Name: A transferência de genes para o frango auditivo órgão por In Ovo Micro-eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de micro-eletroporação in ovo para manipulação genética no órgão auditivo do frango a partir do quarto dia embrionário. Este método facilita o estudo da proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas sem cirurgias complexas.

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Agradecemos ao Dr. Doris K. Wu por plasmídeos de expressão e sondas in situ, o Centro Universitário Johns Hopkins para a instalação de imagem Biologia Sensorial e do Centro de Audição e Equilíbrio. Este trabalho foi apoiado por NIDCD Grant T32 DC000023 a LE

Os ovos e embriões não eclodidos são cuidadas e tratadas de forma ética e humana. Todos os protocolos de utilização de embriões unhatched foram aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use na Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore, Maryland. 1. Os ovos e Preparação de construções de expressão <ol><li> Ovos: <ol><li> Incubar 3-4 dúzia de ovos de galinha fertilizados (Gallus gallus) deitado em seus lados a 37 ° C. <ol><li> Após 24 horas de incubação, puxe 3 cc de albumina com uma seringa a partir da extremidade traseira rodada do ovo e selar o buraco com fita adesiva transparente. Isto cria uma câmara de ar entre o embrião e a casca do ovo, permitindo a facilidade de acesso para o embrião sem o embrião que adere ao invólucro de corte quando a janela de acesso no topo do ovo 19. </li><li> Em 117 horas de tempo de incubação, encenar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton 20 estágios de desenvolvimentoa E4 (HH24-25) (ver figura 1D). </li></ol></li></ol></li><li> Expressão Constrói: <ol><li> Prepara-se o ADN do plasmídeo usando reagentes e o protocolo fornecido pelo fabricante do kit de uma preparação disponível comercialmente. No passo final da preparação, eluir o ADN em 500 ul de TE (Tris-EDTA) tampão fornecido no kit para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Etanol precipitar o ADN para concentrá-la por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M e 1 ml de etanol a 100% ao tubo. Colocar o tubo à temperatura de -20 ° CO / N. </li><li> Centrifuga-se o tubo durante 30 minutos a 14000 rpm a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ar-secar o sedimento durante 10 minutos à TA. Dissolve-se o sedimento em 15 ul de tampão TE, os quais devem produzir uma concentração de ~ 4 mg / mL. NOTA: O construções de expressão de controlo utilizados aqui são PMES-IRES-GFP, 10, que é conduzido por um promotor de frango β-actina, ou pCI-H2B-IRES-RFP <saté&gt; 10, que é conduzida pelo promotor de CMV. </li></ol></li></ol> 2. galinha In Ovo Micro-electroporação e In Ovo celular Ensaio de Proliferação <ol><li> Em Ovo Micro-injecção de construção de expressão e Micro-eletroporação: <ol><li> Retire os tubos capilares de vidro em agulhas finas utilizando um extractor de micropipeta com os seguintes parâmetros optimizados para um 2,5 x 2,5 milímetros Caixa de platina de aquecimento de filamento: Pressão = 500, de calor = 600 ° C, Pull = 64, velocidade = 105, e Tempo = 150 mseg (ver Tabela 1). </li><li> Configure a esquerda e para a fase micro-manipulador destros flanqueando o microscópio (ver Figura 1A). O micro-manipulador Destro segura a agulha capilar de vidro e micro-manipulador canhota detém os eletrodos (Figura 1A). </li><li> Prepare a agulha finamente puxado capilar de vidro para micro-injecção, cortandoa ponta da agulha com uma pinça, enquanto trabalha com o microscópio. </li><li> Encher a agulha manualmente à mão usando o micro-manipulador com 2,5 ul de ADN de plasmídeo coloridas com 0,1% de Fast Green, enquanto que trabalham sob o microscópio. </li><li> Coloque o ovo deitado de lado dentro de um dispositivo de suporte para moldes / ovo (ver Figura 1A). Cortar uma janela redonda na parte superior do ovo usando uma tesoura 19 (Figura 1A). </li><li> Enquanto trabalhava sob o microscópio, abra com cuidado