Fluorescência tempo-lapso da completa S. venezuelae Ciclo de Vida Usando um dispositivo micro

O objetivo geral deste protocolo de microscopia de lapso de tempo fluorescente é fornecer um método para estudar processos celulares biológicos que sustentam o desenvolvimento e a diferenciação celular na bactéria filamentosa esporulante, Streptomyces venezuelae. O método descrito fornece uma excelente plataforma para estudar processos biológicos celulares que são centrais para o ciclo de vida de Streptomyces, incluindo localização dinâmica de proteínas, crescimento polarizado e septação de esporulação. A principal vantagem dessa técnica é que Streptomyces venezuelae esporula em líquido, o que nos permite cultivar as células em um dispositivo microfluídico e monitorar microscopicamente o ciclo de vida completo.

Este método demonstra o imenso potencial de Streptomyces venezuelae como um novo sistema de desenvolvimento para o gênero, pois permite a imagem de células vivas da diferenciação de um micélio multicêntrico em cadeias de esporos. Para começar, inocule 30 mililitros de meio de crescimento suplementado com 10 microlitros de esporos da cepa S.venezuela a serem fotografados. Para um crescimento consistente e esporulação das células, use um frasco defletor ou um frasco que contenha uma mola para permitir aeração suficiente.

Cultive as células por 35 a 40 horas a 30 graus Celsius e 250 RPM. Quando estiver pronto, você poderá ver os fragmentos miceliais e esporos por meio de microscopia de contraste de fase montada em líquido. Centrifugue um mililitro da cultura em uma centrífuga de mesa a 400 vezes G por um minuto para granular o micélio e os fragmentos de células maiores.

Em seguida, transfira aproximadamente 300 microlitros do sobrenadante contendo uma suspensão de esporos, para um novo tubo de 1,5 milímetro e coloque o tubo no gelo. Guarde o meio de cultura restante para uso em uma etapa posterior. Em seguida, dilua os esporos de um a 20 em meio de crescimento suplementado e mantenha os esporos diluídos no gelo até que sejam necessários.

Despeje o meio de cultura restante em um béquer de 50 mililitros e, em seguida, retire 10 mililitros com uma seringa e use um filtro de seringa estéril de 22 micrômetros para filtrar e esterilizar o meio de cultura restante. Para obter meio de crescimento suplementado gasto que esteja livre de esporos e fragmentos miceliais. Manter o meio de crescimento suplementado filtrado durante alguns dias a quatro graus Celsius se forem realizadas experiências adicionais, utilizando condições de crescimento semelhantes.

Cada placa microfluídica pode ser usada para até quatro experimentos independentes. Para evitar contaminar as câmaras de fluxo não utilizadas, certifique-se de usar soluções estéreis e condições de trabalho ao configurar o experimento. Comece removendo a solução de transporte da placa microfluídica.

Em seguida, enxágue os poços com meio de crescimento suplementado estéril. Depois de enxaguado, adicione 300 microlitros do meio de crescimento suplementado à entrada do poço um e 300 microlitros do meio de crescimento suplementado gasto aos poços de dois a seis. Em seguida, carregue 40 microlitros dos esporos diluídos no poço oito da pista A e sele o coletor na placa de acordo com as instruções do fabricante.

Inicie o software de controle do microfluídico e selecione o tipo de placa apropriado. Configure um programa de fluxo para fluir o meio dos poços de entrada de um a cinco a seis psi por dois minutos por poço, a fim de preparar o canal de fluxo e a câmara de cultura. Em seguida, faça com que ele flua o meio de crescimento suplementado a seis psi no poço de entrada um por seis horas.

Isso permitirá que a germinação e o crescimento vegetativo ocorram. Faça com que o programa mude após seis horas para o meio de crescimento suplementado gasto e flua-o para os poços de dois a cinco a seis psi pelo restante do experimento. Pré-aqueça a câmara ambiental a 30 graus Celsius com antecedência.

Em seguida, ligue o microscópio e o software de controle do microscópio. Coloque uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica e confirme se os filtros apropriados e espelhos diagramáticos configurados para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial, juntamente com as imagens das fusões de proteínas fluorescentes amarelas e fluorescentes vermelhas estão no lugar. Coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva e também na parte inferior da janela de imagem na placa microfluídica.

