Fluorescência tempo-lapso da completa

O objetivo geral deste protocolo de microscopia fluorescente com imagens em intervalos de tempo é fornecer um método para estudar os processos celulares biológicos que sustentam o desenvolvimento e a diferenciação celular na bactéria filamentosa esporuladora, Streptomyces venezuelae. O método descrito oferece uma excelente plataforma para investigar processos de biologia celular centrais ao ciclo de vida de Streptomyces, incluindo a localização dinâmica de proteínas, o crescimento polarizado e a formação de septos durante a esporulação. A principal vantagem desta técnica é que Streptomyces venezuelae esporula em meio líquido, o que nos permite cultivar as células em um dispositivo microfluídico e monitorar microscopicamente todo o ciclo de vida.

Este método demonstra o imenso potencial de Streptomyces venezuelae como um novo sistema de desenvolvimento para o gênero, pois permite a microscopia de células vivas da diferenciação de um micélio multicitado em cadeias de esporos. Para começar, inocular 30 mililitros de meio de crescimento suplementado com 10 microlitros de esporos da linhagem S. venezuelae a ser analisada. Para um crescimento e esporulação consistentes das células, utilize um frasco com chapa defletora ou um frasco que contenha uma mola para permitir uma aeração suficiente.

Cultive as células por 35 a 40 horas a 30 graus Celsius e 250 RPM. Quando pronto, você deverá ser capaz de observar os fragmentos de micélio e esporos por microscopia de contraste de fase com montagem líquida. Centrifugue um mililitro da cultura em uma centrífuga de bancada a 400 vezes G durante um minuto para obter um pellet com o micélio e os fragmentos celulares maiores.

Em seguida, transfira aproximadamente 300 microlitros do sobrenadante contendo uma suspensão de esporos para um novo tubo de 1,5 mililitro e coloque o tubo no gelo. Reserve o meio de cultura restante para uso em uma etapa posterior. A seguir, dilua os esporos na proporção de 1 para 20 em meio de crescimento suplementado e mantenha os esporos diluídos no gelo até que sejam necessários.

Despeje o meio de cultura restante em um béquer de 50 mililitros e, em seguida, aspire 10 mililitros com uma seringa e utilize um filtro estéril de seringa de 22 micrômetros para esterilizar por filtração o meio de cultura restante. Para obter o meio de crescimento suplementado usado, livre de esporos e fragmentos de micélio. Mantenha o meio de crescimento suplementado usado filtrado por alguns dias a quatro graus Celsius, se experimentos adicionais, utilizando condições de crescimento semelhantes, forem ser realizados.

Cada placa microfluídica pode ser usada para até quatro experimentos independentes. Para evitar a contaminação das câmaras de fluxo não utilizadas, certifique-se de usar soluções estéreis e condições de trabalho assépticas ao montar o experimento. Comece removendo a solução de transporte da placa microfluídica.

Em seguida, lave as cavidades com meio de crescimento suplementado estéril. Após a lavagem, adicione 300 microlitros do meio de crescimento suplementado à entrada da cavidade um e 300 microlitros do meio de crescimento suplementado usado nas cavidades dois a seis. Em seguida, carregue 40 microlitros das esporos diluídos na cavidade oito da fileira A e selle o manifold à placa conforme as instruções do fabricante.

Abra o software de controle microfluídico e selecione o tipo de placa apropriado. Configure um programa de fluxo para passar o meio pelos poços de entrada de um a cinco a seis psi durante dois minutos por poço, a fim de escovar o canal de fluxo e a câmara de cultura. Em seguida, configure o fluxo do meio de crescimento suplementado a seis psi no poço de entrada um durante seis horas.

Isso permitirá a germinação e o crescimento vegetativo. Configure o programa para alternar após seis horas para o meio de crescimento suplementado usado e conduzi-lo para os poços dois a cinco a seis psi pelo restante do experimento. Aqueça previamente a câmara ambiental a 30 graus Celsius.

Em seguida, ligue o microscópio e o software de controle do microscópio. Coloque um objetivo de imersão em óleo com alta abertura numérica no lugar e verifique se os filtros apropriados e os espelhos diagramáticos estão configurados para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial, juntamente com as imagens das fusões proteicas fluorescentes amarelas e vermelhas. Coloque uma gota de óleo de imersão no objetivo e na parte inferior da janela de imagem da placa microfluídica também.

