno do eixo do cabelo. A preparação das vibrissas permite um controlo excelente sobre o movimento de um único folículo piloso. No entanto, pode ser difícil para decifrar a saída, devido à sua complexidade, como vibrissasfolículos conter pelo menos 8 tipos diferentes de final mecanosensorial anatomicamente distinta 5 ea correspondência entre estes tipos morfológicos a respostas eletrofisiológicas específicos continua a ser uma questão de disputa. A preparação nervo pele do rato / safena é mais frequentemente usado em seu estado depilada para investigar toque e dor respostas. A inervação dos folículos pilosos em uma tal preparação é menos complexo, mas a densidade dos folículos pilosos, além da presença de três tipos foliculares diferentes (guarda, Awl / auchene e cabelos ziguezague) em tal proximidade 6, significa estudar as respostas específicas de um único folículo ou tipo único de final é novamente um desafio. Além disso, esta preparação envolve uma dissecção complexo. Finalmente, em ambas as vibrissas e outras preparações para a pele, é difícil visualizar as terminações envolvidas enquanto ex vivo preparações estão ainda vivos. Assim, o seccionamento de tecidos é necessária mesmo em linhas de rato que expressam GFP. alternatively, requer mais processamento histológico / imunológico, tais como a fixação e / ou incubação do anticorpo para imunofluorescência. Temos, portanto, desenvolvido a preparação pavilhão auricular e é usado para fazer gravações elétricos a partir de uma população restrita de aferentes folículo piloso e mostrar que o ciclismo membrana ocorre nessas terminações lanceoladas, evidenciadas por captação de corantes de estirilo piridï¿½nio. Finalmente, mostrámos que o corante não interfira com sensibilidade mecânica, indicando que ele não bloqueia os canais mecanotransdução. Os resultados de protocolos de estimulação e análise simples são ilustrados.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Polímero de silicone sólido flexível, inerte e translúcido.</td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 3</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de insetos Austerlitz</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>26002-10</td><td>Pinos muito finos para prender a preparação do pavilhão auricular com segurança ao PDMS com danos mínimos.</td></tr><tr><td>Pré-amplificador diferencial AC</td><td></td><td>Digitimer Neurolog NL104A</td><td>Amplificando o tamanho do eletroneurograma aferente de entrada. A gravação diferencial minimiza o ruído elétrico estranho e o desvio da linha de base.</td></tr><tr><td>Filtro passa-alto / passa-baixo</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>Condicionamento de sinal, reduzindo o ruído elétrico estranho para garantir a melhor relação sinal-ruído.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Define o limite do detector de eventos e o exibe no osciloscópio. Isso mostra a eficácia da detecção do potencial de ação.</td></tr><tr><td>Amplificador de áudio e alto-falantes</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>Monitoramento de áudio útil para a presença de disparo elétrico das terminações sensoriais enquanto ajusta a preparação da estimulação mecânica para baixo do microscópio&nbsp;</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>Usamos este modelo antigo, mas qualquer osciloscópio padrão será suficiente.</td></tr><tr><td>Eletrocerâmica piezoelétrica wafer</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Eletrofisiologia/interface de computador</td></tr><tr><td>Eletrocerâmica piezoelétrica fonte de alimentação Saída</td> DC de <td></td> 0-200 V feita <td>em casa</td><td>para conduzir o deslocamento da pastilha de cerâmica, com controle eletrônico variável de saída via software de gravação/estimulação e interface de computador. Usamos o software Spike2 e a interface de computador 1401micro.</td></tr><tr><td>Software de eletrofisiologia</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Software de gravação, estimulação e análise de dados de eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Interface de laboratório</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 micro</td><td>Interface de eletrofisiologia, entre o amplificador/filtros e o computador. Ele insere o eletroneurograma e também impulsiona o movimento eletrocerâmico.</td></tr><tr><td>FM1-43 / Synaptogreen C4</td><td>Biotium / Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Sonda de membrana fluorescente que se divide reversivelmente no folheto externo das membranas celulares. Usado predominantemente para monitorar a endo/exocitose da membrana da vesícula.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>Um derivado sulfonado de b-ciclodextrina que quelata FM1-43 (e outros corantes de estirilpiridínio) para fora das membranas expostas, deixando o corante internalizado para ser visto mais claramente, diminuindo a marcação/fluorescência de fundo.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monocromático, câmera CCD refrigerada - modelo básico</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem Volocity 3D</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Software de captura e análise de imagem.</td></tr></tbody></table>

gravação combinado de saída mecanicamente stimulated aferentes e nerve terminal rotulagem no mouse do folículo piloso lanceolate endings

