A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

O objetivo geral deste bioensaio simples baseado em células é detectar, quantificar e monitorar a atividade dos membros da família de liginas do fator de crescimento endotelial vascular. Este método pode responder a questões-chave em biologia vascular, virologia, câncer e oftalmologia, onde as liginas da família VEG-FR irradiam processos-chave nessas doenças. A principal vantagem deste ensaio é que ele permite a avaliação das liginas da família VEG-FM em termos de sua capacidade de se ligar e reticular seus diferentes receptores sem a necessidade de células epiteliais especializadas.

Cultivar a linha celular secretora de IL3 WEHI-3D pipetando cinco vezes dez até a sexta células na face logarítmica do crescimento em quatro a dez frascos T175 contendo 50 milímetros de meio de cultura fresco. Incube por sete dias ou até que as células tenham passado da fase logarítmica de crescimento em cerca de 24 a 48 horas. Decantar o líquido e as células dos frascos.

E gire a 1.000 Gs por 15 minutos para remover células e detritos celulares. Em seguida, remova os 90% superiores do supernaytent e filtre-o através de uma unidade de filtro de 0,22 mícron. Alíquota do meio condicionado em alíquotas de um mililitro para preparação do ensaio.

Alíquotas de 50 mililitros para fazer meio de cultura para passar por linhagens celulares dependentes de um fator e volumes de 200 mililitros para armazenamento de longo prazo a 20 graus Celsius. Armazene os volumes menores a 20 graus Celsius. Controle de cultura de células BAF3 em meios de cultura contendo meio condicionado 10% WEHI-3D.

e células VegFR2-EPoR-BAF3 no mesmo meio mais um miligrama por mililitro G418. Células de passagem em uma a 15 diluições de células crescendo na fase logarítmica. Colete células BAF3 ou VegFR2VPoR-BAF3 de controle para culturas de fase logarítmica intermediária.

Pipetando suavemente para remover as células do fundo do frasco, centrifugue a 750 Gs por cinco minutos para recuperar o pellet celular. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de tonicidade de camundongo e centrifugue novamente a 750 Gs por cinco minutos. Repita a lavagem mais duas vezes para remover o meio contendo IL3.

Lave as células uma vez usando meio sem meio condicionado DEHI-3D. É importante lavar o meio de cultura contendo IL3 para garantir que não haja fatores de crescimento adicionais, o que pode gerar um resultado falso positivo ou alta atividade de fundo. Após centrifugação e descarte, as células de ressuspensão de supernayten no mesmo meio livre de IL3 a uma concentração de 7,4 vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro.

Finalmente, misture volumes iguais de azul de tripano em PBS com uma população de células e carregue em um hemacitômetro. Conte pelo menos 100 células. As células que absorvem o corante são consideradas mortas ou moribundas.

É fundamental que as células usadas para o ensaio tenham alta viabilidade para garantir que sejam capazes de responder às condições do ensaio. Use uma pipeta automatizada P20 bem calibrada e pontas autoclavadas para adicionar 1.000 células em 13,5 microlitros de meio deficiente em IL aos poços de uma placa de 72 poços. Tome cuidado para misturar a suspensão celular durante a alíquota para garantir que a sedimentação da célula por gravidade não influencie a concentração da célula.

Use uma pipeta P2 bem calibrada para adicionar 1,5 microlitros de meio livre de IL3 em triplicata aos poços de controle. Complexidade para misturar. Da mesma forma, adicione o meio condicionado 10%WEHI-3D e o controle de 100 nanogramas por mililitro VegFA no IL3 aos poços desejados.

Por fim, adicione 1,5 microlitros das amostras de teste em triplicata. Encha todos os poços não utilizados da placa de micropoços com água estéril, PBS ou meio. Coloque o lenço de papel embebido em água em um recipiente permeável a gás para criar uma câmara umidificada que permita a troca gasosa.

Incubar as placas de ensaio nas câmaras em uma atmosfera umidificada de 10% de dióxido de carbono por 16 horas. Após 16 horas de incubação, analise as placas usando um microscópio de fase invertida padrão com ampliação de 40 a 100x. Neste momento é possível discriminar entre amostras positivas e negativas.

Poços sem suporte de fatores de crescimento ou apenas com meio terão número reduzido de células redondas, bem como células mortas ou moribundas e detritos celulares. Considerando que as células incubadas com meio contendo IL3 ou ligina para VegFR2 são grandes e translúcidas e não há ou há evidência mínima de granularidade no citoplasma celular ou detritos celulares na cultura. Adicione 10.000 células lavadas em 135 microlitros de meio deficiente em IL3 aos poços de uma placa padrão de 96 poços.

Use uma pipeta P20 calibrada para adicionar 15 microlitros das amostras de teste e controles aos poços. Incubar a mistura de células fatores de crescimento e/ou agentes inibidores como antes por 48 horas. Ao final do período de incubação, avalie o número de células viáveis nos poços usando os métodos descritos na parte escrita do protocolo.

Aqui estão representados os resultados de um ensaio no qual o bioensaio VEGF-R2 EPoR BAF3 é usado para quantificar a atividade das três liginas humanas reclinadas com especificidade para VEGF-R2. VEGF-A165, VEGF-C e VEGF-D. A atividade foi quantificada na presença de bevacizumabe, um anticorpo monoclonal inibitório do VEGF-A165 ou na presença de trastuzumabe, um anticorpo não neutralizante.

Os dados foram normalizados em comparação com a resposta apenas ao VEGF-A165. Como esperado, o bevacizumabe bloqueou o efeito do VEGF-A165 no ensaio, mas não teve efeito na atividade do VEGF-C e do VEGF-D. As células expostas à IL3 foram altamente viáveis.

Considerando que aqueles expostos a nenhum fator de crescimento adicional mostram baixa viabilidade. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que eles são uma variedade de agentes de controle em meios condicionados que precisam ser gerados antes do ensaio. Essa técnica abriu caminho para o ressurgimento em biologia vascular, virologia, câncer e opthomologia para explorar o papel do VEG-FM nas liginas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar as células do bioensaio, executar o bioensaio e realizar as análises quantitativas ou semiquantitativas da atividade da ligina VEG-FM.