Monte cuidadosamente o dispositivo microfluídico selado no stage do microscópio invertido e prenda-o no lugar. Use os marcadores de posição incorporados para focar a janela de imagem da câmara de cultura microfluídica. Concentre-se na parte mais à esquerda da primeira câmara de fluxo rotulada como A e, em seguida, mova o estágio para o tamanho cinco do purgador, correspondendo à altura do purgador de 7 micrômetros.

No software microfluídico, configure o sistema para carregar células do poço de entrada oito a quatro psi por 15 segundos. Após a execução do processo, verifique a densidade celular na câmara de cultura movendo o estágio pela janela de imagem. Se nenhum esporo estiver preso, repita a etapa de carregamento celular ou, alternativamente, aumente a pressão e/ou o tempo de carregamento até que a densidade celular desejada de um a 10 esporos por janela de imagem seja alcançada.

Tome cuidado para evitar sobrecarregar a câmara de cultura. Em seguida, inicie o programa de fluxo previamente preparado no software de controle e permita que a placa microfluídica aqueça por uma hora no estágio de microscópio antes de iniciar a aquisição da imagem. No software de controle do microscópio, configure uma aquisição multidimensional para obter várias imagens em várias posições de estágio ao longo do tempo, especificando primeiro um diretório para o salvamento automático dos arquivos de imagem.

Em seguida, vá para as configurações de iluminação e insira as configurações de iluminação ideais predeterminadas para cada construção específica. Em seguida, configure uma série temporal para adquirir imagens a cada 40 minutos por 24 horas. Para determinar as posições da platina e definir o foco automático, escaneie a câmara de cultura e armazene as posições da platina para cada posição de imagem de interesse.

Certifique-se de que as posições de estágio único estejam localizadas distantes o suficiente para minimizar o branqueamento fotográfico e a toxicidade da foto. Depois que as coordenadas Z das posições de palco selecionadas forem verificadas, ative o foco automático do hardware. Em seguida, inicie o experimento de lapso de tempo no software de controle do microscópio.

Interrompa a aquisição da imagem após 24 a 30 horas, ou quando as hifas na região de interesse se diferenciarem em esporos. Em seguida, pare o programa de fluxo no software e desmonte o dispositivo microfluídico. Prepare a placa microfluídica usada para armazenamento de curto prazo, removendo qualquer meio restante dos poços de entrada, do poço de resíduos e do poço de carregamento de células.

Em seguida, encha os poços usados da pista A e os poços das pistas não utilizadas com PBS estéril. Por fim, sele a placa com filme de pêra para evitar que seque. E armazene o prato a quatro graus Celsius.

A imagem bem-sucedida de células vivas de todo o ciclo de vida da S.venezuela produz uma série temporal contínua, incluindo os principais estágios de desenvolvimento de germinação, crescimento vegetativo e esporulação. Durante a germinação ou crescimento vegetativo, DivIVA-mCherry se acumula exclusivamente nas pontas dos hipinos em crescimento ou marca pontos de ramificação de hifas recém-formados. Em contraste, FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis únicos em intervalos irregulares no micélio em crescimento.

Essas estruturas fornecem o andaime para a síntese de paredes transversais vegetativas não construtivas, levando à formação de compartimentos hifais interconectados. Nas hifas esporulantes, o padrão de localização de FtsZ-YPet muda drasticamente. Primeiro, os filamentos helicoidais de FtsZ-YPet caem ao longo da hifa e, em seguida, em um evento repentino, quase síncrono, essas hélices se aglutinam em uma escada de anéis FtsZ-YPet regularmente espaçados.

Finalmente, os septos de esporulação tornam-se discerníveis nas imagens de contraste de interferência diferencial e, eventualmente, os novos esporos são liberados. Esta técnica fornece um protocolo robusto para realizar imagens de células vivas do ciclo de vida completo de Streptomyces. O sistema microfluídico é fácil de usar.

Oferece flexibilidade experimental e permite o monitoramento de longo prazo do Esta configuração experimental também oferece um ótimo ponto de partida para investigar eventos específicos de desenvolvimento em resposta a mudanças nas condições culturais ou ao uso de corantes fluorescentes para monitorar a síntese de peptidoglicanos ou para visualizar a organização cromossômica.