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Um romance técnica de dissecção ea gravação é descrita para o acendimento monitoramento aferentes evocada pelo deslocamento mecânico de cadeiras no pavilhão auricular mouse. A técnica é muito custo-efetivo e facilmente realizado com materiais normalmente encontrados na maioria dos laboratórios de eletrofisiologia, ou facilmente adquiridos. A dissecção é simples e rápido, com o deslocamento mecânico fornecido por um wafer eletrocerâmicos genérico controlado por software proprietário. O mesmo software também registra e analisa a saída electroneurogram. A gravação da atividade do nervo evocado é através de um amplificador diferencial comercial ligado à microeletrodos de vidro padrão polido-fogo. dicas úteis são dadas para a melhoria da qualidade da preparação, o estímulo e as condições de gravação para otimizar a qualidade de gravação. O sistema é apropriado para ensaiar as propriedades electrofisiológicas e ópticas dos terminais lanceoladas terminações de paliçada de folículos de cabelo, bem como aos resultados a partir da sua manipulação farmacológica e / ou genética. Um exemplo da combinação de gravação eléctrico com a estimulação mecânica e etiquetagem com um corante vital estiril piridínio é dada.

O arranjo de gravação electrofisiológico, com o tecido adiposo sub-cutâneo removida para expor os folículos pilosos, é mostrado na Figura 1A. Uma porção desta área exposta é mostrada com uma ampliação maior na iluminação de campo claro na Figura 1B. Dobrando a margem pinna cima e para trás sobre si mesmo nesta área expõe a superfície da epiderme. Isto posiciona os cabelos na borda da dobra para se projectar horizontalmente, numa situação ideal para a estimulação mecânica com uma sonda romba (não representada). A Figura 1C mostra que após exposição corante e retornando a margem para a posição desdobrada, novamente, os folículos estimulada nesta posição foram marcadas com um corante de estirilo piridínio. Electroneurograms de preparações mostram tipicamente actividade de AP em curso, mesmo na ausência de movimento imposto da sonda de fibra de vidro, incluindo os APs de maior tamanho (Figura 2A <strong&gt; i-iii). Actividade ocorre a uma taxa de cerca de 10-20 impulsos / seg (traço &quot;picos&quot;), não mostrando nenhum estrutura ou sinais de tonicidade, como o auto-correlação para os intervalos entre os períodos de estimulação são bastante plana. Durante 5 Hz, 100 uM de estimulação mecânica dos fios de cabelo, tipicamente produção global sobe para 20-50 impulsos / seg, ou 4-10 por ciclo sinusoidal. Construção de histogramas de ciclo, em seguida, revela forte arrastamento (chamada &quot;fase-bloqueio &#39;) das respostas (Figura 2BI-III)). Isto é bastante reproduzíveis, apesar da fase da forma de onda em que as respostas são bloqueados depende da sua posição, isto é em que ponto o movimento de vibração da sonda entra em contacto com o cabelo. A detecção do limiar simples (linha horizontal cruzando os traços neurograma em A (i-iii)) tem sido utilizado para esta análise. No entanto, a funcionalidade do software de gravação pode muitas vezes ser utilizado de uma maneira mais sofisticadadiscriminar características de tamanho pico e forma. Este pode, então, isolar as respostas de determinadas fibras aferentes por essas características para permitir a análise de gravação pseudo-single-unidade a ser empreendido. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> Figura 1:. Arranjo gravação eletrofisiológico e N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) Pyridinium Dibrometo Rotulagem de folículo piloso terminações aferentes Lanceolate (A) Um pavilhão auricular preparação configurado para um experimento eletrofisiológico, mostrando o pavilhão auricular orientação, a localização dos nervos, os eléctrodos de registo e a área exposta da inervação folículo depois da remoção do tecido adiposo. (B) vários folículos pilosos são visíveis na iluminação de campo brilhante na área limpa de tecidos adiposos sobrepostas até a derme. O escuro, geralmente bilobado, formas são glândulas sebáceas. ( <strong&gt; C) vista ampliada da área de box em B) mostrando dois finais lanceoladas marcadas com o corante de estirilo N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridínio dibrometo e fotografada após a estimulação mecânica por microscopia de epifluorescência . De 7, com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> Figura 2: (A) Atividade evocadas por estímulo gravado a partir do mouse Pinna. (Ai-iii) Exemplos, tomadas a partir de 3 experimentos diferentes, da atividade de neurograms contínuas de pinnae em solução salina padrão de Liley. Cada ficha 5 mostra uma secção segundo a cerca de 5 minutos após o início da gravação, incluindo um período de 3 segundos de deslocamento sinusoidal de quantonúmero de shopping de fios de cabelo. A estimulação mecânica foi repetida cada 30 segundos durante toda a gravação contínua, que geralmente dura por 1-2 horas. arquivos de script personalizados marcados eventos individuais que cruzaram um limiar definido pelo cursor horizontal (pontos), bem como o início de cada ciclo sinusoidal (período). (Aiv) O sinal de comando para o deslocamento senoidal. (B) Análise de Estímulo-evocado Bater Atividade. (Bi-III) histogramas de ciclo em 3 ° lixeiras construída a partir das amostras neurograma (Ai-III), respectivamente, que mostra as respostas das terminações lanceoladas presumíveis à estimulação mecânica por 5 Hz deslocamento sinusoidal de fios de cabelo por uma sonda de vidro. Note-se a fase de bloqueio marcado, em diferentes fases do ciclo, dependendo da sua posição em relação à posição de partida da sonda mecânica. (Biv) sonda Normalizada deslocamento senoidal; a amplitude real foi de aproximadamente 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