as duas membranas que recobrem o embrião usando uma pinça. </li><li> Ao trabalhar sob o microscópio, entregar aproximadamente ~ 0,5 ul de ADN de plasmídeo para o lúmen vesícula ótica direita por micro-injecção manualmente utilizando a mão direita, utilizando o micro-manipulador e por micro-electroporação. <ol><li> Para tal, a micro-injectar o lúmen vesícula ótica direita com o ADN com o lado direito do micro-manipulador (Figura 1B-D), ao mesmo tempo usando a mão esquerda Holdinga pinça para segurar a cabeça do embrião, porque a cabeça do embrião mergulha na fase E4. Não micro-injetar passado o lúmen vesícula ótica, porque isso irá prejudicar a vesícula ótica. </li><li> Imediatamente após a micro-injecção, enquanto trabalhava sob o microscópio, use a Esquerda mão micro-manipulador para colocar o positivo (ânodo) 2 milímetros eletrodo de platina ântero-ventral à vesícula ótica direita e o eletrodo de 2 milímetros negativo (cátodo) em paralelo 1 mm entre si (ver Figura 1 C). Deliver 4 impulsos a 12 V com 100 mseg de duração e espaçamento 200 mseg. A vesícula ótica esquerda serve como um controlo não tratado interno. NOTA: Limpe os eléctrodos entre electroporations com um chumaço de algodão embebido em 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li> In Ovo celular Ensaio de Proliferação: <ol><li> Imediatamente após a electroporação adicionar 50 uL de 0,25 mg / mL em 1X PBS EdU soltando manualmente a solução EdU 50 ul para o conjuntoembrião no ovo usando uma pipeta. Selar os ovos com fita e retornar para o incubador durante 18-96 horas. </li><li> Remova cuidadosamente a fita e verifique os embriões para GFP fluorescente ou sinal de RFP dentro da vesícula ótica após 18-24 horas usando um microscópio de fluorescência padrão (veja a Figura 1 EE &#39;). Se o sinal fluorescente está presente, neste ponto colher os embriões para análise ou feche com fita adesiva e devolvê-lo para a incubadora para a colheita e analisa em fases posteriores (ver Figura 1 FP &#39;&#39;). NOTA: Expressão de sinal de GFP com o constructo PMES-IRES-GFP é evidente 6-7 horas após a electroporação 10. </li></ol></li></ol> Colheita 3. Embryo e processamento de tecidos para o RNA hibridização in situ e imuno-histoquímica <ol><li> Colher os embriões usando uma pinça. Lavar o embrião em 1x PBS frio. Retirar as cabeças dos embriões, cortando a cabeça por seu pescoçousando uma pinça e coloque as cabeças em paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C. Perfurar o cérebro utilizando um fórceps para permitir a penetração do paraformaldeído 4% dentro da cabeça. </li><li> Desidratar as cabeças em 30% de sacarose (em 1x PBS) O / N a 4 ° C. </li><li> Montar as cabeças em forma crioprotector por congelação rápida em uma suspensão de gelo seco e metilbutano (2-metilbutano). Alternativamente, rápida congelar as cabeças em meio crioprotector com nitrogênio líquido. Armazenar as cabeças montadas à temperatura de -80 ° C. </li><li> Criocorte as cabeças em 12 mm cortes de tecidos grossos e recolher todas as secções de tecido contendo ouvido interno em lâminas de microscópio de vidro superfrosted. </li><li> Realizar ARN padrão de hibridação in situ e imuno-histoquímica como previamente descrito 4,21, analisar e para a proliferação celular EdU seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante do kit. NOTA: As células ciliadas podem ser identificadas usando policlonais de coelho α-MyosinVIIa (MYO7A) umtibody (1: 1000, Proteus Biosciences) e o anticorpo secundário marcado fluorescentemente (1: 250, de cabra anti-coelho AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> 4. Captura e Processamento de Imagem <ol><li> Tire fotos com equipamentos de imagem digital. Resultados de imunohistoquímica imagem com um microscópio de fluorescência padrão e os resultados dos controlos no local utilizando um microscópio de campo amplo padrão (que varia de 5x a 40x em ampliação). </li><li> Processar as imagens usando o software de processamento de imagem. </li></ol>