Monte cuidadosamente o dispositivo microfluídico selado sobre a platina do microscópio invertido e fixe-o no lugar. Utilize os marcadores de posição embutidos para trazer a janela de imagem da câmara de cultura microfluídica para o foco. Foque na parte mais à esquerda da primeira câmara de fluxo identificada como A e, em seguida, mova a platina até o tamanho da armadilha cinco, correspondente à altura da armadilha de 7 micrômetros.

No software microfluídico, configure o sistema para carregar as células do poço de entrada oito a quatro psi durante 15 segundos. Após a execução do processo, verifique a densidade celular na câmara de cultivo movendo a platina ao longo da janela de imagem. Caso nenhuma esporo tenha sido retido, repita a etapa de carregamento de células ou, alternativamente, aumente a pressão e/ou o tempo de carregamento até que seja alcançada a densidade celular desejada de um a 10 esporos por janela de imagem.

Tenha cuidado para evitar sobrecarregar a câmara de cultura. Em seguida, inicie o programa de fluxo previamente preparado no software de controle e permita que a placa microfluídica alcance o equilíbrio térmico por uma hora na platina do microscópio antes de iniciar a aquisição de imagens. No software de controle do microscópio, configure uma aquisição multidimensional para capturar múltiplas imagens em diferentes posições da platina ao longo do tempo, especificando primeiro um diretório para o salvamento automático dos arquivos de imagem.

Em seguida, acesse as configurações de iluminação e insira as configurações de iluminação ótimas predeterminadas para cada construto específico. Depois, configure uma série temporal para adquirir imagens a cada 40 minutos durante 24 horas. Para determinar as posições do estágio e definir o foco automático, escaneie a câmara de cultivo e armazene as posições do estágio para cada posição de interesse na imagem.

Certifique-se de que as posições de um único estágio estejam localizadas suficientemente afastadas para minimizar o desbotamento da fluorescência e a fototoxicidade. Após a verificação das coordenadas Z das posições do estágio selecionadas, ative o autofoco de hardware. Em seguida, inicie o experimento de lapso de tempo no software de controle do microscópio.

Interrompa a aquisição de imagens após 24 a 30 horas, ou quando as hifas na região de interesse tiverem se diferenciado em esporos. Em seguida, pare o programa de fluxo no software e desmonte o dispositivo microfluídico. Prepare a placa microfluídica usada para armazenamento de curto prazo removendo todo o meio remanescente dos poços de entrada, do poço de resíduo e do poço de carregamento celular.

Em seguida, complete os poços usados da fileira A e os poços das fileiras não utilizadas com PBS estéril. Por fim, feche a placa com filme aderente para evitar que ela seque e armazene a placa a quatro graus Celsius.

A imagem viva bem-sucedida de todo o ciclo de vida de S.venezuela fornece uma série temporal contínua, incluindo as principais fases do desenvolvimento como germinação, crescimento vegetativo e esporulação. Durante a germinação ou o crescimento vegetativo, DivIVA-mCherry se acumula exclusivamente nas pontas apicais em crescimento ou marca pontos recém-formados de ramificação hifal. Em contraste, FtsZ-YPet forma estruturas únicas em formato de anel em intervalos irregulares no micélio em crescimento.

Essas estruturas fornecem o arcabouço para a síntese de paredes transversais vegetativas não construtivas, levando à formação de compartimentos hifais interconectados. Em hifas esporulantes, o padrão de localização de FtsZ-YPet muda drasticamente. Primeiro, filamentos helicoidais de FtsZ-YPet se movem ao longo da hifa, e então, em um evento súbito e quase sincronizado, essas hélices se fundem em uma escada de anéis de FtsZ-YPet regularmente espaçados.

Finalmente, os septos de esporulação tornam-se discerníveis nas imagens de contraste de interferência diferencial e, eventualmente, os novos esporos são liberados. Esta técnica fornece um protocolo robusto para realizar a microscopia de células vivas de todo o ciclo de vida de Streptomyces. O sistema microfluídico é fácil de usar.

Oferece flexibilidade experimental e permite o monitoramento de longo prazo desses eventos. Esse conjunto experimental também oferece um excelente ponto de partida para investigar eventos específicos de desenvolvimento em resposta a alterações nas condições de cultivo ou ao uso de corantes fluorescentes para monitorar a síntese de peptidoglicano ou para visualizar a organização do cromossomo.