É apresentada uma técnica simples e inovadora para registrar a descarga aferente devido à estimulação mecânica dos terminais lanceolados das terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha do camundongo.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método rápido e simples para combinar o imageamento de células vivas e a gravação eletrofisiológica em terminais neuronais notoriamente difíceis de acessar e mecanicamente sensíveis. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na mecanossensação, como o papel das vesículas semelhantes a sinápticas ou a farmacologia de canais mecanotransdutores candidatos em terminais totalmente diferenciados, in situ.A principal vantagem desta técnica é que ela é muito simples, mas ainda assim permite o acesso visual a terminações totalmente diferenciadas para investigação fisiológica. Embora este método se concentre na aferência do folículo piloso, ele também pode fornecer informações sobre outros sistemas mecanossensoriais de baixo limiar, como fusos musculares, terminações sensoriais de Merkel e barorreceptores. As implicações desta técnica estendem-se para o desenvolvimento de novos alvos farmacológicos para regular os sensores mecânicos, incluindo o tratamento da regulação anormal da pressão sanguínea.Após decapitar um camundongo adulto jovem, coloque a cabeça com o lado dorsal voltado para cima, em solução de Liley gaseificada, em um recipiente com fundo de 50 centímetros de largura, sob um microscópio estereoscópico de dissecação. Aproximadamente a cada 10 minutos, enxágue cuidadosamente a área de dissecação com silano gasoso. Agora, faça uma incisão cuidadosa e separe a pele na base da orelha usando uma tesoura em arco de mola e uma pinça número três.Exponha a inervação e a cartilagem do meato acústico externo. Identifique os ramos da divisão mandibular do trigêmeo e do nervo auricular maior à medida que emergem do crânio na fenda da articulação mandibular. Esses dois ramos nervosos se projetam através da cartilagem para inervar as faces côncava e convexa da pele da orelha.Em seguida, na região entre a mandíbula e o processo mastoide, identifique os pontos de saída dos ramos do nervo trigêmeo. Exponha seus trajetos puxando suavemente a orelha para longe do crânio. Uma vez expostos, corte os nervos o mais próximo possível do crânio.Em seguida, use uma tesoura de arco para remover a orelha da cabeça. Evite cortar os cotos distais dos nervos divididos e minimize a quantidade de pelos densos. Transfira a orelha para uma placa revestida com borracha de silicone contendo solução de Liley gaseificada.Agora, abra o meato acústico externo dividindo-o no seu ponto mais estreito. Em seguida, aplane a orelha com o lado côncavo voltado para baixo e fixe esse lado nas bordas com alfinetes entomológicos muito finos e espaçados regularmente. Depois, remova completamente a pele dorsal exposta da orelha e da cartilagem subjacente por dissecação romba usando tesoura.Não danifique a pele anterior durante este passo. Em seguida, usando pinças, segure um alfinete fino para insetos e estenda suavemente os ramos transectados da divisão mandibular que emergem posteriormente entre a pele e a cartilagem do meato acústico externo. Fixe esses ramos nervosos à placa com os alfinetes mais finos possíveis.Perfure o tecido conjuntivo, juntando suas extremidades cortadas, e não os fragmentos do nervo em si. Conclua o preparo do tecido removendo a maior parte do tecido conjuntivo ao redor dos ramos nervosos, mas não danifique os nervos com puxões ou cortes excessivos. Para tratar as terminações mecanossensoriais dos folículos pilosos com corantes vitais ou fármacos, remova cuidadosamente a cartilagem fibroelástica espumosa da camada adiposa subdérmica ao longo de cinco milímetros da margem da orelha.Assim, abra uma janela quadrada, expondo a derme e a base dos folículos pilosos. Usar um camundongo jovem minimiza a adesão entre as camadas cutâneas