A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

O objetivo geral deste bioensaio celular simples é detectar, quantificar e monitorar a atividade dos membros da família de ligantes do fator de crescimento endotelial vascular. Este método pode responder perguntas fundamentais em biologia vascular, virologia, câncer e oftalmologia, onde os ligantes da família VEG-FR regulam processos-chave nessas doenças. A principal vantagem deste ensaio é que ele permite a avaliação dos ligantes da família VEG-FM em termos de sua capacidade de se ligar e promover a ligação cruzada com seus diferentes receptores, sem a necessidade de células epiteliais especializadas.

Cultive a linhagem celular secretora de IL3 WEHI-3D pipetando cinco vezes dez à sexta potência de células na fase logarítmica de crescimento em quatro a dez frascos T175 contendo 50 mililitros de meio de cultura fresco. Incube por sete dias ou até que as células tenham ultrapassado sua fase logarítmica de crescimento em cerca de 24 a 48 horas. Decante o fluido e as células dos frascos.

E centrifugar a 1.000 Gs por 15 minutos para remover células e debris celulares. Em seguida, remover 90% do sobrenadante e filtrá-lo através de uma unidade de filtro de 0,22 mícrons. Aliquotar o meio condicionado em alíquotas de um mililitro para preparação do ensaio.

Alíquotas de 50 mililitros para preparar meio de cultura para repicagem de linhagens celulares dependentes de fator e volumes de 200 mililitros para armazenamento de longo prazo a 20 graus Celsius. Armazene as alíquotas menores a 20 Celsius. Cultive as células controle BAF3 em meio de cultura contendo 10% de meio condicionado WEHI-3D.

e células VegFR2-EPoR-BAF3 no mesmo meio acrescido de um miligrama por mililitro de G418. Subcultive as células em diluições de um para 15 a partir de células em fase de crescimento logarítmico. Colete células BAF3 controle ou células VegFR2-EPoR-BAF3 em culturas na fase logarítmica média.

Pipete cuidadosamente para remover as células do fundo do frasco, centrifugue a 750 Gs durante cinco minutos para recuperar o pellet celular. Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de tonicidade ajustada para camundongo e centrifugue novamente a 750 Gs durante cinco minutos. Repita a lavagem mais duas vezes para remover o meio contendo IL3.

Lave as células uma vez usando meio sem meio condicionado DEHI-3D. É importante remover completamente o meio de cultura contendo IL3 para garantir que nenhum fator de crescimento adicional permaneça, o que poderia gerar um resultado falso positivo ou atividade de fundo elevada. Após a centrifugação e descarte do sobrenadante, re-suspenda as células no mesmo meio livre de IL3 numa concentração de 7,4 vezes 10 à quarta células por mililitro.

Por fim, misture volumes iguais de azul de tripano em PBS com uma população celular e carregue em um hemocitômetro. Conte pelo menos 100 células. As células que incorporam o corante são consideradas mortas ou em processo de morte.

É fundamental que as células utilizadas no ensaio apresentem alta viabilidade para garantir que sejam capazes de responder às suas condições de ensaio. Utilize uma pipeta automática P20 bem calibrada e ponteiras autoclavadas para adicionar 1.000 células em 13,5 microlitros de meio deficiente em IL aos poços de uma placa de 72 poços. Tenha o cuidado de misturar a suspensão celular durante a aliquotagem para garantir que a sedimentação celular por gravidade não introduza viés na concentração celular.

Utilize uma pipeta P2 bem calibrada para adicionar 1,5 microlitros de meio livre de IL3 em triplicata aos poços controle. Misture cuidadosamente. Da mesma forma, adicione o meio condicionado de WEHI-3D a 10% e o controle de VegFA a 100 nanogramas por mililitro sem IL3 aos poços desejados.

Finalmente, adicione 1,5 microlitros das amostras-teste em triplicata. Preencha os poços não utilizados da placa de micropoços com água estéril, PBS ou meio. Coloque papel de filtro umedecido com água em um recipiente permeável a gases para criar uma câmara umidificada que permita a troca gasosa.

Incube as placas do ensaio nas câmaras em uma atmosfera umidificada com 10% de dióxido de carbono por 16 horas. Após 16 horas de incubação, analise as placas utilizando um microscópio de contraste de fase invertido padrão com aumento de 40 a 100x. Neste momento, é possível discriminar entre amostras positivas e negativas.

Placas sem suporte de fatores de crescimento ou com meio apenas apresentarão redução no número de células redondas, bem como células mortas ou em degeneração e debris celular. Por outro lado, células incubadas com meio contendo IL3 ou ligante para VegFR2 são grandes e translúcidas, e não há ou há mínima evidência de granularidade no citoplasma celular ou debris celular na cultura. Adicione 10.000 células lavadas em 135 microlitros de meio deficiente em IL3 às cavidades de uma placa padrão de 96 poços.

Utilize uma pipeta calibrada P20 para adicionar 15 microlitros das amostras-teste e controles aos poços. Incube a mistura de células, fatores de crescimento e/ou agentes inibidores como antes, por 48 horas. Ao final do período de incubação, avalie o número de células viáveis nos poços utilizando os métodos descritos na parte escrita do protocolo.

Aqui são representados os resultados de um ensaio no qual o bioensaio VEGF-R2 EPoR BAF3 é utilizado para quantificar a atividade das três ligandinas humanas recumbentes com especificidade para VEGF-R2, VEGF-A165, VEGF-C e VEGF-D. A atividade foi quantificada na presença de bevacizumabe, um anticorpo monoclonal inibitório contra VEGF-A165, ou na presença de trastuzumabe, um anticorpo não neutralizante.

Os dados foram normalizados em relação à resposta ao VEGF-A165 isolado. Como esperado, o bevacizumabe bloqueou o efeito do VEGF-A165 no ensaio, mas não teve efeito sobre a atividade do VEGF-C e do VEGF-D. As células expostas à IL3 apresentaram viabilidade elevada.

Enquanto aqueles expostos a nenhum fator de crescimento adicional apresentam baixa viabilidade. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que há uma variedade de agentes reguladores em meios condicionados que precisam ser gerados previamente ao ensaio. Esta técnica abriu caminho para um ressurgimento na biologia vascular, virologia, oncologia e oftalmologia para explorar o papel do VEG-FM nas liginas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar as células para o bioensaio, realizar o bioensaio e conduzir as análises quantitativas ou semiquantitativas da atividade do ligante VEG-FM.