<ol><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método aqui descrito de in ovo micro-electroporação é optimizado para a transferência de genes para o órgão auditivo em desenvolvimento. É compatível com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo tipicamente usadas para manipular a função do gene / expressão. O momento da eletroporação na E4 é o ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. Os passos mais críticos são micro-injecção do ADN para o lúmen vesícula ótica sem ir muito profunda, com a agulha e danifi...

Apesar das diferenças na morfologia e padronização celular entre os mamíferos e órgão sensorial auditiva aviária, os fatores moleculares e vias responsáveis ​​pelo desenvolvimento HC sensorial são pensados ​​para ser evolutivamente conservada 1-3. A papila basilar, que abriga os HCs auditivas e suas SCs circundantes, se desenvolve como um outpocketing do otocyst ouvido interno. Logo no início de uma piscina de progenitores HC e SC é especificado dentro do placï¿½io ótica ótica domínio / copo neural-sensorial competente (NSD). Dados destino de mapeamento de fornecer evidências de que linhagens neuronais e sensoriais são ligados e surgem da NSD localizada na região antero-ventral do copo ótica ou otocyst em ratos e galinhas 4,5. Em primeiro lugar, neuroblasts delaminate da NSD para dar origem aos neurônios do gânglio auditivo-vestibular, o que acabou dividida em gânglios auditivo e vestibular. Esses neurônios inervam os HCs sensoriais do ouvido interno e núcleos no tronco cerebral. As células Them permanecer no NSD são pensados ​​para dar origem a várias manchas sensoriais, incluindo o órgão auditivo sensorial, que consiste em os HCs sensoriais de transdução mecano e seus SCs associados. Em ambos os pintos e murino, órgão auditivo progenitor sensorial saída do ciclo celular e diferenciação HC ocorrer em gradientes opostos. Em pintinho, progenitor auditiva saída do ciclo celular começa em torno de ~ E5 e progride a partir da base para o ápice, e do centro para a periferia 6. Um dia mais tarde, começa HC diferenciação no vértice e progride para a base 7. Estudando o desenvolvimento do ouvido interno em frango proporciona muitas vantagens técnicas como mecanismos funcionais podem ser investigadas com relativa facilidade in ovo em oposição a manipulação de embriões no útero, em outros sistemas de modelos, que requer cirurgias complexas. O método descrito aqui utiliza in ovo micro-electroporação de genes alvo de interesse no Basila presuntivoárea de papila r ântero-ventral na vesícula ótica especificamente a E4. A electroporação in ovo é uma técnica que está bem estabelecida e utilizada 8-14. O princípio da técnica de electroporação, é baseado no facto de nucleótidos (por exemplo, ADN de plasmídeo, DNA sintético, RNA ou oligonucleótidos) são carregadas negativamente. O ADN é injectada no tecido de interesse. Quando uma corrente eléctrica é colocada ao longo do tecido, a actual abre poros transientes nas paredes das células e permite a captação do ADN, como flui do ADN carregado negativamente em direcção ao eléctrodo positivo (ânodo). Para as experiências de ganho-de-função, os genes de interesse são subclonados em vulgarmente plasmídeos de expressão que contêm cassetes de expressão adequados para a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente vermelha (RFP). Para as experiências de construções de perda de função com base em plasmídeos dominantes negativos repressores, ou RNAi, ou construções morfolino são commonly usado 15,16. Para inibir microARN (miARN) função miARNs construções de esponja, que são tipicamente plasmídeo com base, pode ser usado 17. O método aqui descrito permite investigar os mecanismos moleculares que controlam a proliferação e diferenciação no órgão auditivo, em que o método de micro-electroporação in ovo pode ser facilmente combinado com no ensaio de proliferação celular in ovo adicionando EdU a todo o embrião. A electroporação e a adição de EdU é realizada em E4 na vesícula ótica, que é um dia antes do início da saída do ciclo celular no órgão auditivo. Análise do órgão auditivo é tipicamente realizada 18-96 horas após a electroporação em E5 (aparecimento de células progenitoras saída sensorial do ciclo celular), E6 (início da diferenciação HC), e E7 (durante a diferenciação HC); e mais tarde até ~ E9 (fim da diferenciação HC). Este método de electroporação de transferência de genes é transitória que dura aproximadamente 4 dias ~, because os genes de interesse não se integram no genoma, mas o método é aplicável para utilização com vectores de expressão à base de ADN de plasmídeo apropriado, que têm a capacidade de integrar no genoma, tal como a transferência de genes mediada Tol2-11. Com este método GFP robustos ou expressão RFP dura ~ 4 dias na cóclea, após o que apontam os sinais desaparecem, mas fornecem uma janela de tempo suficiente para estudar o desenvolvimento intrincado do órgão auditivo. Este, por método de transferência de genes in ovo é novo e permite que visar especificamente o órgão auditivo presuntivo em E4, que é ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. É um bom complemento para métodos alternativos, que electroporate em muito mais jovens estágios de desenvolvimento 11,12 ou em comparação com o uso de in vitro papilas basilar de explantes culturas 18.