anterior e posterior e a dificuldade de remoção da cartilagem subjacente. Ambos os fatores aumentam a probabilidade de observar uma coloração bem-sucedida.Colocando o preparo na base do câmara de gravação revestida com silicone. Usando pinos finos para insetos, fixe a orelha ao redor das bordas, posicionando os nervos limpos da base da orelha próximos a dois eletrodos de sucção. Um para gravação e o outro, um eletrodo indiferente, para fornecer o sinal neutro a um amplificador diferencial.Para o eletrodo de gravação, ajuste cuidadosamente a abertura e o diâmetro interno da entrada à espessura do nervo selecionado para gravação. Uma vez feito isso, isso geralmente permanecerá constante em qualquer série de experimentos. Um bom comprimento do nervo precisa se encaixar firmemente no interior.Para introduzir o nervo no eletrodo, utilize sucção suave de uma seringa de dois mililitros, conectada por meio de tubo de silicone. No eletrodo de registro, certifique-se de que os nervos estejam retos e não dobrados ou sobrepostos, retirando e reinserindo suavemente o nervo com um fino pino para insetos durante a sucção. Agora, aspire um pouco do tecido conjuntivo circundante ou um tecido adiposo macio e flexível, para formar um selo hermético na abertura do eletrodo.O desenvolvimento de uma impedância equilibrada entre os eletrodos é essencial para uma gravação diferencial de alta qualidade. Fundamental para isso é a formação de um selo resistente à água e de alta resistência ao redor do nervo. Em seguida, encha o eletrodo indiferente com solução salina por sucção, caso ainda não tenha sido preenchido pela ação capilar espontânea.Em seguida, coloque fios idênticos de prata para gravação no orifício interno dos eletrodos de gravação e indiferente. Na outra extremidade, os fios devem ser conectados a núcleos diferentes de um cabo blindado de dois núcleos. Certifique-se de que o fio no eletrodo de gravação entre em contato com a solução salina e esteja próximo ao nervo, mas sem comprometer o selamento.Insira o fio na extremidade do eletrodo indiferente. Em seguida, coloque o eletrodo de terra, um pellet de prata-cloreto de prata, na cuba. Conecte este eletrodo à malha do cabo de dois núcleos ligado ao eletrodo de gravação.Visualize os sinais individuais em um osciloscópio para verificar se os níveis de ruído elétrico dos dois canais são semelhantes. Potenciais de ação espontâneos no eletrodo de gravação podem não ser visíveis até que os dois eletrodos estejam equilibrados. Para corrigir diferenças no ruído de fundo, aumente a impedância de um canal sugando mais tecido conjuntivo adiposo para dentro do eletrodo.Uma vez que os eletrodos tenham fundos equilibrados, mude para gravação diferencial e procure potenciais de ação espontâneos ou induza potenciais de ação acariciando os pelos na margem da orelha com uma haste de vidro polida ao fogo. Em seguida, grave um eletroneurograma por meio da interface do computador. E envie o neurograma por um sistema de som para tornar os disparos audíveis logo acima do ruído de fundo.Este relé de feedback auditivo é muito útil ao realizar experimentos. Em seguida, confirme que a inervação dos folículos próximos à área clareada está intacta estimulando manualmente os pelos. Agora, dobre um a dois milímetros da margem da pele da orelha ao nível da janela com tecido adiposo removido para expor os pelos subjacentes.Deixe uma lacuna preenchida com solução salina entre as camadas opostas da pele. Enquanto escuta atentamente, acaricie suavemente os pelos que se projetam ao longo da borda dobrada com uma haste de vidro. Não toque a pele.Se necessário, verifique o osciloscópio para avaliar a saída. Para realizar gravações controladas de potenciais de ação evocados por estímulo, utilize uma sonda mecânica feita de vidro microeletrodo de borossilicato, polido a fogo, com dez centímetros de comprimento, acoplada a um atuador piezoelétrico de cerâmica. Posicione a sonda de modo que ela se mova paralelamente ao dobramento da pele e toque os pelos, e não a pele.Coloque-o a cerca de meio a um milímetro acima da superfície da pele. Em seguida, verifique manualmente a estimulação ouvindo a saída de áudio quando a sonda se move. Agora, configure o software para acionar a estimulação mecânica de uma pequena área dos pelos.Por exemplo, programe simulações de três segundos com sinusoides de cinco hertz a cada dez segundos. Isso exige um deslocamento da sonda entre 200 e 2.000 mícrons. Em seguida, prossiga utilizando estimulação automatizada repetida para verificar a consistência das respostas registradas nos nervos.Devem ser obtidos resultados reprodutíveis. Quando os resultados forem consistentes, reduza a taxa de repetição para a cada 30 segundos. Instruções adicionais são fornecidas no protocolo textual.Para investigar as propriedades dos canais mecanossensoriais e marcar os terminais mecanossensoriais ao redor dos folículos pilosos, adicione FM1-43 na concentração de dez micromolares à solução e deixe por 60 minutos, continuando a estimular os pelos com a sonda oscilante. Este corante bloqueia canais transdutores candidatos e neurônios sensoriais em cultura e em células ciliadas da cóclea.No entanto, não bloqueia a atividade elétrica na aferência do folículo piloso maduro in situ. A marcação das terminações mostra que o corante atinge os terminais, que continuam a responder à estimulação mecânica durante toda a exposição ao corante. Eletro-neurogramas obtidos usando o protocolo descrito geralmente mostraram atividade contínua de potenciais de ação, mesmo na ausência de estimulação manual, incluindo potenciais de ação de maior amplitude.A atividade espontânea ocorreu a cerca de 10-20 disparos por segundo, não apresentando estrutura nem sinais de tonicidade. A autocorrelação dos intervalos entre os períodos de estimulação foi sempre bastante plana. Durante a estimulação mecânica de cinco hertz, 500 mícrons, das hastes dos pelos, a atividade geralmente aumentou para cerca de 50 disparos por segundo.A construção de histogramas do ciclo revelou um forte aprisionamento das respostas, com quatro a dez disparos por ciclo senoidal. Isso era bastante repetível, é claro, sendo que a fase da forma de onda na qual as respostas estavam fixadas dependia do local onde a sonda vibratória entrava em contato com o pelo e da direção de seu movimento nesse ponto. Em seguida, explorou-se a farmacologia dos canais dos terminais nervosos lanceolados do folículo piloso.Os canais continuaram a responder mesmo quando expostos ao FM1-43, que pode bloquear alguns canais mecanossensoriais, como aqueles em neurônios sensoriais em cultura ou células ciliadas da cóclea ex vivo. Uma vez dominada esta técnica, desde o início até o registro de eletro-neurogramas, ela pode ser realizada em 60 a 90 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante desenvolver um contato elétrico de alta resistência nos eletrodos e, se combinado com a visualização dos folículos, utilizar camundongos pequenos para melhorar a penetração do corante e a clareza óptica.Adaptamos a ideia para este método a partir de um originalmente desenvolvido por um colega próximo e agora professor aposentado, Clarke Slater, e seu aluno de mestrado Nakul Kain, quando relatamos a eles o possível papel das vesículas semelhantes a sinápticas na mecanossensação no fuso muscular e a necessidade de um método melhor para visualizá-las com FM1-43. Após seguir este procedimento, podem ser realizados métodos como farmacologia e marcação com corantes vitais para responder perguntas como quais são os canais mecanotransdutores e terminações diferenciadas in situ e se a estimulação mecânica pode modular a captação e liberação de corante regulando o reciclamento de vesículas semelhantes a sinápticas. Não se esqueça de que o FM1-43 não foi avaliado quanto à sua toxicidade e deve ser tratado como se fosse perigoso.