<table><tbody><tr><td>Estéril 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana para Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Destro & Micromanipuladores Canhotos</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R & M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Dois Dispositivos de Fixação Magnética de 12 mm com Postes Verticais de 7 polegadas</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td>Placa de Base de Aço Metálico <td>M10</td><td></td></tr><tr><td>12x24 polegadas</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras para ovos com 12 cm de comprimento curvas, lâminas extrafinas de 12 mm; Tesoura de Mola</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta para puxar agulhas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Caixa de Filamento de Aquecimento de Platina</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Capilares de Vidro/Agulhas/Sem Fibra/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Vidro Hamilton 100 &mu; l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Modelo 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Mineral (Pesado) para Seringa de Vidro</td><td>Hamilton Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Polietileno para conectar a Seringa de Vidro e Agulhas Cappilares de Vidro/ Não Tóxico</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Seringas Descartáveis</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas descartáveis de calibre 21</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Um par de eletrodos de platina de 2 mm</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Um par de pinças finas Dumont número 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fita invisível com acabamento fosco para selar ovos</td><td>Cotonetes de Algodão Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Pontas</td><td></td><td></td><td></td> de filtro estéreis</tr></tbody></table>

a transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; in ovo</em&gt; micro-eletroporação

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Embriões de galinha são sistemas modelo ideal para estudar o desenvolvimento embrionário como manipulações da função do gene pode ser realizada com relativa facilidade in ovo. O ouvido interno órgão sensorial auditivo é fundamental para a nossa capacidade de ouvir. Ele abriga um epitélio altamente especializada sensorial que consiste em células ciliadas de transdução mecano (HCs) e envolvente glial-como células de suporte (SCS). Apesar das diferenças estruturais nos órgãos auditivos, os mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento do órgão auditivo são evolutivamente conservada entre mamíferos e aves Em electroporação in ovo é largamente limitado a fases precoces em E1 -. E3. Devido ao desenvolvimento tardio relativa do órgão auditivo na E5, manipulações do órgão auditivo por em eletroporação in ovo passado E3 são difíceis devido ao desenvolvimento avançado do embrião de galinha em fases posteriores. O método aqui apresentado é um método de transferência de genes transitória para alvejar genes de interesse noestágio E4 - E4.5 no frango auditivo órgão sensorial desenvolvimento via in ovo micro-eletroporação. Este método é aplicável para gain- e perda de funções com vectores de expressão baseados em DNA de plasmídeo convencional e pode ser combinada com a proliferação celular num ensaio in ovo adicionando EdU (5-etinil-2&#39;-desoxiuridina) para todo o embrião no tempo de electroporação. O uso da proteína fluorescente verde ou vermelho (GFP ou RFP) plasmídeos de expressão permite que o experimentador para determinar rapidamente se a eletroporação alvo com sucesso a porção auditiva do ouvido interno em desenvolvimento. Neste trabalho método, exemplos representativos dos espécimes GFP electroporadas são ilustrados; embriões foram recolhidas 18-96 horas após a electroporação e a segmentação de GFP à região pró-sensitivo do órgão auditivo foi confirmada por RNA de hibridação in situ. O papel método também proporciona um protocolo optimizado para a utilização da timidina EdU analógico para analisar célula prolifração; um exemplo de um ensaio de proliferação celular baseado EdU que combina imuno-marcação e clique EdU química é fornecida.

Neste ADN método papel plasmídeo consistindo de proteína fluorescente verde (GFP) cassetes de expressão foi alvo para o desenvolvimento de frango papila basilar (PA), com parâmetros optimizados de 12 V e 4 impulsos com 100 duração do impulso mseg e intervalos de 200 mseg, obtendo-se uma ~ taxa de sobrevivência embrionária 50% e eficiência de plasmídeo de DNA alvo para a BP. Imagiologia de fluorescência da expressão da GFP nativa no desenvolvimento de embriões mostraram este método de ele...

O órgão auditivo medeia a audição. Aqui apresentamos um método de micro-eletroporação in ovo modificado otimizado para estudar a proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas no órgão auditivo de galinhas em desenvolvimento.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

O objetivo geral deste método é realizar manipulações genéticas no órgão auditivo em desenvolvimento do frango a partir do quarto dia embrionário em diante. Isso é significativo devido à dificuldade de trabalhar com estágios avançados de desenvolvimento do embrião de frango. A principal vantagem desta técnica é que ela direciona especificamente o órgão auditivo em desenvolvimento in ovo com relativa facilidade, em comparação com outras técnicas que exigem cirurgias complexas in utero.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento sensorial auditivo, incluindo como são coordenados os padrões espacial e temporal da proliferação de células progenitoras sensoriais e da diferenciação hereditária. Para iniciar este procedimento, fixe a agulha capilar de vidro utilizando o tubo conectado à seringa de vidro, que é colocada no micromanipulador da mão direita, e posicione os eletrodos no micromanipulador da mão esquerda.Sob o microscópio, corte a ponta da agulha usando um par de pinças. Em seguida, coloque 2,5 microlitros de DNA plasmático corado com azul de metileno a 0,1% em um recipiente. Preencha a agulha com o DNA plasmático utilizando o êmbolo da seringa acoplada ao micromanipulador da direita.Coloque um ovo de lado em um dispositivo de fixação. Em seguida, corte uma janela redonda na parte superior do ovo usando uma tesoura. Depois disso, coloque o ovo no dispositivo de fixação sob o microscópio.Abra cuidadosamente as duas membranas que recobrem o embrião usando uma pinça para expor a vesícula ótica direita. Enquanto estabiliza a cabeça do embrião com a pinça usando a mão esquerda, aplique aproximadamente 0,5 microlitros de DNA plasmidial com o micromanipulador da mão direita. Tenha cuidado para não injetar além da luz da vesícula ótica, pois isso danificará a vesícula ótica.A microinjeção de DNA na luz da vesícula ótica sem danificar a vesícula ótica é um procedimento crítico e requer o uso de ambas as mãos. Imediatamente após a microinjeção, utilize o micromanipulador da mão esquerda para posicionar o conjunto de eletrodos de platina positivo e negativo de dois milímetros anteriormente e ventralmente à vesícula ótica direita e aplique quatro pulsos a 12 volts operando o eletroporador. A colocação precisa dos eletrodos na região anterior e ventral da área presumível do órgão auditivo é importante e garante que o órgão auditivo em desenvolvimento seja atingido.Imediatamente após a eletroporação, adicione 50 microlitros de EdU sobre todo o embrião in ovo. Em seguida, feche o ovo com fita adesiva. Retorne todos os ovos manipulados e fechados para a incubadora por 18 a 96 horas.Após 18 a 24 horas, remova cuidadosamente a fita. Verifique os embriões quanto ao sinal fluorescente de GFP ou RFP dentro da vesícula otica utilizando um microscópio fluorescente padrão. Se houver sinal fluorescente, colete os embriões para análises ou re-selos com fita e devolva-os ao incubador para coleta e análises em estágios posteriores.A hibridização in loco de RNA foi utilizada para determinar se a eletroporação atingiu com sucesso a porção auditiva da orelha interna em desenvolvimento. Dentro do BP em desenvolvimento, os precursores sensoriais foram identificados pela expressão de Sox2 e Lunatic Fringe. Essas imagens demonstram que os precursores sensoriais em todo o BP em desenvolvimento, na base e no ápice, foram atingidos com sucesso e expressaram GFP após 68 horas de eletroporação.Além disso, a GFP foi expressa fora do domínio sensorial em células epiteliais não sensoriais e no gânglio auditivo marcado pela expressão de Neurod1. Para determinar o comportamento proliferativo dos progenitores sensoriais, o EdU, um análogo da timidina, foi adicionado no momento da eletroporação no E quatro e, quatro dias depois, a incorporação de EdU na BP em desenvolvimento foi analisada em cortes de tecido. A imunomarcação para a proteína específica de células ciliadas, Myosin7a, foi utilizada para identificar células ciliadas em diferenciação na BP em desenvolvimento. Na porção apical da BP, as células ciliadas positivas para Myo7a frequentemente eram positivas para EdU.Enquanto na base, apenas algumas células ciliadas positivas para Myo7a haviam incorporado EdU, sugerindo que no momento da adição de EdU no E quatro, os progenitores sensoriais na base já são em grande parte pós-mitóticos. Após dominar esta técnica, ela pode ser concluída em cinco a oito minutos por ovo. Durante a realização deste procedimento, é importante usar reagentes recém-preparados e estéreis para garantir a sobrevivência dos embriões.Após este procedimento, os parâmetros do método podem ser modificados para estudar outros fenômenos no ouvido interno em desenvolvimento, como a formação dos órgãos vestibulares e a neurogênese do ouvido interno. Esta técnica abre caminho para pesquisadores da área do ouvido interno estudarem especificamente o órgão auditivo de frango, que se desenvolve relativamente tarde, a partir do quarto dia embrionário em diante. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular adequadamente o embrião de frango, realizar microinjeção e eletroporação, além de conduzir o ensaio de proliferação celular in ovo.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

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Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que...

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens...

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.

Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo

Aprenda a técnica de micro-eletroporação in ovo para manipulação genética no órgão auditivo do frango a partir do quarto dia embrionário. Este método facilita o estudo da proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas sem cirurgias complexas.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por

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