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

Este vídeo demonstra a gravação combinada da saída aferente mecanicamente estimulada e da marcação do terminal nervoso nos folículos pilosos de um pavilhão auricular de camundongo. Ele descreve as etapas envolvidas na estimulação mecânica dos terminais nervosos do folículo piloso antes e depois da exposição a um corante de membrana fluorescente, registro eletrofisiológico dos potenciais de ação gerados e visualização da rotulagem do terminal nervoso nos folículos pilosos.

Registro combinado de saída aferente mecanicamente estimulada e marcação de terminais nervosos em folículos pilosos de camundongos

Este vídeo demonstra um protocolo para estimular a raiz nervosa auditiva e registrar correntes pós-sinápticas em neurônios olivococleares mediais em fatias de cunha cerebral de camundongo.

Estimulação da raiz nervosa auditiva e gravações de corrente pós-sináptica em uma fatia de cunha de cérebro de camundongo

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um In Vitro Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Este vídeo demonstra um protocolo para a realização de gravações eletrofisiológicas de fibra única em uma preparação in vitro do nervo colorreto de camundongo.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

Aqui descrevemos uma nova preparação para imagens de terminais sensoriais lanceolados vivos de terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha de camundongo durante a coloração e descoloração com corantes de estiril piridínio.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

Os nervos aferentes mesentéricos transmitem informações do trato gastrointestinal para o cérebro sobre a homeostase normal, bem como a fisiopatologia. A atividade do nervo aferente gastrointestinal pode ser avaliada montando segmentos intestinais isolados com nervos aferentes anexados em um banho de órgãos, isolando o nervo e avaliando a atividade basal e estimulada.

In Vitro A gravação de mesentérica aferentes a atividade do nervo no mouse jejuno e segmentos do cólon

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Desenvolvemos uma técnica que registra simultaneamente tanto eletrocorticografia e potenciais de campo local em resposta a estímulos nociceptivos do laser de ratos movimentando-se livremente. Esta técnica ajuda a estabelecer uma relação direta dos sinais de electrocortical o nível macroscópico e mesoscópica e que facilita a investigação de informação nociceptiva processamento no cérebro.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local e Electrocorticograms em resposta a estímulos nociceptivos Laser de ratos movimentando-se livremente

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

Aprenda a gravar aferências mecânicas em terminais nervosos de folículos pilosos de camundongo, combinando imagem celular e eletrofisiologia. Este método simplifica o estudo da mecanossensação.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings (Vídeo) | JoVE Journal

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

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